Determinazione del ruolo della nutrizione nell'invecchiamento cutaneo

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Astratto:L'effetto della dieta sull'invecchiamento della pelle è diventato un argomento di ricerca interessante. Precedenti studi si sono concentrati principalmente sugli effetti benefici dei peptidi di collagene derivati ​​da organismi marini sulla pelle invecchiata quando somministrati per via orale, mentre gli effetti benefici dei peptidi di collagene derivati ​​dal pollame sulla pelle invecchiata sono stati riportati raramente. In questo studio, i peptidi di collagene sono stati preparati da ossa di pollo mediante idrolisi enzimatica e sono stati studiati l'effetto e il meccanismo d'azione dei peptidi di collagene somministrati per via orale sull'alleviare l'invecchiamento cutaneo indotto dai raggi UV combinati con D-galattosio. I risultati hanno mostrato che il collagene di ossa di pollo aveva caratteristiche tipiche del collagene e i peptidi di collagene di ossa di pollo (CP) erano principalmente piccoli peptidi molecolari con un peso molecolare di<3000 da.="" in="" vivo="" experiments="" showed="" that="" cps="" had="" a="" significant="" relieving="" effect="" on="" aging="" skin,="" indicated="" by="" the="" changes="" in="" the="" compostion="" and="" structure="" of="" the="" aging="" skin,="" improvement="" of="" skin="" antioxidant="" level,="" and="" inhibition="" of="" inflammation;="" the="" relieving="" effect="" was="" positively="" correlated="" with="" the="" dose="" of="" cps.="" further="" investigation="" showed="" that="" cps="" first="" reduce="" the="" level="" of="" skin="" oxidation,inhibit="" the="" expression="" of="" the="" key="" transcription="" factor="" ap-1(c-jun="" and="" c-fos),="" then="" activate="" the="" tgf-β/smad="" signaling="" pathway="" to="" promote="" collagen="" synthesis,="" inhibit="" the="" expression="" of="" mmp-1/3="" to="" inhibit="" collagen="" degradation,and="" inhibit="" skin="" inflammation="" to="" alleviate="" skin="" aging="" in="" mice.="" moreover,="" the="" skin="" transcriptome="" found="" that="" lysosomes="" activated="" after="" oral="" administration="" of="" cps="" may="" be="" an="" important="" pathway="" for="" cps="" in="" anti-skin="" aging,="" and="" is="" worthy="" of="" further="" research.="" these="" results="" suggested="" that="" cps="" might="" be="" used="" as="" a="" functional="" anti-aging="" nutritional="">

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Parole chiave:peptidi di collagene; anti età; trascrittoma cutaneo;sintesi del collagene;lisosomi

1. Introduzione

L'era della salute, seguire accuratamente una dieta sana, determinare il ruolo della nutrizione nell'invecchiamento cutaneo e decidere cosa mangiare per mantenere la pelle giovane e sana sono problemi difficili. La pelle è l'organo più grande del corpo, composto dall'epidermide, dal derma e dallo strato sottocutaneo. Agisce come una barriera per proteggere il corpo dai fattori esterni e svolge anche un ruolo nella salute e nella bellezza[1. L'invecchiamento cutaneo è un processo complesso, che si divide in invecchiamento cronologico e fotoinvecchiamento ed è influenzato da fattori sia interni che esterni.stelo di cistancheLe principali caratteristiche includono l'accumulo di danno macromolecolare nella cellula, il declino della funzione delle cellule staminali (favorendo il rinnovamento dei tessuti) e la graduale perdita dell'integrità fisica della pelle [2]. I principali meccanismi molecolari che causano l'invecchiamento cutaneo includono principalmente lo stress ossidativo, l'accorciamento dei telomeri, il danno al DNA, la mutazione genetica, la regolazione del microRNA, l'accumulo avanzato del prodotto finale della glicazione e l'invecchiamento infiammato 3]. Il foto-invecchiamento è l'iperplasia epidermica cutanea, l'essiccamento e la degradazione della matrice extracellulare indotta dalle radiazioni ultraviolette. La causa principale del fotoinvecchiamento sono le specie reattive dell'ossigeno (ROS) generate dalle radiazioni ultraviolette che mediano l'espressione delle metalloproteinasi della matrice (MMP) e del pro-collagene di tipo I attraverso vie di segnale come la segnalazione della protein chinasi attivata dal mitogeno (MAPK). via, portando così alla degradazione della matrice extracellulare (ECM) nella pelle e all'apoptosi dei fibroblasti [4]. Negli ultimi anni, il mantenimento della salute della pelle e il ritardo dell'invecchiamento sono diventati popolari e la ricerca di ingredienti naturali come peptidi bioattivi e polifenoli con funzioni antiossidanti e antietà è diventata un punto di riferimento della ricerca [5].

Cistanche può antietà

Tuttavia, il collagene ha un grande peso molecolare ed è difficile da assorbire e utilizzare direttamente, mentre i piccoli peptidi di collagene molecolare dopo l'idrolisi del collagene hanno un'attività biologica più forte e un alto tasso di assorbimento [6]. Nel frattempo, l'ampia applicazione del collagene negli alimenti, nella medicina, nell'ingegneria dei tessuti, nei cosmetici e in altri campi ha reso i peptidi di collagene con un peso molecolare inferiore, una maggiore efficienza di assorbimento e una maggiore attività biologica un nuovo favorito negli alimenti funzionali e nella ricerca medica [{{1 }}]. I peptidi di collagene sono piccoli e contengono 2-20 residui di amminoacidi ottenuti dopo l'idrolisi del collagene. Sono utilizzati come integratore alimentare per il trattamento dell'invecchiamento cutaneo grazie alle loro potenziali funzioni antinfiammatorie e antiossidanti e di regolazione immunitaria e agli effetti dell'antiossidazione e della proliferazione sui fibroblasti cutanei [10].

