Doppi effetti modulatori della diosmina sui processi di formazione di calcoli renali di ossalato di calcio: cristallizzazione, crescita, aggregazione, adesione delle cellule cristalline, interiorizzazione nelle cellule tubulari renali e invasione attraverso la matrice extracellulare
Mar 16, 2022
per ulteriori informazioni:ali.ma@wecistanche.com
Supaporn Khamchuna,b,c,1, Sunisa Yoodeea,1, Visita Thongboonkerda,*
aUnità di proteomica medica, Ufficio per la ricerca e lo sviluppo, Facoltà di Medicina Ospedale Siriraj, Mahidol University, Bangkok 10700, Thailandia
bDipartimento di tecnologia medica, Scuola di scienze della salute alleate, Università di Phayao, Phayao 56000, Thailandia
cUnit of Excellence in Integrative Molecular Biomedicine, School of Allied Health Sciences, University of Phayao, Phayao 56000, Thailandia
Parole chiave: composto bioattivo, flavonoide, inibitore, modulatore, nefrolitiasi, promotore, urolitiasi
ASTRATTO
Diosminè un glicoside flavonico naturale (bioflavonoide) presente in frutti e piante con diverse attività farmacologiche. È stato ampiamente utilizzato come integratore alimentare o agente terapeutico in varie malattie/disturbi. Sebbene raccomandato, prova dei suoi meccanismi protettivi controrenela malattia dei calcoli (nefrolitiasi/urolitiasi), in particolare l'ossalato di calcio (CaOx) monoidrato (COM) che è il tipo più comune, è rimasta poco chiara. In questo studio, abbiamo quindi valutato sistematicamente gli effetti didiosmin(a 2,5–160 nM) su vari stadi direneprocessi di formazione dei calcoli, tra cui la cristallizzazione COM, la crescita dei cristalli, l'aggregazione, l'adesione delle cellule cristalline, l'interiorizzazione nelle cellule tubulari renali e l'invasione attraverso la matrice extracellulare (ECM). I risultati lo hanno mostratodiosminha avuto effetti modulatori dose-dipendenti su tutti i citati processi di calcolosi renale COM.Diosminha aumentato significativamente il numero e la massa dei cristalli COM durante la cristallizzazione, ma ha ridotto le dimensioni e la crescita dei cristalli. Mentrediosminpromosso l'aggregazione dei cristalli, ha inibito l'adesione e l'interiorizzazione delle cellule cristalline nelle cellule tubulari renali. Infine, la diosmina ha promosso l'invasione dei cristalli attraverso l'ECM. I nostri dati forniscono prove che dimostrano sia l'inibizione che la promozione degli effetti della diosmina sulla COMreneprocessi di formazione della pietra. Sulla base di queste doppie attività modulatorie della diosmina, il suo ruolo anti-urolitiasi è dubbio e dovrebbero essere fatte precauzioni per il suo uso inrenemalattia della pietra.
1. Introduzione
Diosmin(3′,5,7-triidrossi{3}}′-metossiflavone-7-ramnoglucoside) è un bioflavonoide naturale che si trova comunemente in varie piante e frutti, principalmente Citrus spp. [1,2]. Può essere sintetizzato o derivato dall'altro flavonoide, l'esperidina [1,2]. La diosmina da sola o in combinazione con l'esperidina è ampiamente utilizzata come farmaco flebotropico per il trattamento di disturbi venosi e linfatici come l'insufficienza venosa cronica e le emorroidi [3,4]. Inoltre, la diosmina esibisce diverse altre attività biologiche e farmacologiche, tra cui attività antiossidanti e antinfiammatorie [5,6], proprietà anti-mutagene e anti-neoplastiche [7,8], effetti antibiotici [9], proprietà anti-iperglicemizzanti [7,8] 10], e gli effetti protettivi contro i danni multi-organo, vale a dire,
cardiovascolare [11], retinico [12],rene, danno epatico e cerebrale [13].
Renela malattia dei calcoli (o nefrolitiasi/urolitiasi) è causata dai calcoli solidi sviluppati e depositati all'interno del rene e colpisce l'uomo in tutte le aree del globo con un alto tasso di recidiva [14-17]. Tra tutti i vari cristalli causativi, l'ossalato di calcio (CaOx), in particolare la forma monoidrata (COM), è il componente cristallino più patogeno e più comune trovato nei formatori di calcoli (pazienti con calcoli renali) [18]. Meccanicamente, i cristalli di COM hanno la più potente capacità adesiva e la maggior parte degli effetti citotossici sulle cellule epiteliali tubulari renali [19,20]. Durante la patogenesi del calcolo, sia il modello della placca di Randall che l'ipotesi intratubulare hanno caratteristiche comuni dei processi di formazione dei calcoli COM, tra cui cristallizzazione, crescita, aggregazione, ritenzione per adesione superficiale sulle cellule tubulari renali o sulla pelvi renale, interiorizzazione nelle cellule e invasione nella interstizio renale attraverso la matrice extracellulare (ECM) [21,22].
Di recente, molti studi si sono concentrati sulla scoperta di farmaci utilizzando piante/frutti medicinali e loro composti bioattivi con l'obiettivo di prevenire la formazione di calcoli nuovi e/o ricorrenti. Numerose relazioni precedenti hanno dimostrato che alcuni composti bioattivi, in particolare i composti fenolici (polifenoli, flavonoidi, glicosidi flavonici, ecc.) estratti da diverse piante/frutti medicinali, hanno effetti preventivi contro i meccanismi patogeni direnemalattia dei calcoli sia in vitro che in vivo [23-25]. Tra queste sostanze benefiche, alcuni rapporti hanno suggerito che la diosmina può prevenire la deposizione di cristalli di CaOx all'interno del tessuto renale in modelli animali [26,27]. Tuttavia, il suo preciso ruolo modulatorio (inibizione o promozione) ei meccanismi (stadi o processi di formazione di calcoli) nella formazione di calcoli renali COM non erano stati studiati. Il presente studio ha quindi valutato sistematicamente gli effetti didiosmin(a 2,5–160 nM) su vari stadi direneprocessi di formazione dei calcoli, tra cui cristallizzazione, crescita dei cristalli, aggregazione, adesione delle cellule cristalline, interiorizzazione nelle cellule tubulari renali e invasione tramite ECM.
Clicca suDosaggio di Cistanche tubulosa per la funzionalità renale
2. Materiali e metodi
2.1. Preparazione diosmina
Diosmin(Tokyo Chemical Industry; Tokyo, Giappone) è stato sciolto con il 100% di dimetilsolfossido (DMSO) (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO) e sono state prodotte aliquote di lavoro alle concentrazioni finali di 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 e 160 nM per studiarne gli effetti sui cristalli COM. Inoltre, in tutti gli esperimenti è stato utilizzato DMSO al 100 percento come controllo negativo.
2.2. Coltura cellulare
La linea cellulare epiteliale tubulare renale MDCK derivata dal segmento tubulare distale del nefrone (ATCC; Manassas, VA) è stata propagata nel mezzo essenziale minimo di Eagle (MEM) (Gibco; Grand Island, NY) integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS), 60 U/ml di penicillina G (Sigma-Aldrich) e 60 ug/ml di streptomicina (Sigma-Aldrich). Le cellule sono state mantenute in un'incubatrice umidificata con il 5% di CO2 a 37 ◦C.
