Attività Sbiancante Dei Costituenti Isolati Dalla Polpa Di Trichosanthes

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Rongchao Zhang ,1,2Xiuqin Hu ,1Bo Zhang,1ZhenWang,1Chunxiang Hao,1 Jie Xin,1e Qingmei Guo 2

Astratto: Lo sbiancamentoil mercato dei cosmetici ha un futuro brillante e i prodotti sbiancanti naturali puri della medicina tradizionale cinese sono sempre stati un punto di riferimento della ricerca. In questa ricerca è stato isolato e purificato per la prima volta il principio attivo sbiancante della polpa di Trichosanthes della medicina cinese, e la suasbiancamentoè stato chiarito il meccanismo Per isolarli e purificarli sono stati utilizzati metodi cromatografici come gel di silice, ODS e HPLC. Le cellule B16 sono state utilizzate per misurare l'attività antiossidante,tirosinasiattività e attività di rimozione della melanina. Sono stati isolati un totale di 20 composti, tra cui p-idrossibenzaldeide (1), acido salicilico (2), acido vanillico (3), acido isovanillico (4), protocatechuato (5), acido trans-cinnamico (6), {{9 }}acido cumarico (7), acido transferulico (8), drechslerol-B (9), cicloesanolo 3-palmitato (10), 5-acetossimetil-2-furaldeide (11), 5-idrossimetilfurfurale (12), diosmetina (13), apigenina (14), crisoberile (15), luteolina (16), 4′-idrossiscutellarina (17), quercetina (18), 3′,{{31} }diidrossi-7-( -D-glucopiranosilossi)-4′-metossiflavone (19) e ciprofloxacina-7-O- -D-glucoside (20). Tra questi, i composti 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 e 20 hanno buoni effetti riparatori antiossidanti; i composti 3, 4, 5, 6 e 7 hanno un'elevata inibizione del nero; i composti 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19 e 20 hanno un'evidente attività inibitoria della tirosina ossidasi. 1e risultati hanno gettato le basi per l'ulteriore sviluppo e utilizzo delle risorse di polpa di Trichosanthes e forniscono anche una base per lo sviluppo disbiancamentocosmetici.

Cistanche erbaè uningrediente sbiancante naturale.

1. Introduzione

Trichosanthes kirilowii Maxim. è un'erba rampicante perenne della famiglia delle Cucurbitaceae. I suoi frutti, semi, buccia e radice sono tutti comunemente usati come medicine tradizionali cinesi. Per lungo tempo, la polpa di Trichosanthes viene spesso scartata nella produzione e lavorazione di Semen Trichosanthis e Pericarpium Trichosanthis, con conseguenti notevoli sprechi. Attualmente, i rapporti sulla polpa di Trichosanthes si concentrano principalmente sul confronto del contenuto di zucchero, aminoacidi, vitamine e altri nutrienti [1–4]. 1Non vi è alcuna relazione sulla composizione chimica della polpa di Trichosanthes. 1 Pertanto, è necessario studiare sistematicamente i costituenti chimici della polpa.

Allo stesso tempo, con il rapido sviluppo dell'economia, i cosmetici non sono solo prodotti di vita ad alto consumo, ma diventano anche le "necessità" più popolari per le donne. Molti libri di medicina classica cinese o materiamedica hanno registrato che la polpa di Trichosanthes ha la funzione disbiancamentoed effetti di rimozione delle rughe [5–7]. 1e risultati precedenti del nostro gruppo di ricerca mostrano che l'estratto di acqua della polpa di Trichosanthes era maggioretirosinasiattività inibitoria e il tasso inibitorio della tirosinasi era di circa il 70%. 1ecomunesbiancamentogli agenti vitamina C (VC) e arbutina sono stati usati come sostanze di controllo [8]. È stato preliminarmente dimostrato che l'estratto di polpa di Trichosanthes aveva un certo effetto sbiancante inibendo l'attività della tirosinasi. 1 Pertanto, è di grande importanza studiare i costituenti chimici e il meccanismo di sbiancamento della polpa di Trichosanthes.

