Differenze nella composizione e nell'efficacia medicinale delle materie prime e dei prodotti vinicoli trasformati in vapore da Cistanches Herba

Astratto:

ObiettivoConfrontare i cambiamenti nella composizione chimica e nell'efficacia medicinale del Roucongrong (Cistanches Herba) prima e dopo la lavorazione, in modo da chiarire il principio della stufatura con il vino.

Metodi La LC-MS è stata applicata per identificare i tipi di composizione chimica prima e dopo la preparazione di Cistanches Herba, combinata con analisi statistiche multivariate per trovare la disparità nei componenti prima e dopo la stufatura con vino. La differenza di efficacia è stata dimostrata dal modello di ratto con deficit di cortisone idrogenato e rene yang.

RisultatiSono stati identificati un totale di 45 componenti chimiciCampioni di Cistanche Herba; I composti hanno contribuito alle differenze traCistanche Herba e Cistanche Herba stufate nel vinoSonoEchinacoside, verbascoside, isoacteoside e tubuloside B; L'estratto di glicosidi feniletanoidi totali di Cistanches Herba ha un effetto migliore sul miglioramento del modello di ratto con carenza di yang renale rispetto a Cistanches Herba stufato nel vino. Conclusione La composizione della Cistanche cambia dopo essere stata stufata con il vino e l'effetto sulla carenza di yang nei reni è stato potenziato. Gli ingredienti della trasformazione di Cistanches Herbato stufato con vino Cistanches Herba possono essere principi attivi che rinforzano il rene e sostengono lo yang.

Parole chiave: Cistanches Herba; Cistanches Herba stufate nel vino;deficit di yang del rene;echinacoside;verbascoside; isoacteoside; tubuloside B

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È noto come "ginseng" ed è distribuito principalmente nella Mongolia Interna, Ningxia (Azuqi), Gansu (Changma), Xinjiang e altre regioni [1]. La Cistanche è di natura calda, di sapore dolce e salato, ed entra nei meridiani del rene e dell'intestino crasso. Ha l'effetto di nutrire il fegato e i reni, di apportare benefici all'essenza e al sangue, di inumidire l'intestino e di alleviare la stitichezza. Può essere utilizzato per la carenza di yang del rene, impotenza e infertilità, dolore alla vita e alle ginocchia, debolezza dei muscoli e delle ossa, intestino secco e costipazione [2]. La ricerca moderna mostra che gli steli carnosi con foglie in scaglie di Cistanche contengono principalmente una varietà di componenti chimici come glicosidi del feniletanolo, terpeni dell'etere ciclopentano e i loro glicosidi, lignani, zuccheri, ecc. [3] e hanno molteplici effetti farmacologici comeanti-invecchiamento,antiossidante,anti-demenza,anti-fatica, e inumidendo l'intestino e alleviando la stitichezza [4].

Dopo essere stato stufato con il vino, l'effetto tonificante dei reni e di potenziamento dello yang della Cistanche viene potenziato. Il principio di elaborazione non è stato spiegato chiaramente. Fan Yanan et al. [5-7] hanno studiato gli effetti di Cistanche sulla defecazione dei ratti, sulla funzione immunitaria, sui neurotrasmettitori enterici e sulle relative espressioni genetiche prima e dopo l'elaborazione. Da et al. ha utilizzato l'influenza dei glicosidi del feniletanolo prima e dopo la lavorazione per spiegarne il principio di lavorazione; Zhang Chao et al. [8] hanno utilizzato i cambiamenti nel contenuto dei glicosidi del feniletanolo prima e dopo la lavorazione per spiegare il principio della lavorazione; Zhang Shuyun et al. [9] hanno utilizzato i cambiamenti nel contenuto di betaina prima e dopo la lavorazione per spiegare l'effetto della lavorazione su Cistanche. La letteratura esistente sulla lavorazione delle Cistanche si concentra principalmente sulla farmacologia, e la ricerca sui componenti si concentra anche sui cambiamenti nel contenuto di componenti specifici, mancando uno studio sistematico delle differenze dei componenti. Questo esperimento ha utilizzato la tecnologia della cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS) combinata con l'analisi statistica multivariata per identificare i componenti chimici della Cistanche, per trovare i marcatori di differenza tra la Cistanche cruda e i prodotti stufati con vino e per studiare la differenza nell'efficacia della Cistanche. Cistanche crude e prodotti in umido con vino attraverso un modello di ratto con deficit di yang renale indotto da idrocortisone, in modo da spiegare la base materiale diCistanche nel tonificare i reni e promuovere lo yange il principio di lavorazione delle Cistanche stufate al vino.

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1 Materiali

1.1 Strumenti

Spettrometro di massa ad alta risoluzione con trappola ionica tandem a campo elettrostatico Ultimate 3000 UPLC-LTQ Orbitrap XL (Thermo Fisher Scientific, USA), workstation Theraio Xcaliber; Bilancia elettronica BT125D 1/100000 (Sartorius Instrument System, Germania); Pulitore ad ultrasuoni CNC KQ500DE (Kunshan Ultrasonic Instrument Co., Ltd.); Dispersore ad alta velocità XHF-D (Guangzhou Hu Ruiming Instrument Co., Ltd.); Lettore di micropiastre Multiskan FC (Thermo Scientific); centrifuga ad alta velocità HC-3518 (Anhui Zhongke Zhongjia Scientific Instrument Co., Ltd.); Registratore multifunzionale dell'attività volontaria dei ratti BW-YLS-1B (Shanghai Ruanlong Technology Development Co., Ltd.).