2.3. Saggio di cristallizzazione COM
La cristallizzazione COM è stata eseguita come descritto in precedenza [28,29]. In breve, 500 ul di 10 mM CaCl2⋅2H2O in tampone di cristallizzazione (contenente 10 mM Tris-HCl e 90 mM NaCl) (pH 7,4) sono stati aggiunti in ciascun pozzetto della 24- piastra a pozzetti (Corning Inc.; Corning, NY). Un volume uguale (4 ul) di tampone di cristallizzazione (controllo in bianco), DMSO (controllo negativo) odiosmin(2,5, 5, 10, 20, 40, 80 o 160 nM) è stato miscelato con CaCl2. Infine, sono stati quindi aggiunti 500 ul di Na2C2O4 1,0 mM nel tampone di cristallizzazione per portare le concentrazioni finali di CaCl2 e Na2C2O4 rispettivamente a 5 mM e 0,5 mM. La miscela è stata incubata a 25°C per 1 ora e quindi esaminata. Le immagini dei cristalli sono state catturate casualmente da almeno 15 campi ad alta potenza (HPF) al microscopio a luce a contrasto di fase invertito Nikon Eclipse Ti-S (Nikon; Tokyo, Giappone). La dimensione e il numero dei cristalli sono stati misurati da almeno 15 HPF per ciascun campione utilizzando il software NIS Element D versione 4.11 (Nikon). La massa cristallina è stata calcolata da almeno 100 cristalli in 15 HPF utilizzando la seguente formula: massa cristallina (µm2/HPF)=dimensione media dei cristalli in ciascun campo (µm2) × numero di cristalli in ciascun campo (/HPF) ( 1)
2.4. Saggio di crescita dei cristalli COM
Il saggio di crescita dei cristalli è stato eseguito come descritto in precedenza [30,31].
In breve, un volume uguale (500 ul) di 10 mM CaCl2⋅2H2O e 1,0 mM Na2C2O4 nel tampone di cristallizzazione è stato miscelato (1:1) (v/v) in ciascun pozzetto del { {12}}piastra a pozzetto. La miscela è stata incubata a 25°C per 1 ora per consentire la completa cristallizzazione. A questo punto (T0), un volume uguale (4 ul) di tampone di cristallizzazione (controllo in bianco), DMSO (controllo negativo) odiosmin(2,5, 5, 1{{10}}, 20, 40, 80 o 160 nM) è stato aggiunto in ciascun pozzetto e la miscela è stata ulteriormente incubata per 60 minuti (T60). A T0 e T60, le immagini dei cristalli sono state catturate casualmente da almeno 15 HPF al microscopio ottico a contrasto di fase invertito Nikon Eclipse Ti-S. Le dimensioni dei cristalli a T0 e T60 sono state misurate utilizzando il software NIS Element D versione 4.11 (Nikon), mentre la crescita dei cristalli (rappresentata da Δ Dimensione del cristallo) è stata calcolata da almeno 100 cristalli in 15 HPF utilizzando la seguente formula: Δ Dimensione del cristallo (µm2)=Dimensione del cristallo a T60 − Dimensione del cristallo a T0 (2)
2.5. Saggio di aggregazione dei cristalli COM
Il saggio di aggregazione dei cristalli è stato eseguito come descritto in precedenza [32,33]. I cristalli COM sono stati generati come menzionato sopra nel test di crescita dei cristalli ma con un volume maggiore in una provetta conica 50- ml (Corning Inc.) e quindi raccolti mediante centrifugazione a 2000 g per 5 minuti. Il supernatante è stato scartato, mentre i cristalli COM sono stati lavati tre volte con metanolo. Dopo un'altra centrifugazione a 2000 g per 5 minuti, il metanolo è stato scartato ei cristalli sono stati essiccati all'aria per una notte a 25°C. I cristalli COM (1000 µg di peso secco) sono stati risospesi in 1 ml di tampone di cristallizzazione in ciascun pozzetto della 6-piastra a pozzetti (Corning Inc.). Un volume uguale (4 ul) di tampone di cristallizzazione (controllo in bianco), DMSO (controllo negativo) odiosmin(2,5, 5, 10, 20, 40, 80 o 160 nM) è stato aggiunto alla sospensione di cristallo COM in ciascun pozzetto. La piastra è stata continuamente agitata in un'incubatrice ad agitazione (Zhicheng; Shanghai, Cina) a 150 rpm e 25 ◦C per 1 ora. Successivamente, la formazione di un aggregato di cristalli COM (definito come "un insieme di tre o più singoli cristalli COM che si univano strettamente tra loro" [32]) è stata esaminata e fotografata al microscopio ottico a contrasto di fase invertito Nikon Eclipse Ti-S. Il numero di aggregati di cristallo COM è stato contato da almeno 15 HPF casuali per pozzetto.
2.6. Saggio di adesione delle cellule cristalline COM
Il test di adesione delle cellule cristalline è stato eseguito come descritto in precedenza [34,35]. In breve, i cristalli di COM sono stati generati come menzionato sopra in una provetta conica 50-ml e quindi raccolti mediante centrifugazione a 2000 g per 5 minuti. Il supernatante è stato scartato, mentre i cristalli COM sono stati lavati tre volte con metanolo. Dopo un'altra centrifugazione a 2000 g per 5 minuti, il metanolo è stato scartato ei cristalli sono stati essiccati all'aria per una notte a 25°C. I cristalli sono stati decontaminati dalla radiazione di luce UV per 30 minuti prima dell'intervento con le cellule.
Le cellule MDCK (ad una densità di 2 × 105 cellule/pozzetto) sono state seminate e coltivate in ciascun pozzetto della 6-piastra a pozzetti (Corning Inc.) per 48 ore per ottenere un monostrato confluente. Il mezzo di coltura è stato quindi rinfrescato prima di aggiungere i cristalli COM (100 µg di cristalli di peso secco per ml di mezzo di coltura). Un volume uguale (4 ul) di tampone di cristallizzazione (controllo in bianco), DMSO (controllo negativo) odiosmin(2,5, 5, 10, 20, 40, 80 o 160 nM) è stato aggiunto in ciascun pozzetto. Le cellule sono state ulteriormente incubate in un'incubatrice umidificata con il 5% di CO2 a 37°C per 1 ora. Successivamente, le cellule sono state lavate vigorosamente con PBS cinque volte e riprese al microscopio ottico a contrasto di fase invertito Nikon Eclipse Ti-S. Il numero dei restanti cristalli di COM aderito alla superficie delle cellule tubulari renali è stato contato da almeno 15 campi casuali per pozzetto.
Cistanche per la funzionalità renale
2.7. Saggio di interiorizzazione dei cristalli COM
I cristalli COM marcati con fluorescenza sono stati generati come descritto in precedenza [36,37]. Le composizioni/concentrazioni delle sostanze chimiche utilizzate per la cristallizzazione erano le stesse menzionate sopra per i cristalli semplici (non etichettati), ma 0,1 µg/ml di isotiocianato di fluoresceina (FITC) (Thermo Scientific Pierce; Rockford, IL) era aggiunto alla soluzione di CaCl2⋅2H2O prima della miscelazione con Na2C2O4. Le fasi successive (cristallizzazione e raccolta) sono state eseguite come sopra, ma al buio.
Per valutare l'internalizzazione dei cristalli nelle cellule epiteliali tubulari renali, le cellule MDCK (a una densità di 2 × 105 cellule/pozzetto) sono state seminate e coltivate in ciascun pozzetto della 6-piastra a pozzetti (Corning Inc.) per 48 ore per ottenere monostrato confluente. Il monostrato cellulare è stato incubato con cristalli COM marcati con FITC (1000 µg di cristallo/ml di mezzo) in un'incubatrice umidificata con il 5% di CO2 a 37°C per 1 ora. Successivamente, le cellule sono state lavate con PBS e incubate con una soluzione di tripsina-EDTA per eliminare i cristalli non interiorizzati (sia aderenti che non aderenti). La percentuale delle cellule con cristalli interiorizzati è stata quantificata da un totale di 10.000 eventi acquisiti utilizzando un citometro a flusso (BD Accuri C6) (BD Biosciences; San Jose, CA). Le cellule incubate con cristalli COM semplici (non etichettati) sono state utilizzate per preimpostare il rumore e la soglia per il segnale di fluorescenza positiva. Le cellule con segnali di fluorescenza positivi sono state quindi contate e utilizzate per tale calcolo percentuale.