IlsbiancamentoIl meccanismo può essere riassunto nell'inibire la sintesi della melanina e nell'accelerare il trasferimento della melanina. Il processo 1e degli inmelanociti di formazione della melanina è il seguente:tirosinasiossida la tirosina a polimorfo BA (DOPA); quindi viene ossidato a dopachinone. Dopo una serie di reazioni metaboliche, viene prodotta melanina. La tirosinasi è l'unico enzima limitante la velocità nel processo di reazione e la sua attività determina la quantità di melanina sintetizzata. Quando l'attività della tirosinasi è potenziata, la sintesi della melanina aumenta; quando l'attività della tirosinasi è inibita, la sintesi di melanina è ridotta [9]. 1e centro attivo della tirosinasi ha un doppio sito attivo di rame e ogni ione di rame si combina con 3 residui di istidina con 1 o 2 valenze rispettivamente. 1quindi, la riduzione con effetti antiossidanti può interagire con l'atomo di rame sul sito attivo della tirosinasi o ridurre l'intermedio nel processo di sintesi della melanina per inibire la formazione di melanina[10, 11]. Inoltre, anche l'inibizione del trasferimento dei melanociti maturi ai cheratinociti può svolgere un ruolo nello sbiancamento.

La tecnologia della coltura cellulare viene utilizzata per determinare l'effetto disbiancamentoprincipi attivi accesitirosinasiattività e produzione di melanina nei melanociti in vitro. 1e linea cellulare di melanoma di topo (cellule B16) è derivata da cellule di melanoma cutaneo di topo e la sua struttura di base, in particolare per quanto riguarda la sintesi di melanina, è sostanzialmente la stessa di quella delle cellule di melanoma umano normale. Poiché è molto difficile coltivare cellule di melanoma cutaneo primario umano, il modello murino può essere utilizzato come cellula di prova per la determinazione disbiancamentoingredienti attivi. 1 Pertanto, le cellule B16 sono state utilizzate per misurare l'attività antiossidante, l'attività della tirosinasi e l'attività di rimozione della melanina e sono stati determinati preliminarmente i componenti attivi sbiancanti e il relativo meccanismo. I risultati hanno gettato le basi per l'ulteriore sviluppo e utilizzo delle risorse di polpa di Trichosanthes e forniscono anche le basi per lo sviluppo di cosmetici sbiancanti naturali.

2. Esperimenti

2.1. Materiali.

Trichosanthes trichosanthis è stato raccolto dalla base di piantagione di erboristeria Hebao a Pinyin, Jinan. 1e campioni sono stati identificati dal professor QingmeiGuo della Shandong University of Traditional Chinese Medicine. Dopo aver privato della buccia e dei semi si otteneva la parte della polpa del frutto. Dopo la liofilizzazione, la polpa è stata frantumata, miscelata e infine posta in un essiccatore per un ulteriore utilizzo.

cistanche frescheinsieme aechinacosideeffetti

2.2. Vitalità cellulare.

Le cellule B-16 (cellule di melanoma del topo) sono state acquistate da KeyGEN e mantenute in terreno DMEM integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS), a 37 gradi in un'atmosfera umidificata con il 5% di CO2. 1en, cellule B-16sono state seminate in 96-piastre a pozzetti (10 × 104 cellule/pozzetto) per un'incubazione di 24 ore.

2.3. Preparazione di diversi estratti.

La materia prima della polpa di Trichosanthes kirilowii era di 4,5 kg. 1e polpa è stata imbevuta di 10 volte la quantità di etanolo al 95% 3 volte. Gli estratti sono stati combinati e concentrati a circa 3,0 L. L'estratto di acetato di etile è stato ottenuto disperdendo l'estratto di etanolo in 15 L di acqua, estraendolo con acetato di etile fino a quando l'estratto era incolore. 1e estratti sono stati combinati e concentrati a pressione ridotta.

L'estratto di acetato di etile è stato miscelato con gel di silice (100–200 mesh) in un rapporto di 1: 2 (estratto: gel di silice, v/ v). 1esolvente è stato evaporato e il gel è stato riservato. 1e colonna per vetrocromatografia (8{{30}} mm × 1200 mm) è stata confezionata con gel di silice da 200-300 mesh e D101 resina macroporosa, quindi la colonna è stata eluita con acetato di etile, etere di petrolio (10 percento, 25 percento, 50 percento, 75 percento e 100 percento) e metanolo, acetato di etile (5 percento, 10 percento, 25 percento, 50 percento , 75 percento e 100 percento), per raccogliere ogni flusso. Infine, ciascuna frazione è stata raccolta e configurata alle seguenti concentrazioni: 0,003125 mg/mL, 0,00625 mg/mL, 0,0125 mg/mL, 0,025 mg/mL, 0,05 mg/mL, 0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL, 0,5 mg/ mL, 1,0 mg/mL e 2,0 mg/mL, quindi utilizzati per elaborare le cellule in coltura. Al termine del trattamento, in ciascun pozzetto sono stati aggiunti 20 μL di soluzione MTT (5 mg/mL). Le cellule 1e sono state incubate per 20 minuti a 37 gradi. 1esupernatante è stato scartato e in ciascun pozzetto sono stati aggiunti 100 μL di DMSO. L'assorbanza 1e è stata misurata a 490 nm. 1eesperimento è stato ripetuto 3 volte. Il tasso di sopravvivenza 1e è stato calcolato come segue:

