Scoperta e identificazione di potenziali costituenti attivi antimelanogenici di Bletilla Striata

ali.ma@wecistanche.com

Yiyuan Luo1, Juan Wang1, Shuo Li1, Yue Wu1, Zhirui Wang1, Shaojun Chen1 e Hongjiang Chen1,2*

Astratto

Sfondo:Bletilla striata è la medicina principale di molte formule classiche di sbiancamento della pelle nella medicina tradizionale cinese (MTC) ed è ampiamente utilizzata nell'industria cosmetica di recente. Tuttavia, i suoi principi attivi non sono ancora chiari e le sue radici fibrose non vengono utilizzate in modo efficace. Lo scopo del presente studio è scoprire e identificare i suoi potenziali costituenti attivi anti-melanogenici mediante il modello di zebrafish e l'aggancio molecolare.

Metodi:Ilantiossidantele attività sono state valutate dall'attività di scavenging dei radicali 2,2-difenil-1-picrylidrazil (DPPH), 2,2′-azino-bis-(3-etilbenthiazoline-6-acido solfonico) (ABTS ) attività di scavenging dei radicali e riducente ferricoantiossidantedosaggio di potenza (FRAP). L'attività anti-melanogenica è stata valutata datirosinasiinibitorioattivitàinibitorio in vitro e melanina nel pesce zebra. I profili chimici sono stati eseguiti mediante cromatografia liquida ad altissime prestazioni combinata con spettrometria di massa tandem quadrupolo time-of-flight (UPLC-Q-TOF-MS/MS). Nel frattempo, i potenziali costituenti attivi anti-melanogenici sono stati temporaneamente identificati mediante docking molecolare.

Risultati:L'estratto con etanolo al 95% delle radici fibrose di B. striata (EFB) possedeva le più forti attività inibitorie di DPPH, ABTS, FRAP e tirosinasi, con IC50 5,94 mg/L, 11,69 mg/L, 6,92 mmol FeSO4/g, e 58,92 mg/L, rispettivamente. Inoltre, l'EFB e l'estratto di etanolo al 95 per cento di B. striata tuber (ETB) hanno ridotto significativamente la sintesi di melanina di zebrafishembrios in modo dose-dipendente. 39 composizioni chimiche, inclusi 24 stilbenoidi, sono state identificate provvisoriamente da EFB ed ETB. L'aggancio molecolare ha indicato che c'erano 83 (inclusi 60 stilbenoidi) e 85 (inclusi 70 stilbenoidi) composti che mostravano affinità di legame più forti verso la tirosinasi e l'adenilato ciclasi.

Conclusione:I presenti risultati supportano la logica dell'uso di EFB ed ETB come agenti sbiancanti naturali della pelle nelle industrie farmaceutiche e cosmetiche.

Parole chiave: Bletilla striata, Antiossidante, Attività anti-melanogenica, UPLC-Q-TOF-MS/MS, Zebrafish, Docking molecolare

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Sfondo

Bletilla striata (Thunb.) Reichb. f. è una pianta erbacea perenne ampiamente distribuita in Asia, come Cina, Corea e Giappone [1]. Il tubero essiccato di B. striata, noto anche come Baiji, registrato per la prima volta nel Classico di Materia Medica di Shennong, è stato ampiamente utilizzato come medicina tradizionale cinese (MTC) per migliaia di anni in Cina. La farmacopea cinese afferma che possiede capacità di astringenza sull'emostasi e sull'analgesi, pertanto è stato ampiamente utilizzato per il trattamento di ematemesi, emottisi, sanguinamento traumatico, ulcere, gonfiore e pelle screpolata [2, 3]. Studi farmacologici hanno dimostrato che B. striata possedeva un ampio spettro di attività biologiche, come la guarigione delle ferite [4, 5], antiulcera [6, 7], emostatica [8],anti-infiammazione[9], antiossidante[10], antibatterico [11], virale antinfluenzale [12] e antietà [13]. Allo stesso tempo, B. striata contiene varie classi di composizioni chimiche, tra cuipolisaccaridi[14], bibenzili, fenantreni, antrachinoni,flavonoidie 2-isobutilmalati [3, 15], ecc.

B. striata è la medicina principale di molte formule sbiancanti per la pelle classiche nella MTC [16] ed è ampiamente utilizzata nell'industria cosmetica di recente [17]. Tuttavia, i suoi principi attivi non sono ancora chiari e anche alcuni risultati della ricerca sono stati contrari. Ad esempio, i risultati della ricerca forniti da Chenet al. ha indicato che l'estratto di etanolo al 95% di B. striata possedeva un'attività inibitoria della tirosinasi superiore a quella del suo estratto d'acqua con un tasso di inibizione del 68,36% in vitro[18], mentre il risultato di Huang et al. ha mostrato che l'attività inibitoria dell'estratto di acqua di B. striata sulla tirosinasi era più forte di quella dell'estratto di etanolo al 95% con un tasso di inibizione del 62% in vitro [19]. I risultati della ricerca di Luetal.[20]e Linghuetal.[21]hanno dimostrato che sia l'acqua che l'estratto di etanolo al 95% di B. striata, in particolare il suo frazionamento del cloroformio, potrebbero inibire la crescita delle cellule B16 e indurre la sua apoptosi in modo dipendente dalla concentrazione.