2.8. Invasione di cristalli COM tramite test ECM
I cristalli COM sono stati preparati come descritto sopra per l'aggregazione dei cristalli e i saggi di adesione delle cellule cristalline. Il saggio di invasione dei cristalli è stato eseguito secondo il protocollo stabilito in precedenza [38,39]. In breve, un totale di 20 µg di cristalli COM rivestiti con tampone di cristallizzazione (controllo bianco), DMSO (controllo negativo), albumina (Sigma-Aldrich) (controllo positivo) odiosmin(2,5, 5, 1{{10}}, 20, 40, 80 o 160 nM) sono stati aggiunti a 200 ul MEM. Successivamente, 200 ul di Lys-plasminogeno 0,3 pM (Fitzgerald Industries International; Acton, MA) in PBS sono stati miscelati e incubati con il complesso proteico-cristallo a 37°C per 1 ora. Il plasminogeno non legato è stato scartato mediante centrifugazione a 2000 g per 5 minuti e il pellet è stato lavato con PBS una volta. Successivamente, 100 ul di attivatore del plasminogeno dell'urochinasi 0,15 pM (uPA) (Fitzgerald Industries International) in PBS sono stati miscelati con il complesso cristallo-proteina-plasminogeno/plasmina. La miscela è stata quindi aggiunta sopra il gel matrice all'interno della camera di migrazione ECM e incubata a 37 ◦C. Dopo 24-h di incubazione, la soluzione rimasta nella parte superiore della camera di migrazione è stata rimossa utilizzando una garza o carta velina. I cristalli COM invasi all'interno del gel matrice sono stati quindi ripresi utilizzando un microscopio ottico con modalità di contrasto di interferenza differenziale (DIC) (Nikon H600L). La distanza di invasione dei cristalli è stata misurata e calcolata in media da almeno 15 campi a bassa potenza (LPF) all'interno della stessa camera utilizzando il software NIS Element D versione 4.11 (Nikon).
2.9. analisi statistica
Tutti gli esperimenti di cui sopra sono stati eseguiti in triplicato (tre esperimenti indipendenti) e i dati quantitativi sono riportati come media ± SEM. Sono stati eseguiti confronti multipli utilizzando l'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA) con il test post-hoc di Tukey. Il test di correlazione di Pearson è stato eseguito per determinare la relazione tra le variabili. Tutte le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il software SPSS (versione 18) (IBM SPSS; Armonk, NY). Il valore P inferiore a 0.05 è stato considerato statisticamente significativo.
3. Risultati
3.1. Effetto della diosmina sulla cristallizzazione della COM
La cristallizzazione è uno dei primi passi essenziali direneprocessi di formazione della pietra di ogni tipo. Dopo 1-h cristallizzazione con o senzadiosmina varie concentrazioni (2,5, 5, 10, 20, 40, 80 o 160 nM), sono state misurate le dimensioni e il numero dei cristalli di COM ed è stata calcolata la massa dei cristalli. Il tampone di cristallizzazione e il diluente DMSO sono serviti rispettivamente come controlli in bianco e negativo. I dati hanno mostrato che tutte le dosi (2,5–160 nM) di disomina hanno ridotto significativamente le dimensioni dei cristalli ma hanno aumentato il numero di cristalli in modo dose-dipendente rispetto ai controlli in bianco e negativi (Fig. 1A–1C). In accordo con il numero di cristalli, la massa cristallina è aumentata in modo dose-dipendente (Fig. 1D). Nel complesso, questi dati indicano che la diosmina promuove la cristallizzazione delle COM (neocristalli).
3.2. Effetto della diosmina sulla crescita dei cristalli COM
L'effetto modulatorio didiosminsu COM la crescita dei cristalli è stata valutata misurando il cambiamento nella dimensione del cristallo (Δ dimensione del cristallo) dopo 60-min un'ulteriore incubazione dopo il completamento della fase di cristallizzazione iniziale, quando i neocristalli erano assenti. I risultati hanno dimostrato che tutte le dosi (2,5–160 nM) di disomina hanno ridotto significativamente la dimensione del cristallo Δ in modo dose-dipendente rispetto al bianco e ai controlli negativi (Fig. 2). Questi risultati indicano che la diosmina inibisce la crescita dei cristalli di COM.
3.3. Effetto della diosmina sull'aggregazione dei cristalli COM
Oltre alla crescita dei cristalli, l'aggregazione dei singoli cristalli che aderiscono strettamente insieme è un altro passo importante duranterenepatogenesi della pietra. L'alto grado di aggregazione dei cristalli può in definitiva portare all'allargamento dei calcoli e all'ostruzione del piccolo lume tubulare renale. Confrontando i controlli in bianco e negativi,diosmina 10–160 nM aumenta in modo dose-dipendente il numero degli aggregati di cristallo COM (Fig. 3). Questi risultati indicano che la diosmina promuove l'aggregazione dei cristalli COM.
Cistanche per la funzionalità renale
3.4. Effetto della diosmina sull'adesione dei cristalli COM
La ritenzione dei cristalli causali è uno dei passaggi cruciali perreneformazione di calcoli e può essere indotto dall'adesione delle cellule cristalline che impedisce ai cristalli di espellere insieme al deflusso di urina. Abbiamo quindi valutato l'attività modulatoria didiosminsu COM adesione cristallo-cellula. I dati hanno rivelato che la diosmina a 5–160 nM ha ridotto significativamente la capacità adesiva dei cristalli di COM sulle cellule tubulari renali in modo dose-dipendente rispetto ai controlli in bianco e negativi (Fig. 4). Questi dati indicano che la diosmina inibisce l'adesione delle cellule cristalline COM.
3.5. Effetto della diosmina sull'internalizzazione dei cristalli di COM nelle cellule tubulari renali
Dopo l'adesione, alcuni cristalli di COM possono essere interiorizzati nelle cellule tubulari renali e causare diverse risposte cellulari successive [37,40]. L'internalizzazione dei cristalli è stata valutata utilizzando cristalli COM marcati con FITC e quantificata mediante citometria a flusso. I cristalli COM semplici (senza etichettatura) sono stati utilizzati per sottrarre il rumore tecnico e per garantire che l'intensità della fluorescenza provenisse dal segnale FITC. Confrontando con i controlli in bianco e negativi, la percentuale di cellule con cristalli interiorizzati è stata significativamente ridottadiosmina 10–160 nM in modo dose-dipendente (Fig. 5). I risultati indicano che la disomina inibisce l'internalizzazione dei cristalli di COM nelle cellule tubulari renali.
3.6. Effetto della diosmina sull'invasione dei cristalli COM tramite ECM
L'invasione dei cristalli attraverso l'ECM è un processo patogeno/distruttivo duranterenepatogenesi dei calcoli che possono innescare varie risposte e cascate infiammatorie, peggiorando così i meccanismi della malattia. Abbiamo esaminato questo fenomeno utilizzando un protocollo consolidato basato sull'attività plasminogeno-plasmina del complesso cristallo-proteina [38,39]. I risultati hanno mostrato che tutte le dosi di disomina (2,5–160 nM) hanno migliorato significativamente l'invasione dei cristalli di COM attraverso l'ECM in modo dose-dipendente (Fig. 6). È interessante notare chediosmina 160 nM potrebbe promuovere l'invasione dei cristalli COM paragonabile all'albumina, che è il noto potente promotore dell'invasione dei cristalli COM [41] (Fig. 6). Questi risultati indicano che la diosmina promuove fortemente l'invasione dei cristalli COM attraverso l'ECM.