percentuale del tasso di sopravvivenza=(gruppo sperimentale gruppo vuoto)/(gruppo di controllo - gruppo vuoto) × 100 percento .

La concentrazione ottimale (C1) di ciascuna frazione è stata calcolata in base alla relazione funzionale tra il tasso di sopravvivenza e la concentrazione di ciascuna frazione. C1 è stato diluito 2, 4, 6 e 8 volte per ottenere rispettivamente le concentrazioni C2, C3, C4 e C5. 1e diversi estratti della polpa sono mostrati nella tabella 1.

Tabella 1: Estratti polari di polpa di Trichosanthes e concentrazione ottimale.

2.4. Esperimento di sbiancamento

2.4.1. Test Antiossidante.

Un test MTT è stato utilizzato per determinare la vitalità cellulare (kit MTT, Kaiji Biology). 1en, cellule B-16 sono state seminate in 96-piastre a pozzetti (10 × 104 cellule/pozzetto) per 24 ore e trattate con estratti o composti diversi per 24 ore. Dopo il trattamento, il mezzo di coltura è stato scartato e lavato due volte con PBS. 1en, è stato aggiunto lo 0,05 percento di H2O2 e le cellule sono state coltivate per 4 ore. Successivamente, le cellule B-16 sono state incubate in 20 µL di soluzione MTT (5 mg/mL) a 37 gradi per 4 ore. 1en, il supernatante di coltura è stato rimosso e il residuo è stato sciolto in 100 µl di DMSO. L'assorbanza 1e è stata rilevata a 490 nm utilizzando un lettore di micropiastre (Tecan Trading AG). 1eesperimenti sono stati eseguiti in parallelo 3 volte.

2.4.2. Inibizione della produzione di melanina.

La produzione di melanina è stata determinata rilevando le cellule di contenuto di melanina mediante pirolisi di NaOH [12]. Le cellule sono state seminate in 96-piastre di coltura di pozzetti per 24 ore a una densità cellulare di 10 × 104 cellule/pozzetto.1en, le cellule sono state trattate con estratti o composti diversi per 24 ore. Successivamente, il supernatante di coltura cellulare (300 µL) è stato rimosso e il residuo è stato sciolto in NaOH (1 mL, 1,0 mol/L) per 24 ore a temperatura ambiente. L'assorbanza è stata misurata a 475 nm, utilizzando un lettore di micropiastre (Tecan Trading AG). 1e esperimenti sono stati eseguiti in parallelo con 3 repliche. 1e IC50 è stato determinato dal software GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc., San Diego, California) e l'arbutina è stata utilizzata come controllo positivo (IC50 =15.6 µL).

2.4.3. Determinazione dell'attività della tirosinasi.

Il surnatante di coltura cellulare è stato rimosso e il residuo è stato sciolto in Tritonx{0}} (90 µL) etirosinasi(10 µL, 1,0 mg/mL, Sigma, T3824 25ku). Dopo la miscelazione, la miscela è stata incubata a 37 gradi per 30 minuti. L'assorbanza 1e è stata misurata a 475 nm utilizzando un lettore di micropiastre (Tecan Trading AG). 1eesperimenti sono stati eseguiti in parallelo 3 volte. 1e IC50 è stato determinato dal software GraphPad Prism 5 (GraphPadSoftware, Inc., San Diego, California) ed è stata utilizzata l'arbutina come controllo positivo (IC50 =15.6 µL).