Poiché i test in vitro sull'inibizione della tirosinasi e sulle linee cellulari di melanoma, non hanno coinvolto le complesse condizioni fisiologiche in vivo e l'assorbimento, il metabolismo, la distribuzione e l'escrezione del campione in esame, molti di questi campioni hanno mostrato una significativa attività inibitoria contro la tirosinasi e le linee cellulari di melanoma in vitro, tuttavia, si è mostrato debolmente efficace o addirittura inefficace in vivo [22,23]. La glabridina ha mostrato una significativa attività inibitoria della tirosinasi con IC50 0.43μmol/L, che era 176 volte più forte di quella dell'acido cogico. Tuttavia, non si sono verificati effetti inibitori sulla pigmentazione del pesce zebra in vivo[24].

Nel frattempo, le radici fibrose di B. striata (FB) erano i sottoprodotti generati durante l'elaborazione di B. striatatuber (TB). Ricerche moderne hanno indicato che l'FB contiene composti simili con la tubercolosi e con un contenuto maggiore di fenolico [25]. Inoltre, le attività antibatteriche [26], antiossidanti e anti-tirosinasi dell'estratto di FB erano più forti di quelle dell'estratto di TB [25]. Tuttavia, le risorse di FB non sono state utilizzate efficacemente e sono state abbandonate nei terreni agricoli, il che ha portato allo spreco di risorse di FB e all'inquinamento ambientale [27].

Il pesce zebra (Danio rerio), un piccolo pesce d'acqua dolce tropicale, è un modello animale emergente per la farmacologia

e la ricerca tossicologica in vivo, con molti vantaggi tra cui basso costo, ciclo di vita breve, elevata trasparenza, facile manutenzione, elevata fertilità e richiesta di un minor numero di campioni di prova [28, 29]. Inoltre, il pesce zebra ha pigmenti di melanina sulla superficie, consentendo una semplice osservazione del processo di pigmentazione, ed è stato ampiamente utilizzato nello studio anti-melanogenico [28, 30].

Nel presente studio, abbiamo confrontato le attività inibitorie dell'antiossidante e della tirosinasi del polisaccaride grezzo e dell'estratto di etanolo al 95% di TB e FB in vitro e le attività anti-melanogeniche nel modello di zebrafish. Nel frattempo, i potenziali costituenti attivi anti-melanogenici sono stati temporaneamente identificati mediante docking molecolare. Abbiamo scoperto che l'estratto di etanolo al 95% di TB (ETB) e FB (EFB) possiede le attività significativamente antiossidanti e anti-tirosinasi e può ridurre la sintesi di melanina degli embrioni di pesce zebra in modo dose-dipendente. Pertanto, ETB ed EFB possono essere utilizzati come agenti sbiancanti naturali per la pelle nelle industrie farmaceutiche e cosmetiche.

Metodi

Sostanze chimiche e reagenti

La tirosinasi, la 3-(3,4-diidrossifenil)-L-alanina (L-DOPA) e l'arbutina sono state acquistate dalla società di reagenti Aladdin (Shanghai, Cina).2,2-difenile{{8 }}picrylidrazil (DPPH), 2,2′-azino-bis-(3-etilbenziazolina-6-acido solfonico) (ABTS),6-idrossi-2,5,7 ,8-tetrametilcroman-2-acido carbossilico (Trolox) e 2,4,6-tris (2-piridil)-s-triazina (TPTZ) sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Acetonitrile e metanolo (grado HPLC) sono stati acquistati da Tedia (Fairfield, OH, USA). L'acqua deionizzata è stata preparata dal sistema idrico Milli-Q (18,2 MΩ, Millipore, USA).

Procedura di raccolta ed estrazione delle piante

B. striata è stata raccolta da Quzhou YiNianTang Agriculture and Forestry Technology Co., Ltd. (Quzhou, Zhejiang, Cina). I campioni di voucher sono stati depositati presso l'Herbarium of Zhejiang Pharmaceutical College (Accession n. 190615). L'intera pianta era divisa in tuberi e radici fibrose. Successivamente, sono stati tagliati a pezzetti ed essiccati rispettivamente mediante liofilizzazione sotto vuoto.

