Parte 1 L'echinacoside aumenta la quantità di sperma nei ratti prendendo di mira il recettore degli androgeni ipotalamici

Zhihui Jiang1,2, Bo Zhou2, Xinping Li2, Gordon M. Kirby3 e Xiaoying Zhang1,2

L'infertilità maschile è un grave problema di salute con una prevalenza stimata del 4,2% dell'infertilità maschile in tutto il mondo. I nostri primi lavori lo hanno dimostratoEstratti di Cistancheproteggere dai danni allo sperma nei topi e così viaechinacoside(ECH) è uno dei principali componenti attivi. Qui riportiamo un ruolo essenziale per ECH, un prodotto naturale che inverte o protegge dall'aspermia dell'oligoastene nei ratti. L'ECH è stata analizzata mediante HPLC, la quantità e la qualità dello sperma sono state valutate e i livelli ormonali sono stati determinati mediante saggio radioimmunosorbente. L'ECH ha ridotto i livelli del recettore degli androgeni (AR) e dei geni chiave correlati agli steroidi, come determinato dall'analisi Western blot e qPCR. L'interazione tra ECH e AR è stata valutata mediante ELISA indiretto e docking molecolare. I risultati mostrano che ECH combinato con AR ipotalamico nella tasca di Met-894 e Val-713 inibisce il trasferimento di AR dal citoplasma ai nuclei nell'ipotalamo. Mentre il feedback negativo della regolazione dell'ormone sessuale è stato inibito, il feedback positivo è stato stimolato per aumentare la secrezione dell'ormone luteinizzante e del testosterone aumentando successivamente la quantità di sperma. Presi insieme, questi dati dimostrano che l'ECH blocca l'attività AR nell'ipotalamo per aumentare la quantità di spermatozoi e proteggere dall'oligoastenospermia nei ratti.

La produzione di testosterone nelle cellule testicolari è fortemente regolata dall'asse ipotalamo-ipofisi-gonadi (HPG) formando un circuito di feedback omeostatico1. L'ormone di rilascio delle gonadotropine (GnRH), secreto dall'ipotalamo, può stimolare la secrezione dell'ormone luteinizzante (LH) dalla ghiandola pituitaria, che stimola ulteriormentetestosteroneproduzione nelle cellule testicolari di Leydig. Il testosterone è biosintetizzato da una serie di enzimi steroidogenici. Essendo una delle vie principali, la proteina steroidogenica regolatoria acuta (StAR) può trasportare il colesterolo da fonti intracellulari nei mitocondri2 dove viene esposto all'enzima di scissione della catena laterale del colesterolo (CYP11A1), 3 -idrossisteroide deidrogenasi (HSD3 ), { {6}}idrossilasi (CYP17A1) e 17 -idrossisteroide deidrogenasi (HSD 17) che catalizzano la conversione del colesterolo in testosterone3,4. Il testosterone quindi reagisce negativamente all'elemento HPG per sottoregolare ulteriormente la secrezione di LH in modo dose-dipendente. L'effetto del testosterone sul circuito di feedback dell'asse HPG si verifica legandosi al recettore degli androgeni (AR), che si trova sia nell'ipotalamo che nella ghiandola pituitaria5. Nei topi, l'ablazione dell'AR e la produzione minima di testosterone provocano un aumento dei livelli di LH e dell'ormone follicolo-stimolante (FSH), suggerendo che l'AR partecipa alla regolazione del ciclo di alimentazione negativo. Il classico meccanismo genomico ditestosteronela segnalazione si verifica quando il testosterone si diffonde nella cellula e si lega all'AR. Questo complesso ligando-recettore si trasloca quindi nel nucleo dove si lega agli elementi di risposta agli androgeni (ARE) nelle regioni regolatorie dei geni reattivi al testosterone per modificare la loro traslocazione. Il testosterone induce anche la via non classica dell'azione degli ormoni steroidei, caratterizzata da eventi rapidi che portano all'attivazione di cascate di segnalazione citosoliche normalmente innescate da fattori di crescita7,8. Le vie classiche e non classiche del testosterone contribuiscono entrambe al mantenimento della spermatogenesi e della fertilità. Tuttavia, la funzione dell'AR è più importante nella via classica poiché il testosterone agisce per aumentare la qualità dello sperma. L'echinacoside (ECH) è uno dei componenti bioattivi derivati ​​dalle specie di piante medicinali di Echinacea9 eCistanche10. Con un ampio spettro di attività farmacologiche, gli estratti dell'Echinacea sono 1 Centro di ricerca di biotecnologia moderna, Scuola di biotecnologia e ingegneria alimentare, Anyang Institute of Technology, Anyang, Henan, 455000, Cina. 2 College of Veterinary Medicine, Northwest A & F University, Yangling, Shaanxi, 712100, Cina. 3Dipartimento di scienze biomediche, Ontario Veterinary College, University of Guelph, Guelph, Ontario, N1G 2W1, Canada. La corrispondenza e le richieste di materiale devono essere indirizzate a XZ