1.2 Farmaci

Metanolo per spettrometria di massa (Fisher); acido formico di grado spettrometria di massa (frazione di massa 99%, Sigma Aldrich); acqua (acqua distillata Watson); Jinkui Shenqi Pills (fabbrica farmaceutica di Pechino Tongrentang Technology Development Co., Ltd., numero di lotto 1701653); sale sodico idrocortisone succinato (Tianjin Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd., numero di lotto 011705067); Il kit di superossido dismutasi (SOD) (numero di lotto 20170115) e il kit di malondialdeide (MDA) (numero di lotto 20170117) sono stati acquistati da Nanjing Jiancheng Biotechnology Co., Ltd.; il testosterone (T) e l'estradiolo (E2) sono stati determinati presso il Centro di ispezione qualità di Qingdao Kechuang, mentre la creatinina (CREA) e l'azoto ureico nel sangue (BUN) sono stati determinati presso il Centro di analisi e test dell'Università medica della Mongolia Interna.

1.3 Animali

100 ratti maschi SD, del peso di 180-200 g, sono stati acquistati dalla Xinglong Experimental Animal Farm nel distretto di Haidian, Pechino, numero di licenza: SCXK (Pechino) 2016-0003. Questo esperimento sugli animali è stato approvato dal Comitato Etico dell'Università di Medicina Cinese di Pechino, numero etico: BUCM-4-2022091301-3095.

1.4 Campioni

Sei lotti di Cistanche deserticola sono stati identificati come autentici dal professor Li Xiangri della Scuola di Medicina Cinese dell'Università di Medicina Cinese di Pechino, e derivavano dagli steli carnosi essiccati con foglie squamose della Cistanche deserticola YC Ma, una pianta della famiglia delle Orobanchaceae. Informazioni dettagliate sui campioni sono mostrate nella Tabella 1.

Tabella 1 Scheda informativa dei campioni di Cistanches Herba

2 metodi

2.1 Preparazione del campione

2.1.1 Preparazione delle materie prime Prendere la Cistanche deserticola pulita, ammorbidirla, tagliarla a fette spesse e asciugarla.

2.1.2 Preparazione di prodotti in umido con vino

Prendere 100 g di fette di Cistanche deserticola, aggiungere 30 ml di vino di riso, mescolare bene e cuocere a fuoco lento finché il vino non sarà assorbito. Stufarlo in acqua per 12 ore, tirarlo fuori, lasciarlo raffreddare leggermente e asciugarlo. Vedere la Figura 1 per i campioni di Cistanche deserticola cruda e di Cistanche deserticola stufata nel vino.

2.2 Studio sulla differenza dei componenti della Cistanche deserticola prima e dopo la stufatura nel vino

2.2.1 Preparazione della soluzione

Prendere circa {{0}},2 g di polvere campione secca (passata attraverso un setaccio a 65- maglie), pesare accuratamente, collocare in un matraccio tarato marrone da 50 ml, aggiungere 25 ml di metanolo al 50% soluzione acquosa, chiudere bene, pesare la massa, immergere per 30 minuti, trattare ad ultrasuoni per 40 minuti (potenza 250 W, frequenza 35 kHz), raffreddare, pesare nuovamente, aggiungere soluzione acquosa di metanolo al 50% per compensare la massa perduta, agitare bene, lasciare riposare, filtrare il surnatante attraverso una membrana filtrante microporosa da 0,22 μm e posizionare il filtrato in una bottiglia marrone per fase liquida per ottenere la soluzione.

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2.2.2 Condizioni cromatografiche

Colonna cromatografica Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18 (100 mm×2,1 mm, 1,7 μm), temperatura della colonna di 35 gradi; temperatura della camera del campione di 10 gradi, volume di iniezione del campione di 3 μL, metanolo (A)-0.1% soluzione acquosa di acido formico (B) come fase mobile, eluizione con gradiente: 0-4 min, 10%{ {13}}% di metanolo; 4-18 min, 26%-40% di metanolo; 18-24 min, 40%-100% di metanolo; 24-28 min, 100% metanolo. La portata del volume era di 0,3 ml/min e la lunghezza d'onda di rilevamento era di 330 nm.

2.2.3 Condizioni della spettrometria di massa

È stata utilizzata una sorgente di ionizzazione elettrospray (ESI), scansione in modalità ioni negativi, temperatura capillare di 350 gradi, portata in volume del gas della guaina era 30 arb, portata in volume del gas ausiliario era 10 arb, tensione di spruzzatura era 3

KV, tensione capillare era -35 V, tensione lente del tubo era -110 V, intervallo di scansione era m/z 100-1 000, sistema di raccolta dati era Xcalibur 2.1.

