Parte 2 L'echinacoside aumenta la quantità di spermatozoi nei ratti prendendo di mira il recettore degli androgeni ipotalamici

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Discussione

La documentazione etnofarmacologica e il nostro precedente studio13 lo hanno confermatoCistanche tubulosegli estratti hanno effettivamente aumentato i livelli di ormoni sessuali e migliorato la qualità dello sperma.ECHcome uno dei principali composti inCistanche tubulose19,20, può aumentare la conta spermatica e aumentare la secrezione di LH e T (Fig. 1). In questo studio lo abbiamo dimostratoECHè stato distribuito all'ipotalamo invece che ai testicoli, suggerendo un effetto indiretto di ECH sui testicoli. In effetti, l'ECH ha inibito direttamente l'attività dell'AR ipotalamica, la traslocazione dell'AR nel nucleo e l'espressione genica correlata all'asse HPG e ha anche fornito protezione contro il danno riproduttivo indotto dal BPA.

Negli studi sulla produzione di gonadotropine umane, i livelli di ormone sessuale sono strettamente regolati dall'asse HPG e da un ciclo di feedback negativo21. Vale a dire, la secrezione di T è notevolmente aumentata in risposta ad aumenti costanti e sostenuti dei livelli di LH nel sangue in risposta a una mancanza di feedback androgeno negativo all'ipofisi e all'ipotalamo. In questo studio,ECHaumentato la secrezione di LH nell'encefalo più l'ipofisi e la produzione di testosterone nel testicolo e i livelli di mRNA di LHR e Gnrhr nell'encefalo più l'ipofisi (Fig. 1 e Fig. 4), suggerendo cheECHpuò influenzare il feedback negativo dell'asse HPG. Non sorprende che l'AR stesso svolga un ruolo importante nella regolazione del feedback dei livelli di T e LH22,23. Il paradigma dell'asse HPG maschile è incentrato sul testosterone che fornisce una repressione del feedback negativo a livello sia dell'ipotalamo che della ghiandola pituitaria24,25. Studi precedenti utilizzavano Foxg1-Cre per ablare i geni di interesse nell'ipofisi ma non nell'ipotalamo per determinare l'importanza relativa delle due regioni. I risultati hanno dimostrato che la segnalazione di AR nell'ipofisi del topo maschio è superflua per quanto riguarda la regolazione dipendente dal testosterone della secrezione di LH26. Per questo motivo, abbiamo scelto di concentrarci sull'AR ipotalamico per ulteriori studi.

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In quanto recettore dell'ormone nucleare steroideo, l'attività di AR è regolata dal ligando steroideo T, il cui legame avvia la traslocazione nucleare e la funzione di regolazione trascrizionale di AR27. In questo studio, lo abbiamo dimostratoECHil trattamento ha inibito la traslocazione dell'AR dal citoplasma ai nuclei dell'ipotalamo (Fig. 3). Inoltre, lo studio PK lo ha dimostratoECHpuò penetrare notevolmente nell'ipotalamo piuttosto che nei testicoli, suggerendo che più ECH attraversa la barriera emato-encefalica, possibilmente attraverso l'endocitosi, piuttosto che la barriera ematica del testicolo. Inoltre, abbiamo dimostrato mediante ELISA indiretto la capacità di combinazione di ECH e AR suggerendo che ECH può legarsi direttamente all'AR. Ciò è stato ulteriormente supportato dai risultati del test di docking molecolare che indicava che esistono siti di legame presunti per ECH a Met-894 e Val-713 nella tasca AR (Fig. 5D). Ciò supporta le scoperte di altri secondo cui l'AR partecipa alla regolazione di un ciclo di alimentazione negativo e che una riduzione delle interazioni AR-T nel cervello si traduce in un aumento della secrezione di LH23,28,29

La steroidogenesi è un processo essenziale strettamente controllato per lo sviluppo della spermatogenesi con il coinvolgimento della proteina steroidogenica (StAR)30 ed enzimi steroidogenici come CYP11A1, CYP17A1, 3 -idrossisteroide deidrogenasi (HSD3) e 17 -idrossisteroide deidrogenasi (HSD17) che converte il colesterolo in testosterone31. Abbiamo dimostrato che i livelli di mRNA dei geni che codificano per questi enzimi sono aumentati significativamente conECHtrattamento mentre l'espressione dell'mRNA di StAR non è cambiata. Questo suggerisce cheECHnon ha avuto alcun effetto sul trasferimento del colesterolo alla membrana interna dei mitocondri, mentre può svolgere un ruolo nel promuovere la conversione del colesterolo in testosterone. La conclusione si può quindi trarre quellaECHil trattamento aumenta significativamente il numero di spermatozoi aumentando la sintesi e la secrezione di testosterone.