Fig. 1. Effetto didiosminsulla cristallizzazione COM. Il saggio di cristallizzazione è stato eseguito con un volume uguale (4ul) di tampone di cristallizzazione (controllo in bianco), DMSO (controllo negativo) o diosmina (2,5–160 nM). (A): morfologia del cristallo in ogni condizione dopo 1-h cristallizzazione. L'ingrandimento originale era 400× per tutti i pannelli. (B): dimensione del cristallo. (C): numero di cristallo. (D): la massa cristallina (vedi Formula 1 in "Materiali e metodi") è stata analizzata da almeno 100 cristalli in 15 HPF. Ciascuna barra rappresenta la media ±SEM dei dati derivati da 3 esperimenti indipendenti. *=pag< 0.05="" vs.="" blank="" control;="" #="">< 0.05="" vs.="" dmso.="">
Fig. 2. Effetto didiosminsulla crescita dei cristalli COM. Il saggio di crescita dei cristalli è stato eseguito dopo che la cristallizzazione era completa (per prevenire la neocristallizzazione) con un volume uguale (4ul) di tampone di cristallizzazione (controllo in bianco), DMSO (controllo negativo) o diosmina (2,5–160nM). (A): morfologia cristallina in ogni condizione a T0 e T60. L'ingrandimento originale era 400 × per tutti i pannelli. (B)-(J): istogrammi delle dimensioni dei cristalli misurati dai singoli cristalli a T0 e T60 in ciascun gruppo. (K): Δ La dimensione del cristallo (vedi Formula 2 in "Materiali e metodi") è stata analizzata da almeno 100 cristalli in 15 HPF. Ogni barra rappresenta la media ± SEM dei dati derivati da 3 esperimenti indipendenti. *= p < 0,05="" rispetto="" al="" controllo="" vuoto;="" #="p">< 0,05="" rispetto="" a="">
Fig. 3. Effetto didiosminsull'aggregazione di cristalli COM. Il test di aggregazione dei cristalli è stato eseguito con un volume uguale (4ul) di tampone di cristallizzazione (controllo in bianco), DMSO (controllo negativo) o diosmina (2,5–160 nM). (A): micrografie dei cristalli COM aggregati (etichettati con cerchi tratteggiati). L'ingrandimento originale era di 400 × per tutti i pannelli. (B): il numero degli aggregati di cristallo è stato contato da almeno 15 HPF casuali in ciascun pozzetto. Ogni barra rappresenta la media ± SEM dei dati derivati da 3 esperimenti indipendenti. *=pag< 0.05="" vs.="" blank="" control;="" #="p" <="" 0.05="" vs.="" dmso.="">
Fig. 4. Effetto didiosminsu COM adesione cristallo-cellula. Il saggio di adesione delle cellule cristalline è stato eseguito con un volume uguale (4ul) di tampone di cristallizzazione (controllo in bianco), DMSO (controllo negativo) o diosmina (2,5–160 nM). (A): micrografie dei cristalli rimanenti che hanno aderito saldamente al monostrato cellulare dopo aver rimosso i cristalli non legati mediante lavaggi vigorosi con PBS. L'ingrandimento originale era di 200 × per tutti i pannelli. (B): il numero dei cristalli aderiti è stato contato da almeno 15 campi casuali in ciascun pozzetto. Ciascuna barra rappresenta la media ±SEM dei dati derivati da 3 esperimenti indipendenti. *= pag<0.05 vs.="" blank="" control;="" #="p"><0.05 vs.="">
Fig. 5. Effetto didiosminsull'internalizzazione dei cristalli di COM nelle cellule tubulari renali. Il test di interiorizzazione dei cristalli è stato eseguito utilizzando cristalli COM etichettati con FITC (FITC-COM), mentre i cristalli COM semplici (non etichettati) sono stati utilizzati per la sottrazione di fondo/rumore. Il test è stato eseguito con un volume uguale (4ul) di tampone di cristallizzazione (controllo in bianco), DMSO (controllo negativo) o diosmina (2,5–160nM). (A): Analisi citometrica a punti della dimensione (asse y) e dell'intensità della fluorescenza FITC (asse x) delle cellule dopo aver rimosso i cristalli non interiorizzati con 0,1 percento di tripsina/2,5 mM EDTA. (B): percentuale di cellule con cristalli COM etichettati con FITC interiorizzati. Ogni barra rappresenta la media ± SEM dei dati derivati da 3 esperimenti indipendenti. *= pag<0.05 vs.="" fitc-com="" +="" blank="" control;="" #="">< 0.05="" vs.="" fitc-com="" +="" dmso.="">
Fig. 6. Effetto didiosminsull'invasione di cristalli COM attraverso l'ECM. L'invasione dei cristalli attraverso il test ECM è stata eseguita utilizzando cristalli COM rivestiti con tampone di cristallizzazione (controllo vuoto), DMSO (controllo negativo), albumina (controllo positivo) o diosmina (2,5–160 nM). (A): le micrografie dei cristalli COM hanno invaso o migrato attraverso la camera di migrazione ECM. L'ingrandimento originale era 100 × per tutti i pannelli. (B): la distanza di invasione dei cristalli è stata misurata da almeno 15 LPF casuali in ciascuna camera. Ciascuna barra rappresenta la media ±SEM dei dati derivati da 3 esperimenti indipendenti. *= pag<0.05 vs.="" blank="" control;="" #="p" <="" 0.05="" vs.="">
4. Discussione
La malattia dei calcoli renali è causata dalla formazione di calcoli all'interno delrenee sistema pelvico. I comuni processi di formazione di calcoli renali includono la cristallizzazione, la crescita, l'aggregazione, la ritenzione di cellule cristalline e l'invasione attraverso l'interstizio renale ricco di ECM [21,22]. Ci sono diversi tentativi per prevenire questa malattia usando una varietà di farmaci e/o integratori alimentari. Molte linee di prove recenti hanno riportato che i flavonoidi, i glicosidi flavonici e altri composti estratti dagli agrumi possono avere effetti preventivi sulla malattia dei calcoli renali e altri disturbi [23-25]. Tra questi,diosmin, un flavone glicoside naturale e un derivato dell'esperidina che si trova principalmente negli agrumi [1,2], è stato suggerito che svolga un ruolo preventivo contro lesioni e danni direnetessuto [13,42]. Inoltre, il suo ruolo anti-urolitiasi è stato riportato in alcuni studi precedenti su modelli animali [26,27]. Tuttavia, gli effetti benefici ei meccanismi alla base della diosmina nella prevenzione dei calcoli renali sono rimasti confusi. Abbiamo quindi esaminato l'attività modulatoria della diosmina sui cristalli COM. Le analisi sistematiche sono state effettuate su varie fasi del COMreneformazione di calcoli, inclusa la cristallizzazione, la crescita dei cristalli, l'aggregazione, l'adesione delle cellule cristalline, l'interiorizzazione nelle cellule tubulari renali e l'invasione tramite ECM.
Dopo assunzione orale didiosmin, il suo livello plasmatico nell'uomo varia da {0}},5 a 200 ng/ml (o 0,8–300 nM) [43,44]. La concentrazione plasmatica massima (Cmax) è di circa 50 ng/ml (o 85 nM) [43,44]. Pertanto, i dosaggi di diosmina utilizzati nel nostro studio (2,5-160 nM) erano nell'intervallo farmacologicamente rilevante per la sua farmacocinetica. Poiché il DMSO è stato utilizzato come diluente per dissolvere completamente la diosmina secondo la raccomandazione, il DMSO è stato utilizzato come controllo negativo in questo studio oltre al controllo in bianco per garantire che non vi fossero effetti dal diluente stesso che potrebbero interferire con l'interpretazione dei dati. In tutti i test, i dati hanno mostrato che non sono stati osservati effetti significativi dal DMSO e tutti i dati quantitativi derivati dal controllo negativo erano paragonabili a quelli del controllo in bianco.
