I modelli differenziali di mutazione VHL nell'RCC bilaterale a cellule chiare distinguono tra tumori primari indipendenti e malattia metastatica controlaterale

Obbiettivo

Valutare se i pazienti con carcinoma a cellule renali a cellule chiare bilaterali e multifocali (ccRCC) possono essere differenziati dall'analisi della mutazione VHL in casi che rappresentano più tumori primari indipendenti o un singolo tumore primario che si è diffuso ipsilateralmente e al rene controlaterale. La natura della multifocalità del cancro del rene al di fuori delle sindromi ereditarie conosciute è ancora poco conosciuta.

Materiali e metodi

Il DNA di più tumori per paziente è stato valutato per la mutazione del gene VHL somatico e l'ipermetilazione. Un sottogruppo di tumori con mutazioni VHL condivise è stato analizzato con test di sequenziamento mirati di nuova generazione.

Risultati

Questa coorte conteneva 5 pazienti con tumori multipli che dimostravano una mutazione VHL somatica condivisa coerente con la diffusione metastatica anche al rene controlaterale. In molti casi, ciò è stato confermato da ulteriori mutazioni somatiche condivise nei geni associati al ccRCC. Al contrario, i restanti 14 pazienti con tumori multipli hanno dimostrato alterazioni VHL uniche e non condivise in ogni tumore analizzato, coerenti con tumori renali insorgenti in modo indipendente. Nessuno di questi ultimi pazienti ha mostrato alcuna evidenza di diffusione locale o metastasi a distanza.

Conclusione

Lo spettro delle alterazioni VHL all'interno dei tumori ccRCC bilaterali e multifocali valutati da un singolo paziente può distinguere tra crescita tumorale multipla indipendente e metastasi. Ciò può essere eseguito utilizzando i test genetici clinici attualmente disponibili e migliorerà l'accuratezza della diagnosi e della prognosi del paziente, oltre a informare la gestione appropriata.

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introduzione

Il carcinoma a cellule renali a cellule chiare (ccRCC) è il tipo più comune di cancro del rene, rappresentando il 75% dei casi. La prognosi e la gestione dei pazienti con ccRCC dipendono dallo stadio clinico. Se la malattia viene rilevata precocemente ed è ancora localizzata all'interno del rene, la resezione chirurgica è associata a un tasso di sopravvivenza di 5-10-anni del 95%. Tuttavia, se il tumore si è diffuso localmente o sistemicamente, i tassi di sopravvivenza per 5-anni scendono rispettivamente al 67% o al 12%. L'RCC a cellule chiare è più spesso caratterizzato dalla perdita biallelica del gene oncosoppressore von-Hippel Lindau, VHL. Meccanicisticamente, ciò si ottiene con la perdita di una copia del cromosoma 3p, inclusa la regione che codifica VHL, in combinazione con la mutazione o l'ipermetilazione del promotore dell'altra copia di VHL. Le alterazioni somatiche del gene VHL sono osservate in circa il 90% dei ccRCC sporadici, con mutazioni geniche osservate in oltre l'80% dei ccRCC e l'ipermetilazione del promotore dell'isola CpG osservata in circa l'8% dei ccRCC.

Mentre nella maggior parte dei casi sporadici di ccRCC, c'è solo una singola lesione in un rene, una frazione presenta lesioni multiple in uno o entrambi i reni. Questi pazienti presentano ccRCC multifocale bilaterale (BMF) e la natura di questi tumori multipli può influenzare la diagnosi e la gestione del paziente. La presentazione potrebbe rappresentare un singolo tumore primario che si è diffuso all'interno del rene omolaterale o che ha metastatizzato al rene controlaterale. Diversi studi hanno esaminato i casi di ccRCC multifocale confrontando il grado di perdita di 3p o lo spettro delle alterazioni cromosomiche tra i tumori all'interno dello stesso paziente per dimostrare che condividono un'origine clonale comune coerente con la diffusione metastatica o che ciascun tumore rappresenta un evento insorto in modo indipendente . Questa suscettibilità potrebbe essere indotta da un effetto ambientale, come l'esposizione al tricloroetilene (TCE), oa causa di un'alterazione genetica germinale. Una causa nota di carcinoma renale multifocale bilaterale è la mutazione germinale di un gene di suscettibilità RCC, come VHL, MET, BAP1 o FLCN, associata a una sindrome di predisposizione tumorale ereditaria. La più comune di queste è la malattia di von Hippel-Lindau (VHL), causata dall'alterazione germinale del gene VHL, che determina una predisposizione al ccRCC multifocale bilaterale. Mentre alcuni pazienti con BMF ccRCC avranno la sindrome VHL, molti pazienti con malattia bilaterale multifocale non avranno una sindrome di suscettibilità RCC diagnosticata.