I campioni essiccati e in polvere (TB e FB) sono stati estratti a riflusso con etanolo al 95% per tre volte (1,5 ore per volta). L'estratto è stato filtrato utilizzando una carta da filtro What man (n.1). Il filtrato è stato concentrato a secco in un evaporatore rotante (Hei-VAP, Heidolph, Germania) a 50 gradi ed è stato successivamente essiccato mediante un essiccatore di congelamento sotto vuoto. I rendimenti dell'estrazione con etanolo di TB (ETB) e FB (EFB) erano rispettivamente del 5,21 e del 6,53 percento. I thedregs sono stati usati per estrarre il polisaccaride grezzo disperso in acqua a 80 gradi per 4 ore e precipitato con etanolo [31]. Le rese di polisaccaridi di TB (PTB) e FB (PFB) erano rispettivamente del 14,75 e del 6,45%.

estratto di cistanche

Analisi chimica

L'analisi chimica è stata eseguita su una cromatografia liquida ad altissime prestazioni combinata con spettrometria di massa tandem quadrupolo time-of-flight (UPLC-Q-TOF-MS/MS). La separazione cromatografica è stata eseguita su un elemento UPLC Waters Acquity (Waters Corp., Milford, MA, USA) con una colonna WatersBEH Shield RP C18 (100×2,1 mm, 1,7μm) a3{ {43}} laurea . La fase mobile era costituita dallo 0,1 percento di acido formicale in acqua (A) e acetonitrile (B), con un gradiente lineare: 0–3 min, 5–16 percento B; 3–8 min, 16–30 percento B; 8–10 min, 30–35 percento B; 10–15 min, 35–55 percento B; 15–18 min, 55–80 percento B;18–19 min, 80–5 percento B; 19–20 min, 5 percento B. La portata era di 0,3 ml/min e il volume di iniezione era di 2 μl.

Gli esperimenti TOF-MS/MS sono stati eseguiti utilizzando una spettrometria di massa AB SCEIX Triple TOF 5600 (AB SCIEX, Foster City, CA, USA) dotata di ionizzazione elettrospray (ESI). Il rilevamento della SM è stato condotto con il metodo di ionizzazione negativa. I parametri sono stati impostati come segue: la temperatura di sorgente e di desolvatazione era rispettivamente di 100 gradi e 450 gradi; la portata del gas di desolvatazione era di 900 l/h; la tensione capillare era di 2 kV; la tensione del cono era di 40 V; l'energia di collisione era di 22 eV; e lo scanspectra completo era compreso tra 100 e 2000 Da.

Saggi antiossidanti DPPH attività di scavenging dei radicali

L'attività di scavenging dei radicali DPPH è stata determinata in accordo con Ali et al. con lievi modifiche [32].In breve, 50 μL di soluzione del campione di prova è stata miscelata con 150 μLDPPH di soluzione di etanolo (0,2 mM) in 96-piastre a pozzetti ed è stata tenuta al buio per 30 minuti . L'assorbanza della miscela a 517 nm (A1) è stata valutata mediante spettrofotometro per micropiastre (Thermo Fisher Scientific, America). La soluzione in bianco senza campione di prova miscelata con la soluzione di DPPHetanolo è stata impostata come gruppo positivo (A0). La soluzione in bianco senza DPPH miscelata con la soluzione dei campioni di prova è stata impostata come gruppo bianco (A2). Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato. Il tasso di scavenging del radicale DPPH è stato calcolato utilizzando la seguente formula:

Tasso di scavenging dei radicali DPPH (percentuale) {{0}} [A0-(A1-A2)]/A0 × 100 percento .

ABTS attività di scavenging radicale

La capacità di scavenging dei radicali ABTS è stata misurata utilizzando il metodo descritto da Ali et al. [32]. In breve, la soluzione acquosa 7mMABST è stata miscelata con persolfato di potassio 2,45 mM in un rapporto di 1:1 (v/v) e incubando a temperatura ambiente al buio per 16 ore per ottenere la soluzione madre ABST più. La soluzione madre è stata diluita con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per regolare l'assorbanza di (0.72±0.2) a 734 nm. 20 μL di campioni di prova a diverse concentrazioni sono stati miscelati accuratamente con 180 μL di soluzione ABTS plus. Le miscele reattive sono state mantenute al buio per 5 minuti e successivamente hanno misurato l'assorbanza (B1) a 734 nm. L'assorbanza delle miscele senza campione di prova e ABST plus è stata impostata rispettivamente come B e B . Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato. Il tasso di radicalscavenging ABTS è stato calcolato secondo la seguente formula:

Tasso di scavenging radicale ABTS (percentuale) {{0}} [B0-(B1-B2)]/B0 × 100 percento .