Il test di cristallizzazione COM ha rivelato che tutte le concentrazioni didiosmin(2,5, 5, 10, 20, 40, 80 e 160 nM) potrebbe ridurre le dimensioni dei cristalli COM ma, d'altra parte, aumentare il numero di cristalli. Poiché la massa cristallina è il prodotto finale sia della dimensione che del numero dei cristalli ed è più rilevante per riflettere il grado di cristallizzazione COM, abbiamo quindi valutato se la diosmina ha influenzato questo indice di cristallo. I dati hanno mostrato che tutte le concentrazioni di diosmina hanno avuto l'effetto di promozione sulla massa cristallina COM, coerentemente con i dati sul numero di cristalli. Dopo la cristallizzazione, i cristalli COM possono crescere ulteriormente fino a raggiungere dimensioni maggiori per il passaggio successivoreneformazione di pietre.
Contrariamente alla cristallizzazione, la diosmina a tutte le concentrazioni ha mostrato l'effetto inibitorio sulla crescita dei cristalli di COM in modo dose-dipendente. Alcuni studi precedenti hanno riportato che la solubilità dei cristalli di CaOx può essere aumentata da derivati degli idrossiantrachinoni con glicosilazione [45]. Inoltre, la presenza di zuccheri in tali composti bioattivi può legarsi con lo ione calcio libero forse a causa dei gruppi ossidrile nella struttura molecolare, inibendo così la formazione di cristalli di CaOx [45,46]. La diosmina potrebbe anche influenzare la transizione degli ioni calcio e ossalato solubilizzati nelle particelle cristalline COM nel fluido tubulare renale nel processo di cristallizzazione COM basato su questo meccanismo.
Tuttavia, l'aggregazione dei cristalli COM è stata promossa da 10–160 nMdiosmin, implicando la capacità della diosmina di agire come legante o molecola adesiva per reclutare singoli cristalli per legarsi insieme per formare gli aggregati cristallini. Questo legame provoca anche la progressione di ponti adesivi tra i singoli cristalli e può indurre la formazione di grandi strutture di cristalli COM, che contribuiscono facilmente alla deposizione di nidus di pietra all'interno delrene[32].
La ritenzione dei cristalli di COM attraverso l'adesione dei cristalli sulle superfici delle cellule tubulari renali è stata stabilita come un altro passo importante per la formazione di calcoli renali [47]. I nostri dati hanno rivelato che la diosmina potrebbe ridurre la capacità adesiva dei cristalli COM di legarsi con le superfici apicali delle cellule tubulari renali MDCK. Alcuni studi precedenti hanno dimostrato che i glicosaminoglicani (composti polisaccaridici) rivestiti su cristalli di CaOx o espressi su cellule tubulari renali possono interferire con la capacità adesiva dei cristalli di CaOx sulle cellule tubulari renali [48]. Inoltre, l'espressione dei recettori cristallini sulle cellule tubulari renali è uno dei meccanismi cruciali che determinano l'adesione delle cellule cristalline [21]. Mentre i cristalli di CaOx inducono lesioni delle membrane apicali, in particolare dei microvilli, alcuni polifenoli come l'epigallocatechina gallato (EGCG) possono impedire l'adesione delle cellule cristalline e il danno cellulare [49]. Inoltre, è stato precedentemente riportato che la sostanza flavonoide in vari estratti vegetali aumenta il livello di pH urinario, portando all'inibizione dell'adesione delle cellule cristalline [50,51]. Forse,diosminpotrebbe anche attenuare tale danno cellulare indotto da COM, riducendo così l'adesione delle cellule cristalline.
È stato dimostrato che l'internalizzazione dei cristalli COM appare principalmente per endocitosi attraverso la via della macropinocitosi mediata dal citoscheletro di actina [40]. È stato riportato che i flavonoidi come la quercetina influenzano il citoscheletro di actina necessario per la macropinocitosi [52,53]. I nostri risultati hanno mostrato che la diosmina ha ridotto significativamente la capacità delle cellule MDCK di interiorizzare i cristalli COM. Tale effetto inibitorio della diosmina potrebbe essere associato all'assemblaggio o all'organizzazione del citoscheletro di actina all'interno delle cellule che colpisce direttamente la via della macropinocitosi [54,55].
Dopo l'internalizzazione, i cristalli di COM sono stati degradati dagli endolisosomi con conseguente aumento degli ioni calcio e ossalato liberi nell'interstizio renale [37]. Tali aumenti degli ioni calcio e ossalato possono portare alla neocristallizzazione della COM nell'interstizio renale [56,57]. Inoltre, la presenza di cristalli COM interstiziali può essere dovuta a difetti di giunzione stretta e barriere di adesione paracellulare, con conseguente aumento della permeabilità paracellulare e traslocazione dei cristalli [58-60]. Questi cristalli possono quindi invadere l'interstizio renale attraverso l'ECM e successivamente innescare diverse risposte infiammatorie e danni ai tessuti [58-60]. In questo studio, abbiamo osservato che l'invasione dei cristalli di COM attraverso la camera di migrazione dell'ECM era indotta da tutte le concentrazioni di diosmina. La diosmina potrebbe legarsi alle superfici cristalline della COM e interagire con il sistema plasminogeno-plasmina che guida la migrazione dei cristalli nella camera di migrazione della ECM [38,39].
Cistanche per rene
Perchédiosminindotto sia inibendo che promuovendo effetti su diversi vari processi di formazione di calcoli COM, abbiamo quindi determinato la loro relazione utilizzando il test di correlazione di Pearson. L'analisi di correlazione ha rivelato che il numero di cristalli era inversamente correlato sia con la dimensione del cristallo che con la crescita del cristallo (Δ Dimensione del cristallo) (Fig. 7A e B). La dimensione del cristallo era fortemente correlata alla crescita dei cristalli (Fig. 7C) ma inversamente correlata alla massa cristallina (Fig. 7D). Infine, la massa cristallina era fortemente correlata sia al numero di cristalli che all'aggregazione dei cristalli (Fig. 7E e F). Dall'analisi di correlazione, i dati indicano che il numero e la massa del cristallo sono più rilevanti per riflettere la cristallizzazione rispetto alla dimensione del cristallo (Fig. 7A, D ed E). Inoltre, la dimensione dei neocristalli durante la cristallizzazione è correlata alla crescita dei cristalli preformati (Fig. 7C), mentre il grado di cristallizzazione (come riflesso dal numero di cristalli e dalla massa cristallina) è strettamente correlato al grado di aggregazione dei cristalli (Fig. 7E e F). Tuttavia, queste correlazioni sono molto probabilmente specifiche degli effetti della diosmina, mentre gli effetti di altri modulatori possono avere o meno le stesse correlazioni. Ad esempio, la fibronectina diminuisce la massa cristallina e inibisce la crescita dei cristalli, ma promuove l'aggregazione cristallina [31]. Inoltre, l'Escherichia coli vitale intatto aumenta la dimensione e la massa dei cristalli ma non ha effetti sul numero dei cristalli [33]. Questi dati indicano che le correlazioni tra i vari saggi di cristallo COM non sono universali per tutti i modulatori.