Valutare la differenza tra malattia metastatica o insorta in modo indipendente è possibile mediante l'analisi genetica dei tumori per identificare alterazioni genetiche condivise comuni, nel caso di metastasi, o cambiamenti genetici vari e disparati nel caso di eventi indipendenti. Distinguere tra queste 2 presentazioni cliniche è fondamentale per la gestione appropriata del paziente. Se si è verificata la metastasi, molto probabilmente il paziente sarebbe trattato per malattia sistemica. Al contrario, se tutti i tumori fossero eventi multipli indipendenti all'interno del/i rene/i, il paziente verrebbe probabilmente trattato per la malattia localizzata e sarebbe indagato per le malattie genetiche germinali con lo screening dei membri della famiglia potenzialmente a rischio.

In questo studio, abbiamo utilizzato l'analisi della mutazione del gene VHL nel ccRCC come marcatore genetico per confrontare i tumori all'interno di ciascun paziente in una coorte di pazienti con ccRCC multifocale bilaterale che non presentavano alcuna alterazione genetica germinale nota. Sono state identificate due popolazioni di pazienti: quelle con tumori a insorgenza indipendente e quelle con metastasi al rene controlaterale.

Effetti cistanche

Materiali e metodi

1. Pazienti

I pazienti sono stati visitati presso l'Urologic Oncology Branch (UOB) del National Cancer Institute (NCI), il National Institutes of Health (NIH) per la valutazione clinica. I pazienti sono stati considerati avere una storia familiare se avevano almeno un parente di primo o secondo grado con una storia di RCC a cellule chiare e un'insorgenza precoce se erano stati diagnosticati all'età di 46 anni o prima. Questo studio è stato approvato dall'Institutional Review Board del National Cancer Institute e tutti i pazienti hanno fornito il consenso informato scritto sui protocolli della Urologic Oncology Branch. A tutti i pazienti è stato assegnato un numero di 6-cifre deidentificato assegnato dal laboratorio per il riferimento interno.

2. PCR e sequenziamento del DNA

Il DNA è stato estratto dal sangue e dal tessuto tumorale utilizzando i kit di purificazione del DNA del sangue e dei tessuti Promega Maxwell 16 (Promega, WI,). Il sequenziamento del DNA è stato eseguito mediante PCR utilizzando un Qiagen Taq PCR Core Kit (Qiagen, MD) secondo le specifiche del produttore, seguito dal sequenziamento bidirezionale utilizzando il kit di sequenziamento del ciclo Big Dye Terminator v.1.1 (Applied Biosystems, CA) secondo le specifiche del produttore ed eseguito su un ABI 3130xl o 3730 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, CA). Il sequenziamento di Sanger è stato condotto presso il CCR Genomics Core presso il National Cancer Institute, NIH, Bethesda, MD 20892. Le sequenze forward e reverse sono state valutate utilizzando Sequencher 5.0.1 (Genecodes, MI).

3. Analisi della metilazione del DNA

I DNA sono stati sottoposti a trattamento con bisolfito utilizzando un kit Qiagen EpiTect Bisulfite (Qiagen, MD) secondo le specifiche del produttore. Sono state progettate due coppie di primer in grado di eseguire l'annealing al DNA sia metilato che non metilato/convertito con bisolfito in prossimità del promotore VHL. La PCR è stata eseguita come sopra con i primer esterni, seguita da un secondo giro di PCR con i primer interni, e i prodotti sono stati sottoposti a sequenziamento bidirezionale come sopra.

4. Analisi Oncomine e TruSight Oncology 500

Tumori selezionati provenienti da interventi chirurgici clinicamente indicati sono stati scelti per l'analisi con Oncomine Comprehensive Assay v3 (ThermoFisher, MA) o successivo, TruSight Oncology 500 (Illumina, CA), test di sequenziamento di nuova generazione in grado di rilevare variazioni di singoli nucleotidi, variazioni del numero di copie, fusioni geniche e indel rispettivamente da 161 a 523 geni cancer driver. I campioni fissati in formalina e inclusi in paraffina sono stati elaborati dalla sezione di diagnostica molecolare del laboratorio di patologia dell'NCI.