Per studiare l'effetto protettivo diECHsulla lesione dello sperma, il bisfenolo A (BPA), un tipico distruttore endocrino esogeno, è stato utilizzato come modello di danno riproduttivo maschile nei topi32.ECHil trattamento ha effettivamente recuperato la conta degli spermatozoi, la motilità degli spermatozoi, i livelli di T e LH diminuiti dal BPA (Fig. 6A, B), suggerendo che l'ECH può attenuare il danno allo sperma.

Rispetto alle sostanze chimiche sintetizzate artificialmente per la terapia ormonale sostitutiva,ECHè un composto naturale non ormonale che influenza il feedback negativo sull'asse HPG aumentando così la secrezione di LH, T e la qualità dello sperma. Questo percorso meccanicistico può proteggere il sistema riproduttivo maschile e quindiECHpuò essere considerato un potenziale agente protettivo naturale della riproduzione. Tuttavia, le regolazioni ormonali sono complesse e spesso portano a effetti sistemici. Come indicato in Fig. 7, l'ECH ha aumentato le secrezioni di T e LH e ha inibito l'attivazione di AR, il che può anche portare a conseguenze su altre vie di salute o associate a malattie come l'osteoporosi33 e la depressione negli uomini34, pertanto, gli effetti globali dell'ECH dovrebbero essere ulteriormente indagato.

Presi insieme, i nostri risultati lo indicanoECHsi lega all'AR nell'ipotalamo e inibisce il trasferimento dell'AR dal citoplasma al nucleo. I nostri dati suggeriscono che l'ECH si lega ai siti nella tasca AR degli amminoacidi Met-894 e Val-713. Ciò può spiegare l'aumento dei livelli di T e AR come risposta sistemica all'equilibrio dei livelli ormonali promuovendo la secrezione di LH e un successivo aumento della produzione di T e della conta spermatica (Fig. 8).

Metodi

Dichiarazione etica.

Questo studio è stato condotto nel rigoroso rispetto delle Linee guida per gli animali sperimentali stabilite dal Ministero della Scienza e della Tecnologia (Pechino, Cina). Tutti i protocolli sperimentali sono stati rivisti e approvati dal Comitato Etico dell'Anyang Institute of Technology.

Animali sperimentali.

Topi Kunming di quattro settimane (22 g–25 g) sono stati ottenuti dal centro per animali della quarta università medica militare (Xi'an, Cina). Gli animali sono stati tenuti in condizioni controllate a una temperatura di 22 gradi ± 2 gradi, 70 percento ± 4 percento di umidità con 12 ore di ciclo luce-buio e libero accesso a mangime e acqua.

Sperimentare il trattamento.

Esperimento 1. I topi sono stati divisi casualmente in sei gruppi, sette topi in ciascun gruppo (n=7).ECH(CAS: 82854-37-3; Chengdu Preferred Biotechnology Co., Ltd, Sichuan, Cina) è stato somministrato utilizzando un tubo intragastrico e il propionato di testosterone (TP, CAS: 57-85-2; KingYork, Tianjin, Cina) è stato somministrato per iniezione intramuscolare una volta al giorno per 14 giorni secondo il seguente disegno sperimentale: Gruppo di controllo: soluzione fisiologica normale (10mL/kg), gruppo ECH(L) (5mg/kg), gruppo ECH(M) (20mg/kg),ECH(H) gruppo (80 mg/kg), TP (15 mg/kg) ed enzalutamide (inibitore dell'AR, una volta al giorno a giorni alterni per 14 giorni; 20 mg/kg; CAS: 915087-33-1; Aladdin, Shanghai, Cina).

Dopo 2 settimane di trattamento, i topi sono stati anestetizzati con etere dietilico per raccogliere campioni di sangue per l'analisi dei livelli ormonali. I topi sono stati quindi sezionati per separare l'ipotalamo, l'encefalo più l'ipofisi, il testicolo e la cauda epididimo. Campioni di cauda epididimo sono stati messi in soluzione fisiologica con BSA al 5% per la valutazione della qualità dello sperma e l'ipotalamo, l'encefalo più l'ipofisi e i testicoli sono stati congelati in azoto liquido e conservati a -80 gradi per ulteriori indagini.