Saggio del potere antiossidante ferrico riducente (FRAP)

L'attività di riduzione del ferro ferrico è stata determinata secondo le procedure di Kosakowska et al. [33]. 30tampone acetato 0 mM, TPTZ 10 mM (2,4,{5}}tris ({6}}piridil)-s-triazina) e FeCl3 20 mM sono stati miscelati a (v/v/v) rapporto di 10:1:1 per preparare il reagente di lavoro. 100 μL di ogni campione di prova è stato miscelato con 100 μL di reagente di lavoro TPTZ, incubato a 37 gradi per 20 minuti e l'assorbanza è stata determinata a 593 nm. Nel frattempo, per preparare la curva di calibrazione sono state utilizzate una serie di soluzioni standard di FeSO4 negli intervalli di concentrazione di 0–1000 ug/mL. La capacità ferrica riducente è stata calcolata nella formazione di un intenso complesso blu Fe2 più -TPTZ. I risultati sono stati espressi come Fe2 più capacità antiossidante (mmol FeSO4/g di estratto).

Attività inibitoria della tirosinasi

Le attività inibitorie della tirosinasi sono state determinate mediante metodo spettrofotometrico utilizzando L-DOPA come substrato [34]. In breve, 50 μL di soluzioni campione a diverse concentrazioni sono state miscelate con 50 μL di tirosinasi (200 unità/mL, tampone fosfato disciolto a pH 6,8) in 96- pozzetto piastre e incubate per 15 minuti a 25 gradi. La reazione è stata quindi avviata con l'aggiunta di L-DOPA (50 μL). Dopo un'incubazione di 30 minuti a 25 gradi, l'assorbanza a 490 nm (Aa) è stata determinata utilizzando uno spettrofotometro a micropiastre sky multiskan (ThermoFisher Scientific, America). Allo stesso modo, sono state rilevate contemporaneamente l'assorbanza dei pozzetti del campione senza tirosinasi (Ab) e dei pozzetti di controllo con l'enzima ma senza campione (Ab). L'attività inibitoria della tirosinasi è stata calcolata dall'equazione come segue:

Tasso inibitorio della tirosinasi ( percentuale )=[1− (Aa − Ab)/Ac] × 100 percento.

L'IC50 è stato calcolato utilizzando l'equazione GraphPad Prism come di seguito:

Y=min più (max − min)/1 più 10(x−logIC50)×Pendenza collinare

X rappresentava la concentrazione dell'inibitore; Y rappresentava i dati di inibizione (percentuale) insieme ai loro valori minimo (min) e massimo (max); La pendenza della collina è il fattore di pendenza.

Cistanche inibisce l'attività della tirosinasi.

Inibitore della melanina nel pesce zebra

Il pesce zebra della linea AB di tipo selvatico (fornito da Hunter Bio-technology, Inc., Hangzhou, provincia di Zhejiang) era alloggiato nell'acqua dei pesci (0,2 percento di sale oceanico istantaneo in acqua deionizzata, pH 6,9–7,2, conducibilità 48{ {18}}–510 mS/cm e durezza 53,7–71,6 mg/L CaCO3) in un fotoperiodo chiaro/scuro di 14/10 ore a una temperatura costante di 28 ± 0,5 gradi, e nutrito con gamberetti di salamoia vivi due volte al giorno. Gli embrioni di pesce zebra sono stati ottenuti dalla deposizione delle uova naturale e raccolti entro 30 minuti. Il test del pesce zebra è stato accreditato dall'Associazione per la valutazione e l'accreditamento della cura degli animali da laboratorio (AAALAC). Il presente studio è stato approvato dallo IACUC (Institutional Animal Careand Use Committee) presso Hunter Biotechnology, Inc. e il numero di approvazione IACUC era 001458.

Gli embrioni allo stadio di 6 ore dopo la fecondazione (hpf) sono stati trattati con ciascun estratto a sei concentrazioni (10, 30, 62,5,125, 250 e 500 mg/L) per 72 ore per valutare la concentrazione massima non letale (MNLC ). Di conseguenza, i MNLC di tutto l'estratto erano superiori a 62,50 mg/L.10 embrioni sono stati posti in 6-pozzetto e sono stati esposti a campioni testati a concentrazioni di 10 e 30 mg/L da 6 hpf a 54 hpf (48 h di esposizione ). DMSO (0,05 percento, v/v) e arbutina (10 e 30 mg/l) sono stati usati rispettivamente come controllo normale e positivo.

Gli embrioni sincronizzati sono stati raccolti e osservati sotto uno stereomicroscopio (SZX7, Olympus, Giappone) dotato di una fotocamera digitale (VertA1, Cina). L'accumulo di melanina, direttamente correlato alle aree di pigmentazione del pesce zebra, è stato calcolato utilizzando il GNUImage Manipulation Program (GIMP versione 2.10.2) ed espresso in percentuale rispetto al controllo negativo (accumulo di melanina 100 percento) [28, 30].