Cistanche standardizzate

Discussione

La capacità di caratterizzare meglio i pazienti con tumori renali multifocali bilaterali consentirà una migliore gestione del paziente e potrebbe portare a nuove conoscenze sulla natura genetica del carcinoma renale a cellule chiare. In generale, si sa relativamente poco sull'evoluzione del ccRCC multifocale bilaterale. La frequenza di RCC bilaterale e/o multifocale alla presentazione o entro un anno dalla scoperta iniziale del tumore è relativamente bassa e la frequenza riportata varia notevolmente da 0,8% a 5,4%. Sono necessari ulteriori studi su coorti più ampie con criteri diagnostici universali per accertare l'esatta frequenza di BMF ccRCC. Wiklund et al hanno riferito che il BMF RCC è più comune nei pazienti più giovani e Syed et al hanno dimostrato una maggiore incidenza con un follow-up più lungo. Alcuni studi hanno indagato se l'RCC multifocale rappresenti metastasi locali o eventi che si verificano indipendentemente confrontando il grado di perdita 3p o lo spettro delle alterazioni cromosomiche tra i tumori all'interno dello stesso paziente. Miyake et al e Junker et al hanno entrambi mostrato modelli condivisi di perdita del cromosoma 3p o alterazione cromosomica tra tumori nello stesso paziente coerenti con la diffusione metastatica, mentre Ji et al hanno mostrato diversi gradi di perdita 3p tra i tumori di 2 pazienti diversi coerenti con insorgenza indipendente tumori in entrambi i casi. Alcuni case report mostrano evidenza di diffusione metastatica da 1 rene al rene controlaterale, al surrene o alla regione renale.

Nel presente studio, tutti i pazienti hanno sviluppato tumori in entrambi i reni. La malattia metacrona era più comune (4/5; 80 percento) nel gruppo che mostrava metastasi controlaterali rispetto a quelli in cui i tumori crescevano indipendentemente (3/14; 21 percento), ma in entrambe le coorti è stata osservata sia la malattia controlaterale sincrona che quella metacrona . L'analisi del modello di mutazione VHL tra i tumori di ciascun paziente ha consentito di designare tutti i pazienti come affetti da malattia metastatica o tumori renali bilaterali localizzati che potrebbero essere insorti in modo indipendente. I pazienti con malattia metastatica condividevano un'alterazione VHL comune tra tutti i tumori, mentre i pazienti con tumori renali a insorgenza indipendente presentavano alterazioni VHL diverse in diversi tumori.

I pazienti che hanno dimostrato una mutazione VHL condivisa in più tumori renali potrebbero derivare da mutazioni VHL del mosaicismo germinale piuttosto che da metastasi. In questo caso, la mutazione germinale può essere presente solo nelle cellule renali, o anche in una frazione delle cellule renali, ma non presente nei globuli bianchi valutati in un esame del sangue o nelle cellule buccali da un tampone guanciale. Il paziente sembrerebbe negativo alla linea germinale dai test standard, ma potrebbe avere la stessa mutazione VHL presente in più tumori insorgenti in modo indipendente. Questo principio è stato recentemente dimostrato nei pazienti con tumore di Wilms che presentavano mutazioni all'inizio dello sviluppo che hanno provocato tumori multifocali bilaterali con una mutazione driver condivisa. È importante sottolineare che è stato anche dimostrato che in questo scenario i tumori indipendenti svilupperanno mutazioni aggiuntive uniche man mano che il tumore si evolve. In generale, il mosaicismo è un evento raro e improbabile in questo studio poiché 3 pazienti hanno dimostrato tumori con mutazioni geniche somatiche aggiuntive condivise (MTOR e ARID1A per il paziente 3; PBRM1, SETD2 e NFE2L2 per il paziente 4; PBRM1 e KDM5C per il paziente 5) che potrebbe essere condiviso solo a causa delle metastasi piuttosto che del mosaicismo. Inoltre, anche 2 pazienti con mutazioni VHL condivise (pazienti 2 e 3) hanno eseguito il sequenziamento sul tessuto renale normale adiacente che non ha mostrato alcuna evidenza di mutazione VHL. Infine, 4 pazienti su 5 (pazienti da 1 a 4) hanno sviluppato metastasi al di fuori dei reni

Da notare che il paziente 5 non ha ancora dimostrato evidenza di metastasi a distanza. Mentre il suo tumore più grande era di 4,8 cm e poteva essere considerato a più alto rischio di diffusione metastatica, l'osservazione che tutti e 7 i suoi tumori recentemente resecati condividono mutazioni VHL e la maggior parte condivide mutazioni PBRM1 e KDM5C solleva il sospetto di metastasi a distanza ancora più alto. Di conseguenza, questo paziente sarà seguito con un'osservazione particolarmente attenta e ravvicinata in futuro.