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uno degli integratori a base di erbe più popolari in Europa e negli Stati Uniti principalmente per le loro proprietà antiossidanti11 e la loro capacità di prevenire il comune raffreddore12. È interessante notare cheCistancheestratti ed ECH sono stati tradizionalmente usati come agente tonico per curare le disfunzioni riproduttive e per aumentare l'attività sessuale maschile nella medicina tradizionale cinese10. Alcuni prodotti OTC diEstrazione di Cistanchesono stati sviluppati come integratori alimentari e stanno guadagnando popolarità nei mercati degli alimenti naturali della Cina e di alcuni altri paesi asiatici (China Food and Drug Administration)13. Tuttavia, i meccanismi alla base dell'azione ECH rimangono poco chiari. L'infertilità maschile è un grave problema di salute con una prevalenza stimata del 4,2% dell'infertilità maschile in tutto il mondo14. La diagnosi di infertilità maschile si basa attualmente sullo studio della qualità dello sperma, compresa l'analisi dei parametri seminali come la concentrazione, la motilità e la morfologia degli spermatozoi15. Il bisfenolo A (BPA) che imita gli estrogeni è un contaminante ambientale diffuso che è stato studiato per il suo impatto sulla fertilità maschile in diverse specie di animali e nell'uomo16. Il BPA interrompe l'asse ipotalamo-ipofisi-gonadi, inibisce l'espressione degli enzimi steroidogenici testicolari e la sintesi del testosterone nei cuccioli maschi17, provocando uno stato di ipogonadismo ipogonadotropo18. In questo studio, indaghiamo gli effetti dell'ECH sulla qualità dello sperma e sui livelli ormonali. Inoltre, il BPA è stato scelto come agente modello di danno allo sperma per studiare ulteriormente l'effetto protettivo dell'ECH contro la scarsa qualità dello sperma.

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Risultati

ECH aumenta la quantità di sperma.

Il numero di spermatozoi nell'epididimo caudale, la vitalità degli spermatozoi e la motilità degli spermatozoi sono presentati nella Tabella 1. Il trattamento con 80 mg/kg di ECH e 15 mg/kg di testosterone propionato (TP) ha aumentato significativamente la conta degli spermatozoi dell'epididimo. Tuttavia, non vi era alcuna differenza significativa nella vitalità degli spermatozoi e nella motilità degli spermatozoi.

L'ECH aumenta i livelli di testosterone e LH nel siero, nell'encefalo più l'ipofisi e nel testicolo.

Il trattamento con ECH ha notevolmente aumentato i livelli di LH nel siero, nell'encefalo più l'ipofisi e nel testicolo (Fig. 1A). Nel gruppo ECH(H), i livelli di LH sono aumentati significativamente di 1.1-volte nel siero, 1.4-volte nell'encefalo più l'ipofisi e 1.2-volte nel testicolo. Il testosterone è aumentato significativamente di 1,5 e 1.3-volte nell'encefalo più l'ipofisi e il testicolo, rispettivamente, ma non nel siero dopo il trattamento con ECH(H). Dopo il trattamento con TP, i livelli di testosterone sono aumentati significativamente di 1,6, 1,8 e 1.4-volte nel siero, nell'encefalo più l'ipofisi e nel testicolo.

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ECH ha aumentato l'espressione genica dell'enzima steroidogenico.

ECHaumentato significativamente le espressioni degli enzimi steroidogenici chiave nel testicolo (Fig. 1B). I livelli di mRNA di CYP11A1, CYP17A1, HSD3 1/2 e HSD17 nel gruppo ECH(H) sono aumentati di più di 3- volte, mentre i livelli di mRNA di StAR non hanno mostrato differenze significative con tutti iECHtreatments (p>0.05). TP non ha alterato in modo significativo l'espressione di CYP11A1, CYP17A1, HSD3 1/2 e HSD17. Ciò si riflette in un'analisi completa della mappa di calore dell'effetto dell'ECH sull'espressione dell'enzima steroidogenico che lo indicaECHlivelli di mRNA significativamente aumentati di CYP11A1, CYP17A1, HSD3 1/2 e HSD17, e in particolare HSD3 1/2 (Fig. 1C).

L'ECC può attraversare la barriera emato-encefalica e, in misura minore, la barriera emato-testicolare.