Studio dell'aggancio molecolare

158 composti isolati da B. striata in letteratura[2], inclusi 19 glicosidi, 28 bibenzili, 19 fenan-treni, 18 bifenantreni, 23 diidrofenantreni, 5 antociani, 11 steroidi, 8 triterpenoidi, 12 acidi fenolici, 5 chinoni, e 10 altri composti, sono stati usati come ligandi. Le strutture 3D sono state disegnate da ChemBio3D e sono state ottimizzate utilizzando MM2 e Autodock Tools. La struttura cristallina 3D della tirosinasi (PDBID: 5M8N) e dell'adenilato ciclasi (PDB ID: 5IV3) è stata recuperata dalla banca dati delle proteine ​​​​RCSB (www.rcsb.org/pdb/home/home.do). Tutte le molecole d'acqua e gli eteroatomi sono stati rimossi dalle strutture cristalline utilizzando Chimera e MGL Tools. Infine, Autodock

Vina è stata utilizzata per agganciare la proteina recettore con i ligandi di piccole molecole. I parametri del sito di attracco della pro-teina del recettore sono stati impostati rispettivamente come -36.700, 7.034, -19.104 e - 17.467, - 22.807, 2.786, secondo il ligando originale mimosina e LRE1 [35]. Per ottenere una maggiore precisione computazionale, sono stati generati 20 parametri di esaustività per ciascun recettore e la conformazione con la più alta affinità è stata selezionata come conformazione di aggancio finale e visualizzata in Pymol2.3. Nel frattempo, i ligandi originali mimosina e LRE1 sono stati presi come controllo positivo [36].

Previsione ADMET in silico

I primi 3 risultati di B. striata possedevano una migliore affinità di legame con la tirosinasi e l'adenilato ciclasi, sono stati sottoposti all'analisi ADMET. QikProp in Schrodingersuite è stato utilizzato per calcolare le loro proprietà fisiche e le caratteristiche correlate ai farmaci, tra cui peso molecolare (MW), coefficiente di partizione ottanolo/acqua previsto (QPlogPo/w), solubilità acquosa prevista (QPlogS), Caco-2 apparente previsto permeabilità per la barriera intestinale-sangue (QPPCaco), coefficiente di ripartizione cervello/partizione del sangue previsto (QPlogBB), permeabilità cutanea prevista (QPlogKp), IC50 previsto per il blocco dei canali HERGK plus (QPlog HERG) e assorbimento orale umano previsto. Le proprietà sono state valutate sulla base della regola del cinque di Lipin-ski e della letteratura [37, 38].

Simulazione di dinamica molecolare

Al fine di esaminare la stabilità e le fluttuazioni dinamiche del complesso ligando-proteina in un ambiente biologico simulato e validare ulteriormente i risultati di docking, i composti blestrina D (75) sono stati scelti come ligando per lo studio di simulazione di dinamica molecolare (MD), basato sul risultato dell'aggancio molecolare. Il complesso di blestrina D con tirosinasi e adenilato ciclasi è stato eseguito simulazioni MD ed eseguito per 100 ns, utilizzando la modalità acqua TIP3P. I valori della deviazione quadratica media della radice (RMSD) degli atomi della spina dorsale della proteina rispetto alla struttura iniziale sono stati calcolati per esaminare la stabilità della proteina nel corso del periodo di simulazione [39].

Risultati

Composizione chimica

I tipici cromatogrammi del cromatogramma di picco di base di ETB ed EFB sono stati mostrati in Fig. 1. Il software PeakView è stato utilizzato per identificare i costituenti. La formula molecolare è stata accuratamente assegnata entro un errore di massa di 10 ppm. L'esatto peso molecolare e le frammentazioni sono stati utilizzati per identificare i componenti in base alle letterature e al database della struttura chimica libera, come ChemSpider e Massbank. Di conseguenza, 39 composizioni chimiche, inclusi 24 stilbenoidi (bibenzili, fenantreni e loro derivati), 6 glicosidi, acidi 4fenolici, 3 chinoni, 1 steroide e 1 altro composto sono stati provvisoriamente identificati da EFB e ETB. Allo stesso tempo, la loro semi-quantificazione relativa è stata eseguita misurando le aree di picco di ciascun composto in modalità MS utilizzando i cromatogrammi ionici estratti [40]. Le informazioni dettagliate dell'identificazione e il loro contenuto relativo (evidenziazioni della mappa di concentrazione) sono stati riassunti nella Tabella 1.