2.2.4 Analisi delle componenti principali (PCA)

Dopo aver ottenuto la matrice bidimensionale delle coppie di dati accurate sul tempo di ritenzione di massa, il pannello degli strumenti visualizzerà tutte le informazioni accurate sul tempo di ritenzione importate automaticamente e per l'analisi verrà utilizzato il metodo PCA del modulo statistico esteso.

2.2.5 Analisi discriminante dei minimi quadrati parziali ortogonali (OPLS-DA) LCMS combina l'elevata separazione della cromatografia liquida con l'elevata sensibilità della spettrometria di massa. I dati raccolti sono piuttosto grandi e per elaborarli è necessaria un'analisi statistica multivariata. OPLS-DA divide i dati in due gruppi e utilizza un modello statistico supervisionato per ottenere un gran numero di spettri ortogonalizzati, che mostrano chiaramente le differenze tra i due gruppi di campioni. Nel formato S-Plot della figura aggiuntiva, ciascun punto rappresenta una coppia di dati accurata del tempo di ritenzione di massa, l'asse X rappresenta la variabile, quanto più lontano è il punto dati dal punto zero, maggiore è il contributo del punto alla differenza del campione ; l'asse Y rappresenta la correlazione tra i campioni nello stesso gruppo campione, quanto più lontana è la coppia di dati accurati su massa e tempo di ritenzione dal punto zero, tanto più forte è la correlazione. Pertanto, le coppie di dati relativi al tempo di ritenzione accurati in termini di massa su entrambe le estremità della curva a forma di S rappresentano gli ioni caratteristici più affidabili di ciascun gruppo campione.

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2.2.6 Analisi della struttura tramite spettrometria di massa

Dopo aver ottenuto gli ioni caratteristici, la composizione degli elementi e la corrispondenza dei composti sono stati eseguiti calcolando la precisa massa molecolare relativa e combinando il database esistente e la letteratura pertinente per identificare i componenti differenziali.

2.3 Studio sulla differenza di efficacia prima e dopo la stufatura con vino

2.3.1 Preparazione dell'estratto di Cistanche deserticola

La Cistanche deserticola (numero di lotto 160901) e la corrispondente polvere di Cistanche deserticola stufata con vino sono state estratte secondo le condizioni di cui a "2.2.1", filtrate dopo trattamento ad ultrasuoni, ripetuto due volte, il filtrato è stato combinato, concentrato mediante distillazione sotto vuoto e congelata. essiccato.

2.3.2 Raggruppamento per esperimenti su animali e somministrazione di farmaci

Fig. 1 Cistanche Herba A e Cistanche Herba B stufate nel vino

(1) Raggruppamento: ai ratti è stato concesso libero accesso all'acqua e alla dieta. Dopo 1 settimana di alimentazione adattativa, sono stati divisi casualmente in 5 gruppi (Tabella 2), con 10 ratti in ciascun gruppo, vale a dire gruppo normale, gruppo modello, gruppo Cistanche deserticola cruda (PR), gruppo Cistanche deserticola stufata con vino (PW) e gruppo di controllo positivo Jinkui Shenqi Pill (JK). (2) Modellizzazione: ad eccezione del gruppo normale, agli altri quattro gruppi è stato iniettato idrocortisone sodio succinato per via intramuscolare, con una dose di 20 mg/kg, per 14 giorni consecutivi. Al gruppo normale è stata iniettata la stessa dose di soluzione salina normale. È stata osservata la condizione generale dei ratti in ciascun gruppo per determinare se mostravano sintomi come paura del freddo, preferenza per il caldo, arti freddi, urina chiara e lunga, schiena raggomitolata e arcuata, pelo opaco e disordinato e depressione mentale. Allo stesso tempo, sono stati misurati il ​​peso corporeo, il numero di attività spontanee, l'assunzione di cibo, l'assunzione di acqua, la produzione di urina e altri indicatori dei ratti di ciascun gruppo.

(3) Somministrazione: il dosaggio dei ratti è stato calcolato in base al dosaggio clinico di Jinkui Shenqi Pills e Cistanche deserticola. Il dosaggio di ciascun gruppo Cistanche deserticola era di 1,80 g/kg in termini di quantità di droga grezza. Il dosaggio specifico è mostrato nella Tabella 2. Ciascun estratto di Cistanche deserticola e Jinkui Shenqi Pills è stato preparato in soluzioni di una certa concentrazione con acqua deionizzata. La soluzione è stata somministrata per via intragastrica ogni giorno con un volume intragastrico di 10 ml/kg per 30 giorni consecutivi. Al gruppo normale e al gruppo modello è stato somministrato per via intragastrica un uguale volume di acqua deionizzata ogni giorno. Il peso corporeo è stato misurato settimanalmente e il volume intragastrico è stato aggiustato in base al peso corporeo dei ratti. Dopo la somministrazione, i ratti sono stati tenuti a digiuno per 12 ore. Dopo l'anestesia con pentobarbital, il sangue è stato raccolto dall'aorta addominale per il rilevamento dell'indice sierico. I reni, i testicoli, l'epididimo, le vescicole seminali e la prostata sono stati rimossi per il rilevamento dell'indice pertinente.