Dopo la somministrazione orale, i peptidi di collagene vengono assorbiti sotto forma di piccoli peptidi e trasportati rapidamente nel sangue e, infine, nei reni, nella pelle, nelle articolazioni e in altri tessuti per essere immagazzinati e utilizzati. Dopo 14 giorni, i livelli di radioattività sono rimasti elevati nella pelle dei topi che erano stati sottoposti a sonda gastrica con peptidi di collagene marcati con C14-.cistance tubulosa benefici ed effetti collateraliI peptidi di collagene possono essere quasi completamente assorbiti e utilizzati dall'organismo, mentre il tasso di assorbimento e utilizzo del collagene è solo del 50-60 percento [6,11-13]. Negli ultimi anni, è stato ampiamente riportato che gli idrolizzati di collagene dalla pelle di pesce, squame di pesce, osso di mucca, pelle di mucca e pelle di maiale hanno effetti benefici sull'alleviamento dell'invecchiamento cutaneo e hanno ricevuto notevole attenzione dai ricercatori. Ad esempio, i peptidi di collagene isolati dalla pelle della carpa argentata promuovono la sintesi di pro-collagene e inibiscono l'espressione delle proteine ​​AP-1, MMP-1 e MMP{6}} attivando la via TGF-/Smad per prevenire la degradazione del collagene e riparare le cellule della pelle fotoinvecchiate [14]. La somministrazione orale di peptidi di collagene bovino può migliorare il rilassamento cutaneo, aumentare il contenuto di collagene e l'attività degli enzimi antiossidanti, riparare la fibra di collagene e normalizzare il rapporto di collagene della pelle nei topi che invecchiano [15]. Tuttavia, i peptidi di collagene provenienti da fonti diverse hanno effetti diversi. La quantità e la struttura dei peptidi altamente attivi nel sangue dopo la somministrazione orale di peptidi di collagene dipendono dalla fonte di collagene [10]. L'effetto protettivo del peptide di collagene estratto dalla pelle delle galline contro le lesioni dei fibroblasti indotti dai raggi UVA era superiore a quello del peptide di collagene estratto dalla pelle di maiale, mucca o tilapia e il suo effetto era equivalente al tripeptide derivato dal collagene (Gly-Pro -Hyp)[16].

Le credenze religiose e le malattie (come il morbo della mucca pazza) hanno portato le persone a cambiare gradualmente la direzione dello sviluppo del collagene e dei suoi prodotti dai mammiferi terrestri al pollame e agli organismi marini|17I.Come principale sottoprodotto della lavorazione del pollame, il pollo l'osso è una promettente fonte di prodotti di collagene. Non solo riduce lo spreco di risorse e l'inquinamento ambientale, ma consente anche l'utilizzo efficiente dei sottoprodotti. Pertanto, in questo studio, abbiamo utilizzato peptidi di collagene di ossa di pollo come materie prime, con topi nudi trattati con D-galattosio e UV per indurre l'invecchiamento cutaneo, come modello per valutare l'effetto della somministrazione orale del peptide di collagene sull'alleviare l'invecchiamento cutaneo in topi e determinare il meccanismo rilevante.

2. Materiali e metodi

2.1.Materiali, prodotti chimici e animali

Gli allevamenti di polli della Yunnan Agricultural University (Kunming, Cina) fornivano le galline esaurite, che venivano separate, essiccate e schiacciate per ottenere la farina di ossa di pollo. I kit di superossido dismutasi (SOD), catalasi (CAT) e glutatione perossidasi (GSH-PX) sono stati acquistati da Soleibao Biotechnology Co., Ltd. (Pechino, Cina). Idrossiprolina (HYP), interleuchina-1 (IL-1x), metalloproteinasi della matrice-1/3 (MMP-1/3), pro-collagene di tipo I e acido ialuronico (HA) kit di test immunoenzimatici (ELISA) sono stati acquistati dal Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Cina). Topi glabri femmine sani BALB/C (18±2 g, sei settimane) sono stati acquistati da Nanijing Junke Bioengineering Corporation, Ltd. (Nanchino, Cina) con numero di autorizzazione: SCXK(SU)2016-0010.estratto di cistanche tubulosaLa pepsina e la papaina sono state acquistate da Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd. (Shanghai, Cina) e altre sostanze chimiche erano di grado analitico. Tutti i topi sono stati maneggiati secondo i regolamenti del Laboratorio per la cura degli animali della provincia dello Yunnan e approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali della Yunnan Agricultural University (ID di approvazione: YAUACUC01).

2.2. Preparazione di collagene e composizione di amminoacidi

L'estrazione e la composizione aminoacidica del collagene osseo di pollo hanno seguito il metodo descritto da Liuet al. [18]con lievi modifiche. La polvere di ossa di pollo è stata mescolata e imbevuta di 0.{5}}5 M NaOH, 10 percento di n-esano e 0.25 M EDTA soluzione (pH7,5 ) con un rapporto di 1/10 (m/o). Ad ogni passaggio, il campione è stato trattato per 36 ore e la soluzione di ammollo è stata cambiata ogni 6 ore per gonfiare la polvere d'osso, rimuovere le proteine ​​non collagene, il grasso e i minerali dalla polvere d'osso. Il campione è stato lavato con acqua pura fino a neutralità dopo ogni passaggio. La farina di ossa di pollo pretrattata è stata miscelata con acido acetico glaciale 0,5 M contenente lo 0,1 percento (p/v) di pepsina in un rapporto solido/liquido di 1:10 (p/v) e agitata continuamente ed estratta a 4 gradi per 48 ore È stato quindi filtrato e il filtrato è stato centrifugato a 15,{26}}×g per 15 minuti a 4 gradi . Il pH del supernatante è stato regolato a 7.{30}}.8 con una soluzione di NaOH e NaCl è stato aggiunto a una concentrazione finale di 1,5 M. Dopo che la miscela è stata mantenuta indisturbata per 12 ore a 4 gradi per la salatura, il collagene il precipitato è stato centrifugato a 15,{37}}×g per 15 minuti a 4 gradi, quindi sciolto con acido acetico 0,5 M, dializzato in acqua pura, liofilizzato e il prodotto finito era collagene di ossa di pollo.