Infine, abbiamo riassunto i risultati ottenuti da vari saggi e li abbiamo integrati con i meccanismi patogeni direnemalattia della pietra (vedi schemi in Fig. 8). Dall'analisi di correlazione, la diosmina promuove la cristallizzazione (Fig. 8A). Tra cristallizzazione e crescita dei cristalli,diosminmantiene un buon equilibrio favorendo la cristallizzazione ma, d'altra parte, inibendo la crescita dei cristalli (Fig. 8B). Per quanto riguarda tutti gli effetti sui soli cristalli di COM (senza considerare le cellule e l'ECM che intervengono anche), l'attività promotrice della diosmina è più prominente della sua attività inibente sui cristalli di COM poiché promuove sia la cristallizzazione che l'aggregazione dei cristalli, ma inibisce solo la crescita dei cristalli ( Fig. 8C). Sebbene la cristallizzazione aumenti, la dimensione del cristallo diminuisce ed è associata all'inibizione della crescita (Fig. 7C). Questi dati sono coerenti con i risultati riportati da Kavanagh et al. [61-63], dimostrando che l'aumento della cristallizzazione porta al declino della sovrasaturazione degli ioni calcio e ossalato nella soluzione, diminuendo così la crescita. Tuttavia, la crescita dei cristalli non è l'unico fattore che determina ilrenepatogenesi del calcolo [64], in particolare quando la massa cristallina travolge ed è associata all'aumento dell'aggregazione cristallina (Fig. 7F) che può aumentare la possibilità che i materiali cristallini si blocchino in piccoli segmenti tubolari (nell'ipotesi intratubulare), aumentando così possibilità di formazione di pietre. Inoltre, uno studio precedente ha mostrato dati coerenti con i nostri risultati, indicando che l'aumento del numero di cristalli è associato all'aumento dell'aggregazione cristallina e all'allargamento della pietra [63].
Fig. 7. Analisi delle correlazioni. (A)–(F): le correlazioni tra il numero del cristallo COM, la dimensione del cristallo, la dimensione del cristallo Δ, la massa del cristallo e un numero di aggregati cristallini sono state analizzate mediante il test di correlazione di Pearson.
Fig. 8. Schemi che riassumono gli effetti modulatori didiosminsu COMreneprocessi di formazione della pietra. (A): Effetti della diosmina sulla cristallizzazione COM. (B): Effetti della diosmina sulla cristallizzazione COM e sulla crescita dei cristalli. (C): Effetti della diosmina sulla cristallizzazione, crescita e aggregazione di COM. (D): Effetti della diosmina sull'intero processo di formazione dei calcoli renali COM.
Quando si considerano le interazioni con le cellule tubulari renali e l'ECM, il quadro globale dei doppi effetti didiosminsu COM la formazione di calcoli renali diventa molto più chiara (Fig. 8D). La diosmina inibisce l'adesione delle cellule cristalline, riducendo così l'internalizzazione dei cristalli nelle cellule. Ciò può essere spiegato che la dimensione più piccola dei cristalli COM ha una capacità adesiva minore di legare le cellule tubulari renali rispetto a quelle più grandi, come riportato nel nostro recente studio [34] e in uno studio precedente di un altro gruppo [65]. La minore capacità adesiva dei cristalli COM più piccoli è dovuta alla loro minore forza adesiva sulla superficie cellulare e al minor numero di recettori dei cristalli COM legati ad essi, come determinato rispettivamente dalla microscopia a forza atomica e dall'analisi del proteoma [34]. La diosmina inibisce anche l'interiorizzazione dei cristalli. Si noti che il processo di interiorizzazione è un'arma a doppio taglio che necessita di un'attenta interpretazione. L'interiorizzazione o endocitosi in uno dei meccanismi di difesa che le cellule utilizzavano per l'eliminazione dei cristalli da parte degli endolisosomi. Tuttavia, la degradazione dei cristalli intatti genera ioni calcio e ossalato liberi che possono spostarsi dal compartimento intracellulare all'interstizio renale, dove possono generare neocristalli [56,57]. D'altra parte, la diosmina promuove l'invasione dei cristalli attraverso l'ECM, che è uno dei meccanismi importanti per la patogenesi dei calcoli renali (in particolare nel modello della placca di Randall) [58-60]. Nel complesso, la Fig. 8D riassume tutti i doppi effetti modulatori della diosmina su COMreneprocessi di formazione della pietra. Va notato che l'equilibrio di questi effetti di promozione e di inibizione non può essere calcolato con precisione (a differenza di un'equazione matematica). Inoltre, ci sono molti altri fattori endogeni ed esogeni che possono intervenire anche sui processi di formazione dei calcoli. Infine, la diosmina mostra anche diversi effetti indiretti sulla formazione di calcoli renali, comprese le sue proprietà antiossidanti e antinfiammatorie [5,6] che dovrebbero essere prese in considerazione. Pertanto, il risultato finale di questi doppi effetti modulatori didiosminsu COMrenela formazione di calcoli necessita di ulteriori indagini in vivo e di uno studio prospettico di ampia coorte.
5. Conclusioni
In sintesi, riportiamo qui i doppi effetti della diosmina sulla modulazione del cristallo COM in modo dose-dipendente. Mentre inibisce la crescita dei cristalli COM, l'adesione delle cellule cristalline e l'interiorizzazione nelle cellule tubulari renali,diosminpromuove la cristallizzazione, l'aggregazione e l'invasione delle COM attraverso l'ECM. Pertanto, il suo ruolo anti-urolitiasi è dubbio e dovrebbero essere fatte precauzioni per il suo uso nella malattia dei calcoli renali.
Dichiarazione di contributo della paternità di CRdiT
Supaporn Khamchun: Conceptualization, Methodology, Software, Validation, Formal analysis, Investigation, Data curation, Writing – original draft, Visualization, Sunisa Yoodee: Conceptualization, Methodology, Software, Validation, Formal analysis, Investigation, Data curation, Writing – original draft, Visualizzazione, Visit Thongboonkerd: concettualizzazione, metodologia, software, convalida, risorse, scrittura - revisione e modifica, supervisione, amministrazione del progetto, acquisizione di finanziamenti.
Dichiarazione di conflitto di interessi
Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interesse.
Ringraziamenti
Siamo grati per l'assistenza tecnica di Kittiya Suwannakud. Questo lavoro è stato sostenuto dall'Office of National Higher Education Science Research and Innovation Policy Council (NXPO) attraverso PMU-B e il Thailand Research Fund (IRN60W0004). VT è anche sostenuto dalla borsa di studio "Chalermphrakiat", Facoltà di Medicina dell'ospedale Siriraj.
Riferimenti
[1] A. Bogucka-Kocka, M. Wozniak, M. Feldo, J. Kockic, K. Szewczyk,Diosmin– tecniche di isolamento, determinazione in materiale vegetale e formulazioni farmaceutiche e uso clinico, Nat. prod. Comune. 8 (2013) 545–550.
[2] Y. Zheng, R. Zhang, W. Shi, L. Li, H. Liu, Z. Chen, L. Wu, Metabolismo e attività farmacologiche del composto naturale benefico per la salute diosmina, Food Funct. 11 (2020) 8472–8492.
[3] Sig. Cesarone, G. Belcaro, L. Pellegrini, A. Ledda, G. Vinciguerra, A. Ricci, A. Di Renzo, I. Ruffini, G. Gizzi, E. Ippolito, F. Fano, M. Dugall , G. Acerbi, U. Cornelli, M. Hosoi, M. Cacchio, Venoruton vs Daflon: valutazione degli effetti sulla qualità della vita nell'insufficienza venosa cronica, Angiology 57 (2006) 131–138.
[4] KA Lyseng-Williamson, CM Perry, Frazione flavonoide purificata micronizzata: una revisione del suo uso nell'insufficienza venosa cronica, nelle ulcere venose e nelle emorroidi, Drugs 63 (2003) 71–100.
[5] AS Shalkami, M. Hassan, AG Bakr, Anti-infiammatorio, l'attività antiossidante e anti-apoptotica della diosmina nella colite ulcerosa indotta da acido acetico, Hum. esp. Tossico. 37 (2018) 78–{7}}.
[6] M. Berkoz, Diosmin sopprime i mediatori proinfiammatori nei macrofagi RAW264.7 indotti da lipopolisaccaridi tramite le vie del segnale NF-kappaB e MAPKs, Gen. Physiol. Biofis. 38 (2019) 315–324.
[7] M. Rajasekar, K. Suresh, K. Sivakumar, Diosmin inducono l'apoptosi attraverso la modulazione della segnalazione STAT-3 in 7,12 dimetilbenz(a)antracene indotta da cancerogenesi della tasca buccale del danno, Biomed. Farma. 83 (2016) 1064–1070.