Esperimento 2. I topi sono stati divisi casualmente in 10 gruppi, cinque animali per gruppo.ECH(20mg/kg) sono stati somministrati per via orale e i topi di ciascun gruppo sono stati anestetizzati con etere dietilico nei momenti 0,5 h, 1h, 1,5h, 2h, 2,5h, 3h, 4h, 6h, 9h, e 12 ore dopo la somministrazione per il prelievo dei campioni. Il plasma è stato raccolto e il cuore è stato esposto. La perfusione di soluzione salina normale nei ventricoli sinistri è stata condotta da un apparecchio per infusione fino a quando il fegato e i polmoni non sono stati sbiancati. Sono stati raccolti dieci ipotalami e testicoli per determinare le concentrazioni tissutali di ECH.

Esperimento 3. I topi sono stati divisi casualmente in 4 gruppi, sette in ciascun gruppo.ECHe BPA (CAS: 80-05-7; Aladdin, Shanghai, Cina) sono stati somministrati utilizzando un tubo intragastrico una volta al giorno per 6 settimane secondo il seguente disegno sperimentale: gruppo normale (olio di mais, 10 ml/kg, peso corporeo/giorno) , gruppo modello: gruppo BPA (BPA 200 mg/kg, peso corporeo/giorno, olio di mais) e gruppo sperimentale: gruppo BPA più ECH (BPA 200 mg/kg; ECH 20 mg/kg). Dopo 42 giorni di trattamento, i topi sono stati anestetizzati con dietiletere e i campioni di sangue sono stati raccolti per l'analisi dei livelli ormonali. Il testicolo e l'epididimo caudale sono stati separati e raccolti. L'epididimo caudale è stato utilizzato per la valutazione della qualità dello sperma e il testicolo è stato congelato in azoto liquido e conservato a -80 gradi per ulteriori indagini.

Determinazione della qualità dello sperma. Preparazione della sospensione di sperma. Gli epididimi di cauda sono stati tritati in 5 ml di soluzione salina normale con il 5% di BSA e incubati per 5 minuti a 37 gradi per consentire al loro contenuto di diffondersi nel mezzo. Numero di spermatozoi: secondo il metodo descritto da Yokoi (2003), la sospensione di spermatozoi diluita (1:10; v/v; sospensione di spermatozoi/10 percento di metanolo) è stata trasferita in ciascuna camera di conteggio di un emocitometro ed è stata lasciata riposare per 5 minuti e quindi contato al microscopio ottico (Nikon, Instruments Inc., Giappone) con ingrandimento X200. Vitalità dello sperma: un totale di 20 μL di sospensione di sperma è stato miscelato con un volume uguale di colorazione eosina-nigrosina per 2 minuti; gli spermatozoi non colorati sono stati contati al microscopio ottico con ingrandimento 200x. Motilità spermatica: un totale di 10μL di sospensione spermatica è stato messo su un vetrino e registrato come mobile o immobile al microscopio ottico con ingrandimento 200x.

Determinazione dei livelli ormonali. I livelli di testosterone (T) e LH sono stati quantificati nel siero, nell'encefalo più l'ipofisi e negli omogenati del testicolo utilizzando kit di test radioimmunologici (RIA) (Beijing Sino-UK Institute of Biological Technology, Pechino, Cina). In breve, l'anticorpo anti-testosterone o anti-LH IgG (100 μL) e l'anticorpo anti-topo 125-I-coniugato sono stati aggiunti ai campioni o allo standard (100 μL) e miscelati su un bilanciere per una notte a 4 gradi . Dopo aver lavato tre volte con PBS-Tween 20 (500 μL), le miscele sono state centrifugate (3500 giri/min) a 4 gradi per 15 minuti. I valori CPM dei precipitati sono stati valutati mediante uno strumento di dosaggio radioimmunologico (Beijing Sino-western Technology Co. Ltd, CN202M/KZ4GC-1200, Pechino, Cina) e le concentrazioni di T e LH sono state calcolate secondo la formula di uno standard curva. Il coefficiente di variazione Te T e LH è rispettivamente del 2,8 percento e del 3,2 percento nei gruppi campione e del 2,1 percento e del 2,8 percento nei gruppi standard.

Determinazione delle espressioni geniche mediante PCR quantitativa in tempo reale. L'RNA totale è stato isolato dai tessuti testicolari ed encefalo-ipofisari congelati utilizzando un kit RNA Simple Total RNA (Tiangen, Pechino, Cina). La PCR quantitativa in tempo reale (q RT-PCR) è stata eseguita per l'applicazione di cDNA utilizzando 2 × SYBR Green I PCR Master Mix (Vazyme, Nanchino, Cina). La procedura PCR consisteva in 95 gradi per 30 secondi seguiti da 35 cicli di 95 gradi per 15 secondi, 58 gradi per 30 secondi e 72 gradi per 30 secondi. L'analisi della curva di fusione è stata eseguita sui prodotti PCR per verificare la specificità del primer e la purezza del prodotto. Per ogni piastra è stata eseguita una curva di dissociazione per confermare la produzione di un singolo prodotto. È stata calcolata l'abbondanza relativa di ciascun mRNA. I primer PCR utilizzati per lo studio sono mostrati nella Tabella 2.