La composizione aminoacidica del collagene osseo di pollo è stata determinata dall'analizzatore automatico di aminoacidi Sykam S433D (Monaco, Germania). Una certa quantità di campione di collagene da testare è stata prelevata in una provetta sigillata, addizionata con 10 ml6 M HCl e idrolizzata a 110°C per 24 h. L'idrolizzato è stato concentrato mediante soffiaggio di azoto e ridisciolto in 20 mL di tampone di acido citrico. Dopo la microfiltrazione con una membrana microporosa da 0,22 um, sono stati prelevati 20 μL di idrolizzato per l'analisi dello spettro degli amminoacidi. Il contenuto di aminoacidi nel campione è stato espresso in percentuale.

2.3. Preparazione e distribuzione del peso molecolare dei peptidi di collagene (CP)

Secondo i risultati del nostro precedente processo di ottimizzazione, i CP sono stati preparati utilizzando la papaina con un rapporto enzima-substrato di 1:40 (rapporto di massa). Dopo aver regolato il pH a 7 e l'idrolisi enzimatica a 63 gradi per 5 ore, l'enzima è stato inattivato in un bagno d'acqua bollente per 15 minuti. L'enzima idrolizzato è stato dissalato e liofilizzato, ridisciolto in una soluzione di acido formico allo 0,1% e centrifugato per ottenere il supernatante. Spettrometro di massa ad alta risoluzione AQ Exactive HF Orbitrap-QE-HF (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA), dotato di ionizzazione elettrospray (ESI, è stato utilizzato per analizzare l'idrolizzato di collagene nella modalità di scansione completa di 350-1800 m /z e i risultati sono stati recuperati e analizzati utilizzando il software Proteome Discoverer 2.1.

2.4.Test sugli animali

Topi glabri femmine BALB/C (n{{0}}) sono stati tenuti in una stanza in condizioni controllate di temperatura (24±1 grado), umidità (60 ±5 percento) e un Ciclo giorno-notte di 12 ore per una settimana. Hanno avuto accesso ad libitum a cibo e acqua. Dopo una settimana di adattamento, i topi sono stati divisi casualmente nei seguenti cinque gruppi (n=11 per gruppo):(i). Gruppo normale (N): UV non esposto; somministrazione orale di 0,4 ml di soluzione fisiologica al giorno. (ii). Gruppo di modelli (M): UVesposto più D-galattosio (0,2 mL); somministrazione orale di 0,4 ml di soluzione fisiologica al giorno.

(io). Gruppo di peptidi di collagene a basso dosaggio (LCP): esposto ai raggi UV più D-galattosio (0, 2 ml); orale

somministrazione di 0,4 ml di CP (dose: 200 mg: kg-1 di peso corporeo) al giorno.

(iv). Gruppo di peptidi di collagene a dose media (MCP): esposto ai raggi UV più D-galattosio; orale

somministrazione di 0,4 ml di CP (dose: 500 mg·kg-1 di peso corporeo) al giorno.

(v). Gruppo di peptidi di collagene ad alto dosaggio (HCP): UVesposto più D-galattosio; amministrazione orale

razione di 0,4 ml di CP (dose: 1000 mg kg-1 di peso corporeo) al giorno.

Il trattamento con D-galattosio è stato eseguito mediante iniezione sottocutanea di 0,2 ml di soluzione di D-galattosio all'10 percento nella parte posteriore del collo del topo (dose:1.0g/ kg-1di peso corporeo) al giorno. L'irradiazione UV è stata eseguita con un LAMIP -340 UVA da 40 W (pannello O, Cleveland, USA, lunghezza d'onda di picco: 340 nm), la distanza tra la lampada e la parte posteriore dei topi era di 30 cm (230 m J/cm -), e l'irradiazione è durata 30 minuti ogni giorno per sette settimane (49 giorni). L'intensità della radiazione è stata misurata da un radiometro UVA365- (Xinbao Keyi Electronic Technology Co., Ltd., Xi'an, Cina). Un'ora dopo il trattamento con D-galattosio e UV, ai topi sono stati somministrati 0,4 ml di CP per via orale ogni giorno. Dopo l'ultima irradiazione, i topi sono stati anestetizzati, pesati e i tessuti sono stati campionati per la successiva analisi.

2.5. Umidità della pelle, indice viscerale e aumento di peso corporeo

L'umidità della pelle è stata determinata dalla norma ISO 1442 e l'indice viscerale è stato calcolato utilizzando la seguente equazione: indice viscerale(g/kg)= peso viscerale/peso corporeo.

2.6. Stress ossidativo, HA e contenuto HYP della pelle

I campioni di pelle sono stati omogeneizzati con una quantità nove volte superiore di soluzione fisiologica (p/p) in un bagno di ghiaccio con un omogeneizzatore tissutale (TGrinder OSE-Y30, Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd., Pechino, Cina), e quindi centrifugati a 2000 ×g e 4 gradi per 10 min. Le attività della superossido dismutasi (SOD), catalasi (CAT) e glutatione perossidasi (GSH-PX) e il contenuto di acido ialuronico (HA) e idrossiprolina (HYP) nel surnatante raccolto sono stati determinati secondo il metodo descritto nel istruzioni corrispondenti ai rispettivi kit.