Capacità antiossidante

È noto che l'irradiazione ultravioletta A (UVA) può indurre la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e mediare l'eccessiva melanogenesi nelle cellule della pelle. Il polifenolo naturale era l'inibitore della generazione di ROS e potrebbe essere responsabile dell'attività anti-melanogenica degli estratti vegetali [41] , 42]. Pertanto, nel presente studio, la capacità antiossidante è stata valutata attraverso DPPH, ABTS radical scavenging attività e FRAPassay. I risultati (Tabella 2 e Fig. 2) hanno mostrato che l'EFB (IC50=5.94mg/L) possiede la più forte attività di scavenging dei radicali DPPH in vitro rispetto al PTB(IC50=548.24 mg/L) , PFB (IC50=285,81 mg/L) e ETB(IC50=65,25 mg/L). Una tendenza simile è stata osservata nel dosaggio ABTS e FRAP. Gli estratti etanolici al 95% di TB e PB avevano un'attività antiossidante più forte in vitro rispetto ai loro polisaccaridi grezzi. Inoltre, EFB mostra un'attività antiossidante più forte di ETB, che era coerente con i risultati della ricerca precedente [25].

Attività inibitoria della tirosinasi

La tirosinasi era l'enzima chiave di limitazione della velocità nella via della biosintesi della melanina ed è stato ampiamente utilizzato per identificare il potenziale dei prodotti naturali con effetto anti-melanogenesi [43]. I risultati (Fig. 3) hanno mostrato che ETB ed EPB avevano un'attività inibitoria della tirosinasi più forte rispetto a PTB e PPB in vitro, che era coerente con i risultati della ricerca precedente [25]. L'EFB ha mostrato una maggiore attività di inibizione della tirosinasi in modo dose-dipendente (tra 20 e 200 mg/L) con IC50=58.92 mg/L rispetto a ETB(IC50=75.44 mg/L) e al composto positivo arbutina(IC{ {11}},02 mg/l).

Inibitore della melanina nel pesce zebra

Zebrafish are recognized as a highly advantageous vertebrate model system to evaluate anti-melanogenesis activity, as it possesses similar organ systems and gene sequences to human beings [28]. Therefore, zebrafish was used to evaluate the anti-melanogenesis activity. As shown in Fig. 4, a large number of melanin (black spots) deposited in the zebrafish embryo in the control and 0.05% DMSO group. The microscopy images showed there was no significant difference in total melanin content between two groups (p>{{0}}.05), indicando che lo 0,05% di DMSO del veicolo non ha influenzato la produzione di melanina negli embrioni di pesce zebra. Tuttavia, dopo l'esposizione ai campioni testati e all'arbutina per 48 ore, gli embrioni di pesce zebra hanno mostrato vari gradi di deposizione di melanina (Figg. 3B, 4), ad eccezione del gruppo PFB 10 mg/L. È da notare che il contenuto relativo di melanina nei gruppi ETB 10 mg/L (78,38 percento) e 30 mg/L (64,72 percento) era significativamente inferiore a quello nei gruppi PTB 10 mg/L (93,06 percento) e 30 mg/L (82,02 percento)(p<0.01). it="" demonstrated="" that="" the="" anti-melanogenesis="" activity="" of="" etb="" was="" superior="" to="" that="" of="" ptb,="" which="" was="" consistent="" with="" the="" tyrosinase="" inhibitory="" activity.="" whereafter,="" it="" is="" noteworthy="" that="" the="" anti-melanogenesis="" activities="" of="" etb="" (81.65,="" 75.61%)="" and="" efb="" (78.38,="" 64.72%)="" were="" stronger="" than="" that="" of="" arbutin="" (93.57,="" 81.48%)="" at="" the="" same="" dose="" of="" 10="" mg/l="" and="" 30="" mg/l="" (p="" <="" 0.01="" or="">

Aggancio molecolare

La tirosinasi è l'enzima che limita la velocità nella biosintesi della melanina: idrossilazione della tirosina a 3,4-diidrossi-fenilalanina (DOPA) e ossidazione del todopachinone DOPA. Pertanto, la tirosinasi è stata considerata un bersaglio critico per lo sviluppo di inibitori della melanogenesi [44]. Inoltre, l'adenilatociclasi è un enzima chiave della melanogenesi indotta da cAMP. Il legame del polipeptide alfa della melanotropina (-MSH) ai recettori MC1R ha indotto l'attivazione dell'adenilato ciclasi, l'aumento del livello di cAMP, l'espressione sovraregolata del gene della tirosinasi e, di conseguenza, l'aumento della sintesi di melanina [45]. Pertanto, abbiamo eseguito uno studio di docking molecolare dei 158 composti isolati da B. striata in precedenza [2], con tirosinasi e adenilato ciclasi. Le energie di legame dei ligandi studiati con tirosinasi e adenilatociclasi sono state riassunte nella Tabella S1. C'erano 83 (inclusi 60 stilbenoidi) e 85 (inclusi 70 stilbenoidi) composti che mostravano affinità di legame più forti verso la tirosinasi e l'adenilato ciclasi, confrontando quelli dei ligandi originali mimosina (-6,4 kcal/mol) e LRE1 (-8,5 kcal /mol). 1,8-bis(p-idrossibenzil)-4-metossifenantrene-2,7-diolo (56), blestrina D (75) e 2,7-diidrossi -1,6-bis(p-idrossibenzil)-4-met-ossi-9,10-diidrofenantrene (93) erano i primi tre ligandi verso la tirosinasi, con energia di legame -10,2, 10,0 e 9,7 kcal/mol, rispettivamente. Mentre blestrina D(75), blestrina B (73) e 3,3′-diidrossi{51}}metossi{52}},5′,6-tris(p-idrossibenzil) bibenzile (42) erano i primi tre ligandi verso l'adenilato ciclasi, con energia di legame - 12,1, - 11,9 e - 11,6 kcal/mol, rispettivamente. Le loro affinità di legame teoriche e le interazioni ligando-aminoacido sono state riassunte nella Tabella 3.