Per valutare il ciclo di feedback degli androgeni sull'asse HPG, la capacità diECHper entrare nell'ipotalamo è stato valutato in una serie di studi farmacocinetici.ECHle concentrazioni sono state rilevate nell'ipotalamo dopo 12 ore di somministrazione orale singola di 30 mg/kg di ECH e l'ECH ha mostrato una marcata penetranza dell'ipotalamo con il rapporto ipotalamo/plasma medio del 33,92% (Fig. 2A). I valori di T1/2 erano rispettivamente di 2,61±0,42 h e 1,88±0,22 h nel plasma e nell'ipotalamo (Fig. 2B). Tuttavia, utilizzando HPLC è stato rilevato un accesso molto limitato di ECH nel testicolo. Le concentrazioni di ECH nel testicolo erano 0.{{20}} 83 ug/mL, 0,043 ug/mL e 0,028 ug/mL rispettivamente a 0,5, 1 ora e 1,5 ore dopo il trattamento.

L'ECH riduce la traslocazione dell'AR ipotalamica nel nucleo.

Per testare l'effetto diECHsulla traslocazione AR, l'espressione di AR nel citoplasma e nel nucleo del testicolo e dell'ipotalamo è stata determinata mediante analisi western blot. Come mostrato in Fig. 3A, la proteina AR sottoregolata da ECH nei nuclei ipotalamici di cinque volte rispetto al gruppo di controllo. Il trattamento con enzalutamide, un inibitore dell'AR, ha ridotto di 4 volte i livelli della proteina AR nei nuclei ipotalamici. In particolare, l'AR citoplasmatica era più alta con il trattamento ECH e il trattamento con enzalutamide rispetto ai controlli, suggerendo cheECHblocca il trasporto di AR dal citoplasma al nucleo nell'ipotalamo. Come previsto, l'ECH non inibisce il trasporto di AR dal citoplasma al nucleo nel testicolo (Fig. 3B).

ECH ha aumentato le espressioni dei geni correlati all'asse HPG.

ECHaumentato significativamente le espressioni di LH , LHR, GnRH 1 e Gnrhr nei pool di miscele di encefalo più ipofisi, tuttavia, non vi era alcuna differenza significativa nei livelli di GnRH 1 dopo il trattamento con TP. L'analisi della mappa di calore mostra che le espressioni di GnRH 1 e LH erano più alte tra i geni correlati all'asse HPG.

AR è un obiettivo di ECH.

Per confermare le relazioni tra ECH e AR, è stata sintetizzata con successo ECH-Ovalbumin (ECH-OVA) (Fig. 5A, B). Il peso molecolare di ECH-OVA è maggiore di OVA, quindi hanno tassi di mobilità diversi (Fig. 5A) e il picco di assorbanza di ECH-OVA è compreso tra ECH e OVA (Fig. 5B),

suggerendo che ECH è stato coniugato con successo a OVA. I risultati indiretti dell'ELISA (Fig. 5C), mostrano che l'anticorpo anti-AR è in grado di rilevare la proteina AR presente nei pozzetti contenenti ECH-OVA (indicato dall'anticorpo anti-OVA) suggerendo che l'ECH può legarsi alla proteina AR.

ECH si combina con la tasca AR di Met-894 e Val-713.

L'ECH composto è stato ancorato al sito AF2 sulla superficie dell'AR umano e la modalità di legame teorica di ECH e AR è stata mostrata in Fig. 5D. Il composto ECH ha adottato un legame di conformazione compatto nella tasca dell'AR umano. I due gruppi fenilici di ECH si legano al dominio idrofobico della tasca AR e mantengono stretti contatti idrofobici con i residui Leu-712, Val-716, Met-734, Ile-737 , Met-894 e Ile-898, mentre gli altri due lati di ECH erano posizionati all'ingresso della tasca e stabilivano solo pochi contatti. Un'analisi dettagliata ha mostrato che sia Met-894 (lunghezza del legame: 2,4 Å) che Val-713 (lunghezza del legame: 2,7 Å) formavano legami idrogeno con i gruppi idrossi1 dell'ECH, che era la principale interazione tra ECH e umano AR.

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L'ECH attenua il danno riproduttivo indotto dal BPA.

Per studiare l'effetto dell'ECH sul danno riproduttivo, sono stati esaminati la qualità dello sperma ei livelli degli ormoni sessuali e degli enzimi steroidogenici nei topi indotti dal BPA. Come mostrato in Fig. 6, il trattamento con BPA ha ridotto significativamente il numero di spermatozoi e la motilità degli spermatozoi rispettivamente del 26,5% e del 39,2%. La somministrazione di ECH ha impedito la diminuzione del numero di spermatozoi e della motilità degli spermatozoi rispettivamente del 35,5% e del 30,1%. La somministrazione di BPA ha anche comportato una significativa diminuzione della secrezione di LH e T, e l'ECH ha aumentato considerevolmente i livelli di LH e T rispettivamente del 24,1% e del 18,3%, rispetto al solo trattamento con BPA (Fig. 6A, B). I livelli di mRNA di StAR, CYP17A1, 3 -HSD e 17 -HSD nel trattamento con BPA-ECH erano significativamente aumentati rispetto al trattamento con BPA (Fig. 6C, D).