2.5. Estrazione e isolamento. L'estratto di acetato di etile è stato sciolto in metanolo e la colonna è stata impaccata con gel di silice da 200-300 mesh, che è stato equilibrato da etere di petrolio. 1en, un'eluizione in gradiente costituita da etere di petrolio e acetato di etile in rapporti di 2:1, 1:1 e 1:2; acetato di etile; acetato di etile e metanolo in rapporti di 2:1, 1:1 e 1:2; e metanolo è stato utilizzato in combinazione con TLC per ottenere i composti A (11,5 g), B (10,4 g), C (12,1 g), D (5,2 g) ed E (6,1 g).

A è stato separato mediante cromatografia su colonna di poliammide, utilizzando diclorometano e metanolo in rapporti di 2:1, 1:1 e 1:2 come solvente di eluizione. L'eluato 1e è stato monitorato mediante TLC. I punti con lo stesso fattore di ritenzione (rf) sono stati combinati e sono stati ottenuti A1 e A2. 1en, A1 è stato preparato mediante TLC, utilizzando diclorometano e metanolo in un rapporto di 1:1 come agente di sviluppo, e purificato più volte dalla colonna di gel. Infine sono stati ottenuti il ​​composto 1 (17 mg) e il composto 2 (27 mg). A2 è stato purificato mediante cromatografia su colonna di gel di silice, usando diclorometano e metanolo come eluente in rapporti di 1:1 e 1:2. Sono stati ottenuti il ​​composto 3 (11 mg), il composto 4 (12 mg) e il composto 5 (23 mg). B è stato separato mediante cromatografia a media pressione C18 in fase inversa (RP-C18), utilizzando metanolo, acqua in un'eluizione a gradiente come segue: 0 percento, 10 percento, 15 percento, 20 percento, 25 percento, 30 percento, 35 percento, 40 percento, 50 percento, 75 percento, 90 percento e 100 percento. La portata 1e era di 10 ml·min−1. Sono state combinate 1e frazioni di flusso con la stessa rf e sono state ottenute B1 e B2. B1 è stato ripetutamente purificato dalla colonna di gel, con metanolo come solvente di eluizione. Il composto (24 mg), 7 (21 mg) e 8 (18 mg) sono stati ottenuti dopo ripetute eluizioni. B2 è stato purificato mediante colonna di gel e metanolo e si è ottenuto il composto 9 (11 mg). C è stato separato da RP-C18 ed eluito da metanolo e acqua con una portata di 10 mL·min−1. 1e frazioni di flusso con la stessa rf sono state combinate e sono stati ottenuti C1, C2 e C3. C1 è stato preparato dalla colonna di gel ed eluito con metanolo, ed è stato ottenuto il composto 10 (13 mg). C2 è stato separato da colonna di gel di silice ed eluito da acetato di etile e metanolo, con un'eluizione a gradiente in rapporti di 2:1, 1:1 e 1:2. C2 è stato purificato mediante estrazione preparativa in fase liquida e composti 11 (15 mg) e 12 (14 mg) sono stati ottenuti. C3 è stato separato dalla colonna di poliammide, eluito con metanolo e acqua e purificato mediante HPLC. Sono stati ottenuti i composti 13 (34 mg), 14 (42 mg) e 15 (38 mg). D è stato separato da RP-C18 ed eluito con metanolo e acqua. La portata di 1e era di 10 mL·min−1. I composti 16 (36 mg), 17 (19 mg) e 18 (37 mg) sono stati ottenuti mediante HPLC. I composti 19 (29 mg) e 20 (34 mg) sono stati ottenuti mediante eluizione a gradiente usando acetato di etile e metanolo in rapporti di 1:1 e 1:2, seguiti da 100% di metanolo su una colonna di gel di silice.

Herba epimedium sagittatum sulla pelle

3. Risultati e discussioni

3.1. Determinazione degli Estratti Attivi (E1–E11).

È stata calcolata la concentrazione ottimale 1e (vale a dire, C1) di ciascun estratto ed è mostrata nella Tabella 1. L'esperimento antiossidante 1e mostra che tutti gli estratti hanno un effetto di riparazione antiossidante, ma rispetto a VC, l'effetto antiossidante di ciascun gruppo è debole. L'attività antiossidante di E1, E3, E4, E7 ed E11 è diminuita all'aumentare della concentrazione, come mostrato nella Figura 1. Il test di inibizione della melanina ha mostrato che tutti i componenti polari nella polpa di Trichosanthes kirilowii inibivano la sintesi di melanina. In particolare, il tasso di inibizione della melanina era significativamente più alto per E2, E3 ed E4 rispetto a quello dell'arbutina di controllo positivo, come mostrato nella Figura 2. 1e risultati ditirosinasil'attività mostra che tutti i componenti polari nella polpa di Trichosanthes kirilowii hanno inibito l'attività della tirosinasi e la tendenza all'inibizione era simile a quella dell'inibizione della melanina. L'inibizione 1e dell'attività della tirosinasi era significativamente più alta per E2, E3, E4 ed E8 rispetto a quella del controllo positivo. In generale, gli estratti di etere di petrolio hanno un basso effetto inibitorio sulla tirosinasi.1e gli estratti di acetato di etile hanno un alto effetto inibitorio sulla tirosinasi, in particolare i componenti polari di acetato di etile. 1e estratti da n-butanolo hanno anche un elevato effetto inibitorio sulla tirosinasi, come mostrato in Figura 3.