Valeva la pena notare che la blestrina D (75), un composto bifenantrenico, è entrata nella tasca di legame della tirosinasi e dell'adenilato ciclasi (Fig. 5) e ha mostrato affinità di legame significative sia verso la tirosinasi che verso l'adenilato ciclasi. Le interazioni di Van der Walls contribuiscono al valore complessivo dell'interazione energetica, nel frattempo il gruppo idrossile produce legami idrogeno con residui di amminoacidi Glu 451, Arg114 della tirosinasi e Val 167 dell'adenilato ciclasi, rispettivamente (Tabella 3 e Fig. S1). Anche il composto 93 ha mostrato affinità di legame significative verso la tirosinasi attraverso la formazione di 6 legami a idrogeno con residui di amminoacidi Glu232, Glu451, Ser106,Cys113, Lys223 e Gln236.

Previsione ADMET in silico

I valori previsti di diversi parametri importanti insieme al loro intervallo accettabile sono stati riassunti nella Tabella 4. A parte il QPlogS di 3,3′,5-trimetossibibenzile, blestrina B e blestrina D e QPlogBB di 3,3′,{{6} }trimetossibibenzile, tutte le altre proprietà calcolate dell'ADMET dei primi tre risultati erano all'interno degli intervalli previsti, nel frattempo, il QPlog HERG di tutti i primi tre risultati era inferiore a -5, indicando che erano potenziali drogabili per uso umano. Il QPlog Kp di tutti i primi tre risultati sia per la tirosinasi che per l'adenilatociclasi, ad eccezione del 3,3′,{10}}trimetossibibenzile, era nell'intervallo favorevole, indicando che questi composti possono penetrare facilmente nella pelle.

Simulazione dinamica molecolare

Il grafico RMSD ha mostrato che i valori RMSD del complesso proteina-ligando non hanno fluttuato in modo significativo durante l'intero periodo di simulazione. I valori RMSD (Fig. 6A) della blestrina D con tirosinasi e complesso adenilato ciclasi sono stati determinati rispettivamente da 1,5 a 2,8 Å e da 2.0 a 3,6 Å. Il valore di RMSF che riflette la flessibilità di ogni residuo durante le simulazioni. I residui con valori RMSF più elevati hanno rivelato che erano più flessibili (Fig. 6B). È stato riscontrato che i valori RMSF dei residui di amminoacidi nelle regioni del ciclo oscillano notevolmente. Mentre i residui del sito attivo hanno mantenuto un piccolo valore RMSF (inferiore a 1.0Å), come Arg114, Val167, Tyr226, Leu229 e Arg230 nella tirosinasi e Val167, Leu102, Phe45, Lys95 e Leu166 nell'adenilato ciclasi, indicando che le tasche di rilegatura erano mantenute stabili. Le interazioni molecolari della blestrina D con la tirosinasi e l'adenilato ciclasi sono state mostrate in Fig. 7.

Le energie libere di legame sono state calcolate con il metodo dell'area della superficie nata generalizzata della meccanica molecolare (MM-GBSA) [39]. L'energia libera di legame prevista della blestrina D con tirosinasi e adenilatociclasi era rispettivamente di -96,94 kcal/mol e -139,69 kcal/mol, il che implica che le interazioni di legame erano spontanee (Tabella 5). Inoltre, i contributi a favore del legame del ligando erano l'interazione di solvatazione non polare, van der Waals e l'interazione elettrostatica.