2.7.Istologico cutaneo

I campioni di pelle di topo sono stati fissati in una soluzione di paraformaldeide al 4% per 24 ore, disidratati, incorporati in paraffina e affettati. Le sezioni cutanee sono state colorate con ematossilina ed eosina (HE) e osservate con un microscopio a fluorescenza diretta ECLIPSE CI-E (Nikon, Giappone). Lo spessore dell'epidermide e del derma della pelle è stato valutato utilizzando il software Halcon 13.{5}}.1.1 (MVTec, Monaco, Germania).

2.8. Sequenziamento del trascrittoma cutaneo

2.8.1. Estrazione dell'RNA, costruzione di librerie e sequenziamento del trascrittoma

L'RNA totale è stato estratto dalla pelle dei topi utilizzando il RNeasy Mini Kit (Tiangen Bio-chemical Technology Co., Ltd., Pechino, Cina) secondo le istruzioni del produttore. La purezza e la concentrazione dell'RNA sono state controllate utilizzando lo spettrofotometro kaiaoK5500(Kaiao, Pechino, Cina); L'integrità dell'RNA è stata valutata utilizzando l'RNA Nano 6000 Assay Kit e il sistema Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). L'analisi del sequenziamento trascrizionale di ciascun campione è stata eseguita da Biolinker Technology Company Limited (Kunming, Cina). In breve, il raggruppamento dei campioni con codice indice è stato eseguito su un sistema di generazione di cluster cBot utilizzando HiSeq PE Cluster Kit v4-cBot-HS(llu-mina) secondo le istruzioni del produttore. Dopo la generazione del cluster, le librerie sono state sequenziate su una piattaforma Ilumina e sono state generate letture paired-end a 150 bp.

2.8.2. Analisi bioinformatiche dei dati di sequenziamento dell'RNA

L'analisi di arricchimento di Gene Ontology (GO) e Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) di geni differenzialmente espressi (DEG) è stata eseguita utilizzando il pacchetto dell'analizzatore di cluster del linguaggio R. Quando il valore p era inferiore a 0.05, gli elementi e i percorsi arricchiti da GO e KEGG sono stati considerati significativi.

2.8.3. Reazione a catena della trascrittasi inversa-polimerasi (qRT-PCR)

La QRT-PCR è stata eseguita come descritto in precedenza [19].

2.9. macchia occidentale

Secondo il metodo descritto da Park et al. [20], l'analisi Western blot (WB) è stata eseguita per quantificare l'espressione delle proteine ​​legate all'invecchiamento della pelle nei topi. La concentrazione proteica del lisato cutaneo in ciascun gruppo di trattamento è stata quantificata utilizzando il kit BCA, separato da SDS-PAGE (gel di acrilammide al 10%), trasferito su una membrana PVDF, bloccato con latte scremato al 5% e incubato con una quantità adeguata di primario anticorpi (TGF-b1, c-Fos, c-Jun, Samd2/3 e -actin) a 4 gradi durante la notte. Dopo il lavaggio con TBST, i campioni sono stati miscelati con anticorpi secondari e incubati a temperatura ambiente per 1 ora.recensioni di cistanche tubulosaIl ChemiDoc XRS plus gel imager a chemiluminescenza (BioRAD, Hercules, CA, USA) è stato utilizzato per rilevare proteine ​​specifiche. Il software Image] è stato utilizzato per quantificare l'espressione della proteina bersaglio in ciascun gruppo di trattamento e i risultati sono stati rappresentati dai valori di densità normalizzati alla proteina -actina.

2.10.ELISA

I livelli di espressione di MMP-1, MMP-3, pro-collagene di tipo I e IL-1 e nel liquido di lisi cutaneo sono stati determinati mediante test immunoenzimatico. Il test è stato condotto secondo le istruzioni fornite con il kit.

2.11.Analisi statistiche

Tutti i risultati sono stati analizzati utilizzando il software SPSS 21 (IBM Inc., Armonk, NY, USA) attraverso l'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA) e il test a intervalli multipli di Duncan, con il livello di significatività impostato su p<0.05. originpro="" 2017(originlab,="" northampton,="" ma,="" usa)was="" used="" to="" plot="" the="" data.="" all="" data="" were="" expressed="" as="" the="" mean="" ±="" standard="" deviation="">

3. Risultati e discussioni

3.1. Composizione aminoacidica del collagene

La composizione amminoacidica del collagene delle ossa di pollo è mostrata nella Tabella 1. Gly era l'amminoacido principale nei campioni, rappresentando quasi un terzo (27, {3}} percento) degli amminoacidi totali e Hyp era il aminoacido speciale nel collagene, che rappresenta il 9,83 percento. Le caratteristiche principali delle molecole di collagene erano le sequenze ripetute di Gly-XY e l'esclusiva struttura a tripla elica composta da tre catene. Gly rappresentava circa un terzo degli amminoacidi totali, X e Y erano spesso prolina e idrossiprolina, o potevano essere qualsiasi residuo [21]. La composizione amminoacidica del campione era simile a quella del collagene di ossa di pollo riportata in studi precedenti e aveva le caratteristiche tipiche del collagene [22].

3.2. Distribuzione del peso molecolare dei CP

Molecular weight distribution reflects the degree of collagen hydrolysis. The molecular weight of the CPs was mainly below 3000 Da (Figure 1), accounting for about 87.61%of all collagen hydrolysates, indicating that almost all of the CPs were small peptides. Many studies claim that collagen peptides with a lower molecular weight have better biological activity [23]. For example, Song et al. [24]. reported that lower molecular weight (200-1000 Da, 65%)silver carp skin collagen peptides repaired UV-induced aging skin in mice more effectively than similar peptides with a higher molecular weight(>1000 Da, 72 percento). Tuttavia, l'azienda tedesca Gelita ha dimostrato attraverso diversi studi clinici che l'effetto dei peptidi di collagene è determinato principalmente dal suo grado di corrispondenza con le proprietà dei peptidi di collagene dopo la degradazione del collagene umano, piuttosto che dal peso molecolare dei peptidi di collagene. Hanno scoperto che il prodotto VERISOL③ con un peso molecolare medio di 2000 Da ha l'effetto più stimolante sui fibroblasti cutanei, mentre il prodotto FortigelTM con un peso molecolare medio di 3000 Da ha un effetto speciale sulla riparazione della cartilagine [25-27].