Pillole Cistanche e Cistanche secco

I pazienti con tumori renali a insorgenza indipendente hanno dimostrato un arricchimento sia per una storia familiare di cancro del rene sia per una malattia ad esordio precoce, entrambi indicatori di alterazioni ereditarie della linea germinale. Tutti i pazienti erano risultati negativi allo screening per variazioni patogene del gene noto del cancro del rene, suggerendo che potrebbero essere presenti cause genetiche sconosciute alternative. È stato anche dimostrato che la traslocazione della linea germinale che coinvolge il cromosoma 3p aumenta il rischio di ccRCC ed è associata a malattia multifocale bilaterale. Le traslocazioni non sono rilevabili da array di geni mirati e richiedono l'analisi del cariotipo. Pertanto, anche i pazienti con tumori renali a insorgenza indipendente che si presentano senza mutazioni nei geni di suscettibilità RCC noti dovrebbero essere sottoposti a screening per le traslocazioni del cromosoma 3p. L'analisi del cariotipo era disponibile per 12 su 14 dei pazienti con tumori renali a insorgenza indipendente in questo studio, ma non sono state osservate traslocazioni rilevanti. Un'ulteriore valutazione di questi pazienti per ulteriori alterazioni della linea germinale potrebbe identificare nuovi geni di suscettibilità RCC e l'analisi dello spettro delle mutazioni VHL consente la selezione di questi pazienti.

Sta diventando sempre più comune eseguire analisi di mutazione del gene del cancro mirate su tumori o biopsie di pazienti e queste analisi includono spesso il gene VHL e altri geni associati al ccRCC come PBRM1, BAP1, SETD2 e ARID1A. Pertanto, le biopsie bilaterali di routine delle masse renali bilaterali possono fornire un metodo semplice ed efficiente per distinguere tra metastasi controlaterali e tumori multifocali a insorgenza indipendente, in contrasto con le analisi basate sull'alterazione cromosomica che sono state eseguite in precedenza, consentendo un'ulteriore conferma nei pazienti con malattia metastatica. Diversi studi recenti hanno evidenziato l'eterogeneità intratumorale presente all'interno del ccRCC e questo potrebbe confondere l'analisi della biopsia poiché l'area campionata potrebbe non avere una mutazione che è presente solo in alcune aree di un tumore e fornire risultati imprecisi. Il vantaggio di valutare la mutazione VHL è che è presente nella maggior parte dei ccRCC ed è una mutazione precoce del tronco che sarebbe presente in tutto il tumore, quindi le biopsie dovrebbero quasi sempre essere informative.

L'importanza di essere in grado di distinguere tra pazienti con malattia metastatica o tumori renali localizzati a insorgenza indipendente è che sarebbero gestiti in modo diverso e potenzialmente avrebbero esiti nettamente diversi. Sebbene l'evidenza di metastasi al di fuori del rene sia conclusiva, l'imaging di pazienti con BMF ccRCC non consente una designazione accurata. In questo studio, questo problema è esemplificato al meglio dai pazienti 4, 9 e 19 in quanto tutti e 3 presentavano una malattia bilaterale con un grosso tumore in un rene e uno o più tumori più piccoli nel rene controlaterale e nessuna evidenza sincrona di lesioni al di fuori del rene. Senza l'analisi della mutazione VHL, l'unica caratteristica evidente è che il paziente 19 ha avuto l'esordio più giovane all'età di 36 anni e il paziente 9 ha avuto l'insorgenza più recente all'età di 62 anni. La valutazione dello spettro delle mutazioni VHL ha mostrato che entrambi i pazienti 9 e 19 avevano alterazioni VHL diverse in tumori diversi, coerenti con i tumori renali insorgenti in modo indipendente. Al contrario, il paziente 3 presentava la stessa mutazione VHL condivisa in tutti i tumori coerenti con un'origine comune e metastasi controlaterali. Ciò è stato supportato dalla presenza condivisa di mutazioni somatiche aggiuntive condivise in MTOR e ARID1A in tutti i tumori del paziente 3. Pertanto, i pazienti 9 e 19 potrebbero essere trattati mediante escissione chirurgica dei tumori e sorveglianza di routine, mentre il paziente 3 potrebbe essere trattato con terapie sistemiche appropriate per un paziente con malattia metastatica.

In conclusione, l'analisi dell'alterazione del VHL nel ccRCC BMF può aiutare a distinguere tra tumori renali metastatici controlaterali e tumori renali localizzati e insorgenti in modo indipendente e questo può essere utilizzato per influenzare la gestione e l'esito del paziente.

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Cathy D. Vocke, Christopher J. Ricketts, Adam R. Metwalli, Peter A. Pinto, Rabindra Gautam, Mark Raffeld, Maria J. Merino, Mark W. Ball e W. Marston Linehan