3.2. Isolamento e identificazione di componenti monomerici.

20 composti sono stati separati da gel di silice e colonne di cromatogramma ODS nonché da HPLC preparativo. Sulla base dell'analisi dei dati NMR e MS, le loro strutture sono state chiarite.1e Nella tabella 2 sono mostrati 20 composti e nell'appendice 1 sono riportati i dati specifici dei monomeri.

3.3. Analisi di validazione di composti efficaci

3.3.1. Analisi di validazione di composti antiossidanti.

E1, E2, E3, E4 ed E5 hanno effetti antiossidanti. 1e composti principali isolati dai componenti di cui sopra eranodrechslerol-B (composto 9), cicloesanolo 3-palmitato (composto 10), 5-acetossimetil-2-furaldeide (composto 11), 5-idrossimetilfurfurolo ( composto 12), diosmetina (composto 13), apigenina (composto 14), crisoberile (composto 15), luteolina (composto 16), 4′-idrossi-scutellarina (composto 17), quercetina (composto 18), 3′,{{ 25}}i composti principali erano i glicosidi, a indicare che i glicosidi hanno buone attività antiossidanti. Acidi fenolici, come 5-acetossimetil-2-furaldeide (composto 11), 5-idrossimetilfurfurale (composto 12), diosmetina (composto 13), apigenina (composto 14), crisoberile (composto 15) ,luteolina (composto 16), 4′-idrossiscutellarina (composto 17), quercetina (composto 18) e 3′,5-diidrossi-7-(-Dglucopiranosilossi)-4′-metossiflavone, hanno anche buone attività antiossidanti, dovute al gruppo idrossile fenolico e ai doppi legami insaturi [26, 27]. I risultati 1e sono mostrati nella Figura 4.

Figura 4: Tasso di sopravvivenza cellulare (percentuale) dell'esperimento antiossidante di diversi composti dagli estratti di Trichosanthes

3.3.2. Analisi di convalida dei composti di inibizione della melanina.

E11, E12, E13, E16, E17 ed E18 hanno buoni effetti inibitori sulla sintesi della melanina. I principali composti isolati dai componenti di cui sopra sono mostrati in Tabella 2. Secondo il metodo della Sezione 2.4.2, è stato determinato l'effetto di ciascun composto sulla sintesi di melanina. Ciascun composto è stato valutato alle seguenti concentrazioni: 1000 µg/mL, 800 µg/mL, 400 µg/mL, 200 µg/mL e 100 µg/mL. Ciascuna misurazione è stata eseguita in triplicato ed è stato calcolato il tasso di inibizione della sintesi di melanina.

Protocatechuate (composto 5), 5-acetossimetil-2-furaldeide (composto 11), 5-idrossimetilfurfurale (composto 12), diosmetina (composto 13), p-idrossibenzaldeide (composto 1), acido salicilico (composto 2), acido vanillico (composto 3), acido isovanilico (composto 4), acido trans-cinnamico (composto 6), 4- acido cumarico (composto 7), apigenina (composto 14), crisoberile (composto 15) ), luteolina (composto 16), 4′-idrossi scutellarina (composto 17), quercetina (composto 18), 3′,5-diidrossi-7-( -D-glucopiranosilossi)-4′ -metossiflavone (composto 19), ofloxacina-7-O- -D-glucoside (composto 20) possono inibire la produzione di melanina [28]. In particolare, acido vanillico (composto 3), acido isovanilico (composto 4), protocatechuato (composto 5), acido trans-cinnamico (composto 6) e 4-acido cumarico (composto 7) hanno un'elevata inibizione della melanina. I risultati 1e sono mostrati nella Figura 5.