3.3. Effetto dei CP orali sull'attenuazione dell'invecchiamento cutaneo

3.3.1. Peso corporeo e indice degli organi

L'indice di peso corporeo e l'indice di organi sono importanti e riflettono lo stato di salute dei topi. Il peso dei topi in ciascun gruppo è aumentato normalmente durante il periodo del test (Tabella 2). L'aumento di peso medio del gruppo M era inferiore a quello del gruppo N e quello dei gruppi di trattamento CP era superiore a quello del gruppo M, suggerendo che i CP non avevano effetti collaterali sui topi. In rapporti precedenti, la dose di topi trattati con peptide di collagene era per lo più compresa tra 100-1000 mg/kg p.c. · e la dose sicura di peptidi di collagene di tilapia ha raggiunto 4,07 g/kg p.c.·d [{{6} }]. Allo stesso modo, anche la crescita di topi invecchiati con la pelle dopo sonda gastrica con peptidi di collagene in scala di tilapia (dose: 500 e 1000 mg/kg·bw·d) è stata simile ai nostri risultati [29]. La milza svolge un ruolo importante nell'immunità umorale e cellulare, quindi l'indice della milza viene spesso utilizzato per valutare la funzione del sistema immunitario.cistanche Regno UnitoThe liver index was used to evaluate the toxicity of the tested sample. In these tests, the liver and spleen indices in the M group were lower than those in the N group, and both recovered after treatment with CPs, but there was no significant difference across the treatment groups (p >0.05). I risultati erano simili a quelli di studi precedenti [30], indicando che i CP sono sicuri e potrebbero leggermente migliorare l'immunità dei topi.

3.3.2.Composizione della pelle

Il trattamento UV e D-galattosio (gruppo M) ha ridotto significativamente il contenuto di umidità, HA e Hyp nella pelle, rispetto a quelli del gruppo N, rispettivamente del 13,36%, 24,08% e 15,83% (p.<0.05)(table 2).="" the="" contents="" of="" moisture,="" ha,="" and="" hyp="" in="" the="" skin="" were="" significantly="" higher="" in="" mice="" after="" the="" oral="" administration="" of="" cps="" compared="" to="" the="" contents="" of="" those="" in="" the="" mice="" of="" the="" m="" group=""><0.05). among="" the="" dose="" groups,="" the="" contents="" of="" the="" three="" skin="" components="" were="" significantly="" different="" between="" the="" lcp="" and="" hcp="" groups="" and="" were="" dependent="" on="" the="" dose="" of="" intake="" of="" cps.="" the="" hcp="" group="" had="" even="" higher="" contents="" than="" the="" n="" group,="" and="" ha="" and="" hyp="" were="" significantly="" different="" between="" the="" two="" groups="" (p=""><>

I cambiamenti nel contenuto di umidità della pelle provocano rughe e rilassamento cutaneo e sono influenzati da componenti della matrice come il collagene della pelle e l'HA[31]. L'idrossiprolina è un aminoacido stabile, ricco e speciale di collagene e il suo contenuto può riflettere indirettamente il contenuto di collagene nella pelle, nonché l'invecchiamento della pelle. Inoltre, l'HA, che è altamente espresso nella ECM cutanea, svolge un ruolo importante nel controllo dell'equilibrio idrico della pelle, della pressione osmotica, della ritenzione di umidità e dell'elasticità come sistema di accumulo dell'acqua e componente strutturale della pelle [32]. In questo studio, il contenuto di umidità, HYP e HA nella pelle è aumentato significativamente dopo l'assunzione di CP, il che potrebbe essere correlato alla promozione della sintesi di collagene e HA da parte dei CP. Inoltre, l'aumento di HYP e HA ha aumentato il contenuto di umidità.