Macchia occidentale. Per l'analisi dell'espressione AR, l'estrazione e l'isolamento della proteina citoplasmatica e nucleare sono state eseguite utilizzando un kit di estrazione di proteine ​​citoplasmatiche e nucleari (Beyotime, Nanchino, Cina) secondo le istruzioni del produttore. Le concentrazioni di proteine ​​citoplasmatiche e nucleari sono state valutate utilizzando un Bradford Protein Assay Kit (Beyotime, Jiangsu, Cina). I campioni di proteine ​​(80ug) sono stati analizzati su un gel SDS-PAGE al 12% e al 5% e trasferiti su membrane PVDF. Dopo il blocco, le membrane sono state incubate con anticorpi anti-AR IgG (1:1,{7}}; Bioss; Pechino Cina) e anticorpi anti-GAPDH policlonali di topo (1:1,000; Wuhan Boster Biologico

Technology, Wuhan, Cina) o anticorpi policlonali di topo anti-Lamin b1 per 2 ore. La membrana è stata lavata tre volte con TBST e incubata con un anticorpo IgG anti-topo di coniglio coniugato con HRP (1:5,{7}}; Bioss; Pechino Cina). Il segnale è stato visualizzato utilizzando il sistema di imaging ChemiDoc (Tanon-3,500, Shanghai, Cina).

Saggio di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC).

Il sangue è stato raccolto in provette di vetro eparinizzate. Il plasma è stato separato mediante centrifugazione immediata a 6,{1}} rpm per 10 min e conservato a -20 gradi per ulteriori esperimenti. I campioni di ipotalamo e testicolo da ciascun punto temporale sono stati raggruppati e omogeneizzati con metanolo. Dopo centrifugazione a 10,{5}}rpm a 4 gradi per 10 minuti, il surnatante è stato concentrato con N2 e il residuo è stato sciolto in 50 μL di metanolo e filtrato attraverso un filtro da 0,45 μm. Dieci μL del liquido filtrato del campione sono stati iniettati nel sistema HPLC per l'analisi. La curva standard consisteva in campioni contenenti 50, 100, 250, 500 e 750 ng/mL di ECH (Chengdu Pufei De Biotech Co., Ltd, Sichuan, Cina). I campioni di controllo della qualità del plasma addizionati con 75 ng/mL (basso), 150 ng/mL (medio) e 300 ng/mL (alto) di ECH sono stati di conseguenza preparati per misurare l'accuratezza e la precisione del metodo.

La cromatografia è stata eseguita con un sistema HPLC (serie D2{{10}}00 Elite, Hitachi, Giappone) accoppiato a un rivelatore UV (L-2400, Hitachi, Giappone). La separazione è stata eseguita su una colonna Termo-C18 (250 mm × 4,6 mm id, 4,6 μm di particelle) mantenuta a 25 gradi. La fase mobile era un gradiente preparato dallo 0,1% di acido fosforico contenente lo 0,04% di trimetilammina (componente A) e metanolo (componente B). Il gradiente lineare era il seguente: 70–90 percento A su 0-2 min, 60–70 percento A su 2–6 min, 55–60 percento B su 6–8 min, quindi tornato al 90 percento A a 8 minuti subito. La portata era di 0,8 ml/min. Il rivelatore UV è stato utilizzato a 332 nm. L'area del picco è stata valutata come misura analitica.

Studi di farmacocinetica nei topi. La penetrazione di ECH nell'ipotalamo e nel testicolo è stata sottoposta ad analisi farmacocinetica con software Drug and Statistics (Drug and Statistics, Mathematical Pharmacology Professional Committee of China). I parametri farmacocinetici sono stati determinati utilizzando il metodo non compartimentale basato sulla teoria del momento statistico. I parametri farmacocinetici preliminari tra cui la costante di tempo al picco (Tmax), la concentrazione di picco (Cmax), la costante di velocità di eliminazione (Ke), l'emivita di eliminazione (T0.5), l'area sotto la curva (AUC{ {4}}–12), volume di distribuzione apparente (Vc) e clearance (CL) sono stati ottenuti per ulteriori analisi. I rapporti cervello/plasma sono stati calcolati sulla base dei valori di AUC0-t per plasma e cervello.