[8] A. Lewinska, J. Adamczyk-Grochala, E. Kwasniewicz, A. Deregowska, M. Wnuk, senescenza indotta da diosmina, apoptosi e autofagia in cellule di cancro al seno di diverso stato p53 e attività ERK, Toxicol. Lett. 265 (2017) 117–130.
[9] AC Pushkaran, V. Vinod, M. Vanuopadath, SS Nair, SV Nair, AK Vasudevan, R. Biswas, CG Mohan, La combinazione di diosmina del farmaco riproposta con acido amoxicillina-clavulanico provoca un'inibizione sinergica della crescita dei micobatteri, Sci. Rep. 9 (2019) 6800.
[10] CC Hsu, MH Lin, JT Cheng, MC Wu, l'azione antiiperglicemizzante della diosmina, un flavonoide degli agrumi, è indotta attraverso la beta-endorfina endogena nei ratti diabetici di tipo I, Clin. esp. Farma. Fisio. 44 (2017) 549–555.
[11] O. Senthamizhselvan, J. Manivannan, T. Silambarasan, B. Raja,Diosminil pretrattamento migliora la funzione cardiaca e sopprime lo stress ossidativo nel cuore di ratto dopo ischemia/riperfusione, Eur. J. Pharm. 736 (2014) 131–137.
[12] N. Tong, Z. Zhang, Y. Gong, L. Yin, X. Wu, Diosmin protegge la retina del ratto dal danno da ischemia/riperfusione, J. Ocul. Farma. Là. 28 (2012) 459–466.
[13] AE Elhelaly, G. AlBasher, S. Alfarraj, R. Almeer, EI Bahbah, MMA Fouda, SG Bungau, L. Aleya, MM Abdel-Daim, Effetti protettivi di esperidina e diosmina contro fegato, rene, e danno ossidativo cerebrale nei ratti, Environ. Sci. Inquinare. ris. int. 26 (2019) 35151–35162.
[14] C. Thongprayoon, AE Krambeck, AD Rule, Determinazione del vero onere direnemalattia della pietra, Nat. Rev. Nephrol. 16 (2020) 736–746.
[15] K. Bishop, T. Momah, J. Ricks, Nefrolitiasi, Prim. Cura 47 (2020) 661–671.
[16] A. Viljoen, R. Chaudhry, J. Bycroft, Calcoli renali, Ann. Clin. Biochimica 56 (2019) 15–27.
[17] PM Ferraro, R. Marano, A. Primiano, J. Gervasoni, M. Bargagli, G. Rovere, PF Bassi, G. Gambaro, Composizione della pietra e calcificazioni vascolari in pazienti con nefrolitiasi, J. Nephrol. 32 (2019) 589–594.
[18] G. Schubert, Analisi della pietra, Urol. ris. 34 (2006) 146–150.
[19] A. Vinaiphat, S. Aluksanasuwan, J. Manissorn, S. Sutthimethakorn, V. Thongboonkerd, Risposta delle cellule tubulari renali a tipi differenziali e dosi di cristalli di ossalato di calcio: analisi della rete di proteoma integrativa e indagini funzionali, Proteomica 17 (2017 ), 1700192.
[20] P. Peerapen, S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Analisi della rete proteica e studi funzionali della citotossicità indotta da cristalli di ossalato di calcio nelle cellule epiteliali tubulari renali, Proteomics 18 (2018), 1800008.
[21] KP Aggarwal, S. Narula, M. Kakkar, C. Tandon, Nefrolitiasi: meccanismo molecolare della formazione di calcoli renali e ruolo critico svolto dai modulatori, Biomed. ris. int. 2013 (2013), 292953.
[22] VN Ratkalkar, JG Kleinman, Meccanismi di formazione dei calcoli, Clin. Rev. Minatore d'ossa. Metab. 9 (2011) 187–197.
[23] X. Zeng, Y. Xi, W. Jiang, ruoli protettivi di flavonoidi ed estratti vegetali ricchi di flavonoidi contro l'urolitiasi: una recensione, Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 59 (2019) 2125–2135.
[24] MC Nirumand, M. Hajialyani, R. Rahimi, MH Farzaei, S. Zingue, SM Nabavi, A. Bishayee, Piante dietetiche per la prevenzione e la gestione direnecalcoli: evidenza preclinica e clinica e meccanismi molecolari, Int. J. Mol. Sci. 19 (2018) 765.
[25] S. Ahmed, MM Hasan, H. Khan, ZA Mahmood, S. Patel, L'intuizione meccanicistica dei polifenoli nella mitigazione dell'urolitiasi di ossalato di calcio, Biomed. Farma. 106 (2018) 1292–1299.
[26] VV Prabhu, D. Sathyamurthy, A. Ramasamy, S. Das, M. Anuradha, S. Pachiappan, Valutazione degli effetti protettivi della diosmina (un flavonoide di agrumi) nell'urolitiasi indotta da sostanze chimiche nei ratti sperimentali, Pharm. Biol. 54 (2016) 1513–1521.
[27] A. Noorafshan, S. Karbalay-Doust, F. Karimi,Diosminriduce la deposizione di ossalato di calcio e la degenerazione dei tessuti nella nefrolitiasi nei ratti: uno studio stereologico, coreano J. Urol. 54 (2013) 252–257.
[28] V. Thongboonkerd, T. Semangoen, S. Chutipongtanate, Fattori che determinano tipi e morfologie dei cristalli di ossalato di calcio: concentrazioni molari, tamponamento, pH, agitazione e temperatura, Clin. Chim. Acta 367 (2006) 120–131.
[29] V. Thongboonkerd, T. Semangoen, S. Sinchaikul, ST Chen, Analisi proteomica della citotossicità indotta da cristalli di ossalato di calcio monoidrato nelle cellule tubulari renali distali, J. Proteome Res. 7 (2008) 4689–4700.
[30] P. Amimanan, R. Tavichakorntrakool, K. Fong-ngern, P. Sribenjalux, A. Lulitanond, V. Prasongwatana, C. Wongkham, P. Boonsiri, WJ Umka, V. Thongboonkerd, Fattore di allungamento Tu su Escherichia coli isolato dalle urine di pazienti con calcoli renali promuove la crescita e l'aggregazione dei cristalli di ossalato di calcio, Sci. Rep. 7 (2017) 2953.
[31] S. Khamchun, K. Sueksakit, S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Effetti modulatori della fibronectina sulla cristallizzazione dell'ossalato di calcio, crescita, aggregazione, adesione sulle cellule tubulari renali e invasione attraverso la matrice extracellulare, J. Biol. Inorg. Chimica. 24 (2019) 235–246.
[32] S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Definizione e analisi sistematiche degli indici di aggregazione per valutare il grado di aggregazione dei cristalli di ossalato di calcio, Front. Chimica. 5 (2017) 113.
[33] R. Kanlaya, O. Naruepantawart, V. Thongboonkerd, Flagellum è responsabile della promozione degli effetti dell'Escherichia coli vitale sulla cristallizzazione dell'ossalato di calcio, sulla crescita dei cristalli e sull'aggregazione dei cristalli, Front. microbiolo 10 (2019) 2507.
[34] P. Peerapen, V. Thongboonkerd, Proteine a legame differenziale e capacità adesive di cristalli di ossalato di calcio monoidrato di varie dimensioni, Int. J. Biol. Macromol. 163 (2020) 2210–2223.
[35] K. Fong-ngern, K. Sueksakit, V. Thongboonkerd, Surface heat shock protein 90 funge da potenziale recettore per il cristallo di ossalato di calcio sulla membrana apicale delle cellule epiteliali tubulari renali, J. Biol. Inorg. Chimica. 21 (2016) 463–474.