3.3.3. Cambiamenti istologici della pelle

I cambiamenti istologici della pelle posteriore dei topi dopo sette settimane di trattamento continuo sono mostrati nella Figura 2. La pelle invecchiata del gruppo M ha mostrato le caratteristiche di superficie ruvida, epidermide ispessita, derma assottigliato e cellule sparse, rispetto alla pelle di il gruppo N. Tuttavia, la condizione dell'invecchiamento della pelle nei topi è migliorata dopo la somministrazione orale di CP, mantenendo una struttura liscia, ordinata e completa simile a quella dei topi del gruppo N. Pertanto, il derma cutaneo era significativamente più sottile e l'epidermide era significativamente più spessa nel gruppo M rispetto al gruppo N (p<0.05). the="" change="" in="" skin="" dermis="" and="" epidermal="" thickness="" was="" significantly="" better="" after="" treatment="" with=""><0.05), and="" the="" effect="" was="" more="" obvious="" with="" the="" increase="" in="" the="" dose="" of="" cps="" (figure="" 2).the="" effect="" of="" oral="" cps="" on="" the="" histological="" structure="" of="" aging="" skin="" was="" similar="" to="" that="" reported="" previously="" [4,28,31].="" the="" increase="" in="" the="" thickness="" of="" the="" epidermis="" might="" be="" an="" adaptive="" change="" to="" protect="" the="" skin="" from="" external="" stimuli,loss="" of="" skin="" moisture,="" and="" uv="" damage,="" possibly="" due="" to="" the="" increase="" in="" uv-activated="" epidermal="" growth="" factor="" receptor="" (egfr)="" that="" induces="" keratinocyte="" proliferation="" and="" epidermal="" hyperplasia[4].="" however,="" the="" mechanism="" by="" which="" oral="" cps="" alleviate="" the="" increase="" in="" epidermal="" thickness="" remains="" unclear.="" the="" dermis="" imparts="" elasticity="" and="" strength="" to="" the="" skin,="" and="" the="" degradation="" of="" ecm="" and="" the="" reduction="" in="" the="" ability="" to="" repair="" fibroblasts="" are="" the="" main="" causes="" of="" dermal="" thinning="" in="" aging="" skin.="" dermal="" thickness="" increased="" after="" the="" treatment="" with="" cps,="" which="" might="" be="" due="" to="" the="" removal="" of="" ros="" from="" the="" skin="" and="" inhibition="" of="" the="" increase="" of="" mmps="" by="" cps.="" this,="" in="" turn,="" inhibited="" the="" degradation="" of="" skin="" collagen="" and="" elastin="" (figure="" 3),="" the="" entry="" of="" cps="" in="" the="" skin,="" and="" their="" participation="" in="" the="" synthesis="" of="" collagen="" and="" ha="" [6],="" which="" was="" confirmed="" by="" the="" increase="" in="" the="" content="" of="" hyp="" and="" ha="" in="" the="" skin="" (table="">

3.3.4. Livelli antiossidanti e infiammatori della pelle

La determinazione dell'attività degli enzimi antiossidanti è il metodo più comunemente usato per valutare il livello di antiossidanti nell'organismo [28]. Come mostrato nella Figura 3, le attività di contenuto CAT, SOD, GSH-Px e MDA nel gruppo M erano significativamente inferiori a quelle del gruppo N (p<0.05). administering="" cps="" effectively="" inhibited="" the="" decrease="" of="" cat,="" sod,="" gsh-pxactivities,and="" the="" mda="" content="" in="" the="" skin="" of="" mice,="" compared="" to="" those="" in="" the="" mice="" skin="" of="" the="" m="" group,="" and="" was="" positively="" correlated="" with="" the="" dose="" of="" cps;="" there="" were="" significant="" differences="" among="" the="" different="" dose="" groups=""><0.05). when="" ros,="" accumulated="" by="" skin="" oxidative="" stress,="" exceed="" the="" antioxidant="" defense="" ability="" of="" the="" body,="" they="" destroy="" the="" ecm,="" which="" is="" the="" key="" cause="" of="" skin="" aging.="" ros="" can="" cause="" the="" oxidation="" of="" lipids="" and="" proteins="" in="" the="" skin,="" resulting="" in="" fibroblast="" degeneration="" and="" changes="" in="" the="" skin.="" ros="" activate="" the="" mapk="" signaling="" pathway="" and="" the="" ap-1="" protein="" to="" upregulate="" the="" expression="" of="" mmps="" and="" promote="" the="" degradation="" of="" matrixcollagen="" [21].="" although="" the="" antioxidant="" enzymes="" and="" antioxidants="" in="" the="" body="" can="" remove="" ros="" to="" protect="" the="" skin="" from="" damage,="" when="" the="" content="" of="" rosexceeds="" the="" defense="" (antioxidant)="" ability="" of="" the="" body="" or="" the="" body's="" defense="" ability="" declines,="" it="" causes="" oxidative="" stress="" and="" skin="">

Inoltre, la risposta infiammatoria cellulare causata da ROS contribuisce anche all'invecchiamento della pelle. Dopo il trattamento con UV e D-galattosio (gruppo M), il contenuto di IL-lo nella pelle dei topi è aumentato significativamente rispetto a quello del gruppo N (Figura 3D ), indicando che la pelle ha mostrato una risposta infiammatoria significativa (p<0.05). the="" cps="" significantly="" reduced="" the="" content="" of="" il-1α="" in="" the="" skin="" in="" a="" dose-dependent="" manner,="" compared="" to="" that="" in="" the="" skin="" of="" mice="" in="" the="" m="" group.="" there="" was="" a="" significant="" difference="" between="" hcps="" and="" lcps=""><0.05),indicating that="" cps="" alleviated="" skin="" inflammation.="" the'o,="" produced="" by="" ultraviolet="" irradiation="" stimulated="" the="" expression="" of="" mmp-1="" in="" dermal="" fibroblasts="" through="" the="" secretion="" of="" il-1α="" and="" il-6,="" thereby="" disrupting="" the="" ecm="" [33].="" therefore,="" this="" study="" suggested="" that="" cps="" significantly="" increased="" the="" activity="" of="" skin="" antioxidant="" enzymes="" and="" inhibited="" inflammatory="" responses,="" which="" might="" be="" important="" in="" delaying="" skin="" aging="" in="">