Valeva la pena notare che i tipi e il contenuto dei componenti chimici in EFB erano più di quelli inETB. Le aree di picco di tutti i composti identificati in EFB erano circa il doppio di quelle in ETB. La militarina era il composto più abbondante sia nell'EFB che nell'ETB, che possedeva significative attività antiossidanti, antinfiammatorie e neuroprotettive ed è stato scelto come marcatore chimico per il controllo di qualità di B. striata nella Farmacopea cinese edizione 2020 [46]. L'area di picco relativa dell'EFB militare (38,39 × 106) era leggermente superiore a quella dell'ETB (30,48 × 106). La gastrodina è un composto ben noto in molti medicinali a base di erbe cinesi, come il Gastrodia elata, che mostra significativi effetti inibitori della tirosinasi e di scavenging dei radicali [30]. L'area di picco relativa della gastrodina in EFB (1,43 × 106) era leggermente inferiore a quella inETB (2,17 × 106).

Gli estratti etanolici al 95% di TB e PB avevano un'attività antiossidante più forte in vitro rispetto ai loro polisaccaridi grezzi. Inoltre, EFB mostra un'attività antiossidante più forte di ETB, che era coerente con i risultati della ricerca precedente [25]. Questo fenomeno può essere attribuito al fatto che l'EFB contiene un livello più elevato di composti antiossidanti, come militarina e stilbenoidi (polifenoli vegetali naturali). Ad esempio, l'area del picco relativo del 4,8,4′,8′-tetrametossi-[1,1′-bifenantrene]-2,7,2′,7′-tetrolo, un bifenantrene con quattro gruppi idrossilici fenolici, era 9,15 × 106 in FB, mentre era 0,01 × 106 in TB.

Nel presente studio, PPB e PTB hanno mostrato una leggera attività di inibizione della tirosinasi in modo dose-dipendente. Tuttavia, ha dimostrato che non è stata rilevata alcuna attività nell'estratto acquoso di PB (contiene PPB) [25]. Questo fenomeno può essere dovuto alla diversa preparazione del campione. L'estratto acquoso di PB è stato utilizzato per valutare l'attività inibitoria della tirosinasi nell'esperimento di Jiang [25], mentre nel presente studio l'estratto acquoso è stato precipitato con etanolo per ottenere il polisaccaride grezzo.

Recentemente, il modello zebrafish ampiamente utilizzato nella valutazione dell'effetto anti-melanogenesi in vivo [47, 48]. L'arbu-stagno, un composto idrochinonico glucoside esistente in varie piante, che è stato utilizzato commercialmente nell'industria cosmetica, è stato impostato come controllo positivo. Le attività anti-melanogenesi di ETB ed EFB erano più forti di quelle dell'arbutina, indicando che ETB ed EFB possono essere applicati come agenti schiarenti per la pelle nell'industria cosmetica.

L'area del picco relativo di blestrin D in EFB(1,91 × 106), è circa quattro volte quella in ETB(0.46 × 10). Anche l'area del picco relativo del composto 56 (8,73 × 106) e 93 (0,64 × 106) in EFB è significativamente superiore a quella in ETB (meno di 0,01 × 106 e 0,10 × 106). Questo potrebbe essere uno dei motivi per cui EFB mostra effetti anti-melanogenici più forti di ETB. È interessante notare che i primi tre ligandi verso la tirosinasi e l'adenilato ciclasi appartengono tutti agli stilbenoidi (bibenzili, fenantreni e suoi derivati). Gli stilbenoidi sono i polifenoli vegetali naturali, che ha suscitato grande interesse negli ultimi anni a causa delle loro notevoli bioattività come attività antinfiammatoria, antimicrobica e antiossidante [49]. Il resveratrolo è lo stilbenoide più comune. La ricerca precedente ha indicato che il resveratrolo ei suoi derivati ​​possono inibire significativamente l'attività catalitica, l'espressione genica e le modificazioni post-traduzionali della tirosinasi. Pertanto, si sono mostrati potenzialmente utili come agenti schiarenti e antietà nei cosmetici [41, 50].

Cistanche si è dimostrato potenzialmente utile come schiarente della pelle e agenti antietà nei cosmetici.

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Conclusioni

In questo studio, sono stati studiati sistematicamente l'attività antiossidante e anti-melanogenica del polisaccaride grezzo del B. striatatuber (PTB) e delle radici fibrose (FPB) e dell'estratto di etanolo al 95% di B. striata tuber (ETB) e delle radici fibrose (EFB). . I risultati hanno mostrato che l'EFB possedeva la più forte attività di eliminazione dei radicali DPPH, ABTS e attività di riduzione del ferro ferrico. Inoltre, ETB ed EFB possono ridurre significativamente l'attività della tirosinasi in vitro e la sintesi di melanina di embrioni di pesce zebra in modo dose-dipendente. L'aggancio molecolare indicava che c'era un gran numero di composti, per lo più appartenevano a stilbenoidi, che esibivano affinità di legame più forti verso la tirosinasi e l'adenilato ciclasi, rispetto all'affinità di legame del ligando originale. I presenti risultati supportano la logica dell'uso di ETB ed EFB come agenti sbiancanti naturali della pelle nelle industrie farmaceutiche e cosmetiche.