[36] S. Chaiyarit, S. Mungdee, V. Thongboonkerd, Etichettatura non radioattiva di cristalli di ossalato di calcio per indagini sull'interazione e interiorizzazione delle cellule cristallo, Anal. Metodi 2 (2010) 1536–1541.
[37] S. Chaiyarit, N. Singhto, V. Thongboonkerd, I cristalli di ossalato di calcio monoidrato interiorizzati nelle cellule tubulari renali vengono degradati e disciolti dagli endolisosomi, Chem. Biol. Interagire. 246 (2016) 30–35.
[38] W. Chiangjong, V. Thongboonkerd, Un nuovo saggio per valutare la promozione degli effetti delle proteine sull'invasione dei cristalli di ossalato di calcio attraverso la matrice extracellulare basata sull'attività del plasminogeno/plasmina, Talanta 101 (2012) 240–245.
[39] W. Chiangjong, V. Thongboonkerd, I cristalli di ossalato di calcio hanno aumentato la secrezione di enolasi-1 dalle cellule tubulari renali che successivamente hanno aumentato l'invasione di cristalli e monociti attraverso l'interstizio renale, Sci. Rep. 6 (2016) 24064.
[40] R. Kanlaya, K. Sintiprungrat, S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, La macropinocitosi è il principale meccanismo di endocitosi dei cristalli di ossalato di calcio nelle cellule tubulari renali, Cell Biochem. Biofis. 67 (2013) 1171–1179.
[41] S. Sassanarakkit, P. Peerapen, V. Thongboonkerd, StoneMod: un database perreneproteine modulatrici di pietra con evidenza sperimentale, Sci. Rep. 10 (2020) 15109.
[42] G. Eraslan, ZS Sarica, LC Bayram, MY Tekeli, M. Kanbur, M. Karabacak, Gli effetti della diosmina sul danno epatico e renale indotto da aflatossina, Environ. Sci. Inquinare. ris. int. 24 (2017) 27931–27941.
[43] R. Russo, D. Chandradhara, N. De Tommasi, Biodisponibilità comparativa di duediosminformulazioni dopo somministrazione orale a volontari sani, Molecules 23 (2018) 2174.
[44] JQ Silveira, TB Cesar, JA Manthey, EA Baldwin, J. Bai, S. Raithore, Pharmacokinetics of flavanone glycosides dopo l'ingestione di singole dosi di succo d'arancia appena spremuto rispetto al succo d'arancia trasformato commercialmente in esseri umani sani, J. Agric . Chimica alimentare. 62 (2014) 12576–12584.
[45] A. Frackowiak, P. Skibinski, W. Gawel, E. Zaczynska, A. Czarny, R. Gancarz, Sintesi di derivati glicosidici dell'idrossiantrachinone con capacità di dissolvere e inibire la formazione di cristalli di ossalato di calcio. Composti potenziali nella terapia dei calcoli renali, Eur. J. Med. Chimica. 45 (2010) 1001–1007.
[46] F. Grases, J. Perello, B. Isern, RM Prieto, Studio di una crema a base di mio-inositolo esafosfato per prevenire la calcinosi cutanea distrofica, fr. J. Dermatol. 152 (2005) 1022–1025.
[47] V. Thongboonkerd, Proteomics of crystal-cell interactions: un modello per la ricerca sui calcoli renali, Cells 8 (2019) 1076.
[48] CF Verkoelen, Ritenzione di cristalli nella malattia renale: un ruolo cruciale per il glicosaminoglicano ialuronano? Marmellata. soc. nefrolo. 17 (2006) 1673–1687.
[49] K. Fong-ngern, A. Vinaiphat, V. Thongboonkerd, Lesione microvillare nelle cellule epiteliali tubulari renali indotta dal cristallo di ossalato di calcio e il ruolo protettivo dell'epigallocatechina-3-gallato, FASEB J. 31 (2017) 120 –131.
[50] J. Zhou, J. Jin, X. Li, Z. Zhao, L. Zhang, Q. Wang, J. Li, Q. Zhang, S. Xiang, I flavonoidi totali di Desmodium styracifolium attenuano la formazione di idrossi- Urolitiasi di ossalato di calcio indotta da L-prolina nei ratti, Urolithiasis 46 (2018) 231–241.
[51] J. Manissorn, K. Fong-ngern, P. Peerapen, V. Thongboonkerd, Valutazione sistematica degli effetti del pH delle urine sulla cristallizzazione dell'ossalato di calcio, adesione delle cellule cristalline e interiorizzazione nelle cellule tubulari renali, Sci. Rep. 7 (2017) 1798.
[52] S. Cui, J. Qian, P. Bo, Effetto inibitorio sulla fagocitosi di Candida albicans indotta dal pretrattamento con quercetina tramite interferenza del citoscheletro di actina, J. Tradit. Mento. Med. 33 (2013) 804–809.
[53] S. Cui, Q. Wu, J. Wang, M. Li, J. Qian, S. Li, Quercetin inibisce la migrazione dei macrofagi indotta da LPS sopprimendo la via iNOS/FAK/paxillina e modulando il citoscheletro, Cell Adhes . Migr. 13 (2019) 1–12.
[54] Y. Li, WG Gonzalez, A. Andreev, W. Tang, S. Gandhi, A. Cunha, D. Prober, C. Lois, ME Bronner, Il riciclaggio della membrana mediato dalla macropinocitosi guida la migrazione della cresta neurale fornendo F- actina al lamellipodio, Proc. Natl. Accad. Sci. USA 117 (2020) 27400–27411.
[55] H. Inaba, K. Yoda, H. Adachi, Il RapGEF GflB legante l'F-actina è necessario per una macropinocitosi efficiente in Dictyostelium, J. Cell Sci. 130 (2017) 3158–3172.
[56] A. Khan, Prevalenza, meccanismi fisiopatologici e fattori che influenzano l'urolitiasi, Int. Urolo. nefrolo. 50 (2018) 799–806.
[57] AP Evan, EM Worcester, FL Coe, J. Williams Jr., JE Lingeman, Meccanismi di formazione di calcoli renali umani, Urolithiasis 43 (Suppl 1) (2015) 19–32.
[58] S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Disfunzione mitocondriale erenemalattia della pietra, anteriore. Fisio. 11 (2020), 566506.
[59] SR Khan, Aspetti istologici del modello di formazione dei calcoli a "particelle fisse": studi sugli animali, Urolithiasis 45 (2017) 75–87.
[60] VY Bird, SR Khan, Come si formano le pietre? È possibile unificare le teorie sulla formazione dei calcoli? Arco. spec. Urolo. 70 (2017) 12–27.
[61] JP Kavanagh, Metodi per lo studio della cristallizzazione dell'ossalato di calcio e loro applicazione alla ricerca sull'urolitiasi, Scanning Microsc. 6 (1992) 685–704, discussione 704-5.
[62] JP Kavanagh, L. Jones, PN Rao, Cinetica di cristallizzazione dell'ossalato di calcio a diverse concentrazioni di urina umana e artificiale, con un rapporto costante di calcio e ossalato, Urol. ris. 27 (1999) 231–237.
[63] NK Saw, PN Rao, JP Kavanagh, A. nidus, cristalluria e aggregazione: ingredienti chiave per l'allargamento della pietra, Urol. ris. 36 (2008) 11–15.
[64] A. Borissova, GE Goltz, JP Kavanagh, TA Wilkins, Reverse engineering the rene: modellazione della cristallizzazione di ossalato di calcio monoidrato nel nefrone, Med. Biol. Ing. Calcola 48 (2010) 649–659.
[65] LA Thurgood, ES Sorensen, RL Ryall, L'effetto dell'osteopontina intracristallina e legata alla superficie sull'attacco di cristalli di ossalato di calcio diidrato alle cellule del rene canino Madin-Darby (MDCK) nell'urina umana ultrafiltrata, BJU Int. 109 (2012) 1100–1109.