3.4. Meccanismo d'azione dei CP dietetici nell'alleviare l'invecchiamento cutaneo

3.4.1. Analisi e Validazione dei Dati RNA-Seq

Analysis techniques, such as PCA, HCA, gene GOenrichment, and KEGG pathway enrichment were used to analyze the transcriptome data. Based on the PCA analysis (Figure 4A) and hierarchical clustering analysis (heat map)of 4303 differential genes with average channel strength greater than 100, the relative expression levels of total DEGs between the two treatment groups are shown to provide an overview of the changes in gene expression(Figure 4B). The M group and the HCP group were significantly separated, and the expression patterns of most DEGs in the M and HCP groups were opposite, indicating that there were significant differences between the mouse skin after HCP treatment and the M group (Figure 4A,B). Pairwise comparisons showed that after feeding HCPs,4303 genes were significantly expressed in the mice skin, including 1790 upregulated genes and 2513 downregulated genes(Foldchange>2,p<0.05)(figure 4c).among="" the="" sixgenes="" associated="" with="" skin="" aging="" quantified="" by="" qrt-pcr,="" five="" genes="" (including="" fos,="" jun,="" cxcll,and="" egr1)were="" downregulated,="" and="" one="" gene="" was="" upregulated="" (figure="" 4d),="" which="" was="" consistent="" with="" the="" overall="" trend="" of="" transcriptomic="" data.="" the="" rna="" expression="" levels="" of="" fos,="" jun,="" and="" cxcll="" were="" significantly="" upregulated="" in="" damaged="" skin="" compared="" to="" that="" in="" intact="" skin="" [34],="" and="" inhibition="" of="" egr1="" expression="" alleviated="" skin="" inflammation="" [35].="" these="" results="" reflected="" the="" reliability="" of="" transcriptome="" sequencing="" data,="" and="" oral="" cps="" effectively="" alleviated="" skin="">

L'analisi dell'arricchimento GO e l'analisi dell'arricchimento del database KEGG hanno fornito supporto per ulteriori indagini sulle funzioni biologiche dei DEG. L'analisi GO ha mostrato che i DEG erano significativamente arricchiti in processi biologici come la replicazione del DNA, la regolazione dell'emopoiesi, la regolazione dell'attività dell'idrolasi e la produzione di citochine; nei componenti cellulari, che includevano il vacuolo litico e il lisosoma, i geni contenenti collagene e altri geni correlati erano significativamente arricchiti; in termini di funzione molecolare, l'attività del recettore-ligando, l'attività delle citochine e altri geni correlati sono stati significativamente arricchiti (Figura 5). L'analisi dell'arricchimento KEGG delle prime 20 vie del segnale significativamente alterate dai DEG è mostrata nella Figura 5. Interazione del recettore delle citochine, lisosoma, interazione neuroattiva del ligando-recettore, ciclo cellulare, lupus eritematoso sistemico e via del TGF (p<05) were="" closely="" related="" to="" aging,="" especially="" cytokine-receptor="" interactions,="" lysosomes,="" and="" tgf-βsignaling.="" an="" important="" feature="" of="" cellular="" senescence="" is="" the="" accumulation="" of="" damaged="" or-ganelles="" and="" protein="" aggregates.="" lysosomes="" play="" an="" important="" role="" in="" degrading="" damaged="" organelles="" and="" protein="" aggregates="" in="" senescent="" cells="" [36].="" cytokine-receptor="" interaction="" is="" the="" main="" pathway="" of="" enrichment="" in="" the="" skin="" after="" being="" affected="" by="" various="" factors="" such="" as="" inflammation="" [37],="" sulfur="" mustard="" exposure="" [38],="" and="" terahertz="" pulse="" [39].="" cytokines,="" as="" small="" molecular="" proteins="" synthesized="" and="" secreted="" by="" various="" tissue="" cells,="" maintain="" skin="" homeostasis="" by="" controlling="" the="" balance="" between="" keratinocyte="" proliferation,="" diferentiation,="" and="" apoptosis="" through="" complex="" interactions="" with="" growth="" factors[40].="" the="" tgf-β="" signaling="" pathway="" is="" also="" important="" for="" regulating="" skin="" aging[14].="" gene="" functional="" enrichment="" anal-ysis="" showed="" that="" tgf-β="" was="" highly="" expressed="" during="" cytokine-receptor="" interaction="" and="" in="" the="" tgf-β="" signaling="" pathway.="" tgf-β="" is="" a="" major="" pro-fibrotic="" cytokine="" that="" regulates="" cell="" differentiation="" and="" proliferation="" while="" inducing="" extracellular="" matrix="" protein="" synthesis="" [41].="" therefore,="" we="" verified="" the="" tgf-β="" signaling="" pathway="" and="" some="">

3.4.2. Verifica del meccanismo d'azione dei CP nell'alleviare l'invecchiamento cutaneo

Per verificare il ruolo della via di segnalazione del TGF e dell'interazione del recettore delle citochine nell'alleviare l'invecchiamento cutaneo da parte dei CP orali, è stata eseguita l'analisi del WB per verificare il fattore di trascrizione e del TGF Smad2/3 nella via di segnalazione del TGF, nonché la chiave fattore di trascrizione AP-1 (c-Fos e c-Jun) che regola le citochine. I contenuti di MMP-1, MMP-3, pro-collagene di tipo I e IL-1 sono stati determinati mediante ELISA. I risultati dell'analisi WB hanno mostrato che l'espressione di TGF-, Smad2 e Smad3 nel gruppo M era significativamente inferiore a quella nel gruppo N(p<0.05). the="" expression="" levels="" of="" tgf-β="" and="" smad3="" were="" significantly="" higher="" in="" mice="" after="" the="" oral="" administration="" of="" cps="" compared="" to="" their="" levels="" in="" group="" m="" mice;="" additionally,="" smad2="" also="" increased=""><0.05), except="" for="" in="" the="" lcps="" in="" a="" dose-dependent="" manner(figure="" 6).="" on="" the="" contrary,="" the="" expression="" of="" c-fos="" and="" c-jun="" in="" the="" mgroup="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" n="" group.="" the="" expression="" of="" c-fos="" and="" c-jun="" in="" the="" cp="" group="" was="" significantly="" lower="" than="" that="" in="" the="" m="" group,="" except="" for="" the="" expression="" of="" c-jun="" in="" the="" lcp="" group=""><0.05), and="" the="" change="" was="" dose-dependent.="" these="" results="" indicated="" that="" the="" tgf-β="" signaling="" pathway="" was="" activated="" and="" ap-1="" was="" inhibited="" after="" feeding="">