3.3.3. Verifica e analisi dei composti che inibiscono l'attività della tirosinasi.

E2, E3, E4, E7, E8 ed E9 hanno buoni effetti inibitoritirosinasiattività. 1e principali composti isolati dai componenti di cui sopra sono mostrati nella tabella 2. Secondo il metodo presentato nella sezione 2.4.3, è stata utilizzata l'arbutina come controllo e la concentrazione del composto era 1000 µg/mL, 800 µg/mL, 400 µg/mL , 200 µg/mL e 100 µg/mL. Ciascuna misurazione è stata eseguita 5 volte ed è stato calcolato il tasso di inibizione della tirosinasi. I risultati 1e sono mostrati nella Figura 6.

1e risultati mostrano che diosmetina (composto 13), apigenina (composto 14), crisoberillo (composto 15), luteolina (composto 16), 4′-idrossiscutellarina (composto 17), quercetina (composto 18), 3′,{{10} }diidrossi-7-( -D-glucopiranosilossi)-4′-metossiflavone (composto 19), ciprofloxacina-7-O- -D-glucoside (composto 20), p-idrossibenzaldeide (composto 1), acido salicilico (composto 2), acido vanillico (composto 3), acido isovanillico (composto 4), protocatechuato (composto 5), acido trans-cinnamico (composto 6), 4- acido cumarico (composto 7 ) e l'acido trans-ferulico (composto 8) sono tutti evidentitirosinasiattività inibitorie.

La pianta di Cistanche inibisce l'attività della tirosinasi.

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Composti idrossilici sostituiti sull'anello benzenico, come p-idrossibenzaldeide (composto 1), acido salicilico (composto 2), acido vanillico (composto 3), acido isovanillico (composto 4), protocatechuato (composto 5), acido trans-cinnamico ( composto 6), 4-acido cumarico (composto 7), acido trans-ferulico (composto 8) e flavonoidi, hanno mostrato un'elevata inibizione della tirosinasi e il tasso di inibizione dei composti para-sostituiti era significativamente superiore a quello dei composti orto-sostituiti . Ad esempio, l'attività inibitoria della p-idrossibenzaldeide era significativamente superiore a quella dell'acido salicilico e l'attività inibitoria dell'acido vanillico era significativamente superiore a quella dell'acido isovanilico. Inoltre, l'attività inibitoria della p-idrossibenzaldeide era significativamente superiore a quella dell'acido salicilico, dell'acido vanillico, dell'acido isovanillico e del protocatechuato. 1 motivo potrebbe essere che i gruppi nucleofili attorno al centro attivo ditirosinasi, come –SH, −NH2 e –OH, occupano lo spazio attorno al centro attivo e quindi impediscono alla tirosina di attaccare il centro attivo. Infine, la sintesi della melanina è stata inibita [28]. 1e l'attività inibitoria dei composti contenenti o-diidrossi era più forte di quella dei composti paraidrossi, e l'attività inibitoria del protocatechuato era significativamente maggiore di quella dell'acido vanillico. 1e sopra i fenomeni esistono anche nei flavonoidi. Il tasso 1einibitorio dei flavonoidi contenenti i gruppi idrossilici 7 e 4′ era significativamente più alto che se i gruppi idrossilici 7 e 4′ venissero sostituiti. Ad esempio, l'attività inibitoria del crisoberile era significativamente superiore a quella della diosmetina, mentre l'attività inibitoria della diosmetina era superiore a quella del 3',5-diidrossi-7-(-D-glucopiranosilossi)-4 ′- metossiflavone e ciprofloxacina-7-O- -D-glucoside. Il tasso di 1einibizione dei flavonoidi contenenti 3-idrossi era significativamente superiore a quello dei composti senza 3-idrossi o se l'{23}}idrossi era stato sostituito. Ad esempio, l'attività inibitoria della quercetina era significativamente superiore a quella della 4'-idrossiscutellarina, ma l'attività inibitoria della 4'-idrossiscutellarina era superiore a quella della quercetina-3-o glucoside. Inoltre, l'attività inibitoria della koellina era superiore a quella dell'apigenina ma inferiore a quella della luteolina. Si suggerisce che i sostituenti dell'anello B, in particolare il gruppo idrossile, possano aumentare iltirosinasiattività inibitoria e il gruppo ortodiidrossi dell'anello B aveva un'attività inibitoria maggiore [29].