La proteina AP-1 è un complesso dimerico delle proteine ​​della famiglia Jun e Fos ed è un importante regolatore dell'infiammazione cutanea e dell'espressione delle citochine. In generale, il complesso composto da c-Jun e c-Fos mostra la più alta attività trascrizionale nella pelle [41,A42]. I ROS prodotti nelle cellule della pelle che invecchiano prima attivano la proteina AP-1 e quindi regolano le citochine a valle (come IL-1), le MMP e la via di segnalazione del TGF attraverso la trascrizione e la traduzione, facilitando così l'invecchiamento cutaneo[43 ,44]. La reazione di segnalazione TGF-/Smad è una classica via di sintesi del collagene e il fattore di trascrizione Smad è al centro di questa via di trasduzione del segnale. Il TGF- innesca la fosforilazione e l'attivazione di Smad2 e Smad3 a valle legandosi al recettore, aumentando così la sintesi di COLI [14].

Inoltre, i risultati ELISA hanno mostrato che il contenuto di MP-1, MMP-3 e IL-1a nella pelle del gruppo M era significativamente superiore a quello del gruppo N e il contenuto di pro-collagene Typel era significativamente più basso (p<0.05). however,="" the="" contents="" of="" mmp-1,mmp-3,and="" il-1α(figure="" 3d)in="" the="" skin="" after="" oral="" administration="" of="" cps="" were="" significantly="" lower="" than="" those="" in="" the="" m="" group=""><0.05); type="" i="" pro-collagen="" increased="" significantly,="" and="" all="" the="" changes="" were="" dose-dependent="" with="" cps="" (figure="" 7).="" mps="" are="" involved="" in="" the="" decomposition="" of="" skin="" collagen,="" il-1o="" shows="" the="" level="" of="" inflammation="" of="" the="" skin,="" and="" type="" i="" pro-collagen="" reflects="" the="" synthesis="" of="" skin="" collagen.="" accumulating="" evidence="" suggests="" that="" the="" role="" of="" the="" jun/ap-1="" protein="" pathway="" has="" also="" been="" proposed="" to="" regulate="" skin="" inflammation="" [40].="" the="" elisa="" results="" showed="" that="" the="" combined="" treatment="" of="" uv="" and="" d-galactose="" caused="" skin="" collagen="" degradation,="" decreased="" collagen="" synthesis,="" and="" caused="" skin="" inflammation,="" leading="" to="" skin="" aging.="" however,="" these="" changes="" were="" reversed="" after="" the="" oral="" administration="" of="">

Oltre ai percorsi di cui sopra, in questo studio, i geni sovraregolati dopo il trattamento con CP sono stati significativamente arricchiti nella via del lisosoma, indicando che il trattamento con CP ha attivato il lisosoma nella pelle (Figura 5). Studi precedenti indicano che i lisosomi attivati ​​eliminano gli aggregati ed elevano l'attivazione delle cellule staminali neurali senescenti durante l'invecchiamento [45]. Oltre a questi, l'aumento della funzione del lisosoma può ridurre la concentrazione di ROS intracellulari per prevenire la dormienza cellulare. Allo stesso modo, qualsiasi diminuzione della funzione del lisosoma può aumentare la concentrazione intracellulare di ROS che alla fine promuove la dormienza cellulare. CP per alleviare l'invecchiamento cutaneo e continueremo a puntare per verificarlo.

Pertanto, questo studio ha dimostrato che i CP alimentari potrebbero alleviare l'invecchiamento cutaneo indotto da UV e D-galattosio in modo dose-dipendente. I CP alleviano l'invecchiamento cutaneo abbassando il livello di ossidazione cutanea, inibendo l'espressione dei fattori di trascrizione chiave AP-1(c-Jun e c-Fos), attivando la via di segnalazione TGF-/Smad per promuovere la sintesi del collagene, inibendo l'espressione di MMP-1 e MMP-3 (che inibiscono la degradazione del collagene) e inibiscono l'infiammazione cutanea per alleviare l'invecchiamento cutaneo (Figura 8). Inoltre, i nostri risultati nel presente studio suggeriscono anche che il lisosoma attivato potrebbe essere un percorso importante per i CP per regolare l'invecchiamento cutaneo, che merita un'attenzione speciale.

4. Conclusioni

In sintesi, questo studio ha confermato che l'integrazione alimentare di peptidi di collagene con ossa di pollo potrebbe alleviare significativamente l'invecchiamento cutaneo indotto dalle radiazioni ultraviolette e dal D-galattosio attraverso molteplici vie, che includono la promozione della sintesi del pro-collagene, l'inibizione della degradazione del collagene, il miglioramento del livello di antiossidanti della pelle, e inibendo l'infiammazione; l'attenuazione era dose-dipendente con i CP. Un'indagine dettagliata ha mostrato che i CP prima riducono il livello di ossidazione della pelle, inibiscono l'espressione del fattore di trascrizione chiave AP-1(c-Jun e c-Fos) e quindi attivano la via di segnalazione TGF-/Smad per promuovere sintesi del collagene, inibiscono l'espressione di MMP-1 e MMP-3 per inibire la degradazione del collagene e inibiscono l'infiammazione cutanea per alleviare l'invecchiamento cutaneo nei topi. Inoltre, l'attivazione dei lisosomi può anche essere il percorso principale per i CP per alleviare l'invecchiamento cutaneo, che è degno di ricerca e verifica di follow-up. Questi risultati forniscono una base teorica per l'implementazione di peptidi di collagene per alleviare l'invecchiamento della pelle e ampliare la portata per l'utilizzo completo dei sottoprodotti di origine animale negli alimenti funzionali.

Questo articolo è estratto da Nutrients 2022, 14, 1622. https://doi.org/10.3390/nu14081622 https://www.mdpi.com/journal/nutrients