Sintesi e identificazione di ECH-Ovalbumina (ECH-OVA). Un totale di 9,8 mg di ECH e 1,{5}} mg di anidride butandiolo sono stati sciolti in 2 ml di piridina, miscelati per 12 ore con agitazione a temperatura ambiente. La miscela è stata concentrata da N2 e il residuo è stato combinato con 10,8 mg di N-idrossisuccinimide (NHS) e 19,3 mg di dicicloesilcarbodiimmide (DCC) e sciolto in 4 mlN, N-dimetilformammide (DMF) per 12 ore con agitazione a temperatura ambiente. Dopo centrifugazione a 2,{18}} g per 5 minuti a 4 gradi, il surnatante è stato aggiunto a 5 ml di PBS in cui è stato sciolto 14,4 mg di ovalbumina (OVA). La nuova miscela è stata agitata per 24 ore a 4 gradi. La soluzione di reazione è stata quindi dializzata contro PBS per tre giorni. La presenza di ECH-OVA è stata confermata da spettri UV (Shimadzu Scientifc Instruments, Inc. Columbia, MD USA) a una lunghezza d'onda compresa tra 190 e 400 nm e denaturando PAGE.

ELISA indiretto (iELISA). Una piastra per microtitolazione è stata rivestita con ECH-OVA (2 ug/100 μL) e incubata per una notte a 4 gradi. La piastra è stata lavata tre volte con PBST e due volte con PBS, ed è stato aggiunto il 5% di PBSM (PBS contenente il 5% di latte scremato) per bloccare i siti non legati a 37 gradi per 2 ore. Dopo che le piastre sono state lavate con PBST e PBS, i pozzetti sono stati divisi in 4 gruppi; gruppo sperimentale, 1 ug di proteina totale AR/100μL; gruppo positivo, anticorpo anti-OVA di coniglio (1:1,000); gruppo negativo, 1 ug di sieroalbumina bovina; e un gruppo vuoto contenente PBS. Dopo incubazione per 1,5 ore, le piastre sono state lavate e al gruppo positivo sono stati aggiunti 100 μL/pozzetto di IgG coniugata con HRP di coniglio (1:1,{22}}), sono stati aggiunti 100 μL/pozzetto di anti-AR ( 1:1,000) agli altri gruppi. Dopo l'incubazione per 1,5 h, alle piastre è stata aggiunta la diluizione di IgG coniugata con HRP di coniglio (1:5,{33}}). Dopo incubazione a 37 gradi per 1 ora, le piastre sono state lavate tre volte con PBST e due volte con PBS. È stato quindi aggiunto TMB e incubato per 10 minuti al buio a temperatura ambiente ed è stato aggiunto H2SO4 2M per fermare la reazione. L'assorbanza è stata letta ad una lunghezza d'onda di 450 nm.

Aggancio molecolare. È stato condotto uno studio di docking molecolare per studiare la modalità di legame del composto ECH al recettore degli androgeni umani (AR) utilizzando Autodock vina 1.1.2 (http://vina.scripps.edu). La struttura tridimensionale (3D) di AR (ID PDB: 2YHD) è stata scaricata da Protein Data Bank (//www.rcsb.org/pdb/home/hone.do). La struttura 3D di ECH è stata ottenuta dal software ChemBioDraw Ultra 14.0 e ChemBio 3D Ultra 14.0. Il pacchetto AutoDockTools 1.5.6 (http://mgltools.scripps.edu) è stato utilizzato per generare i file di input di aggancio. La griglia di ricerca di AR è stata identificata come centro x: 36.141, centro y: 8.513 e centro z: 21.304 con dimensioni dimensione x: 15, dimensione y: 15 e dimensione z: 15. Il valore di esaustività è stato impostato su 20. Per l'aggancio Vina, sono stati utilizzati i parametri predefiniti se non è stato menzionato. La posa con il punteggio migliore, come giudicata dal punteggio di docking Vina, è stata scelta e analizzata visivamente utilizzando il software PyMOL 1.7.6 (http://www.pymol.org). Analisi dei dati e metodi statistici.

Analisi dei dati e metodi statistici. I dati sono stati analizzati utilizzando il software statistico SPSS 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Per il confronto tra i gruppi è stata impiegata un'ANOVA unidirezionale. Sono stati determinati i test di confronto di Tukey delle differenze significative tra i gruppi. I risultati sono stati espressi come media ± deviazione standard (SD) utilizzando il software Graph Pad Prism v.7 (GraphPad Sofware, Inc, California, USA).

Approvazione etica e consenso a partecipare. L'approvazione etica per questo studio è stata ottenuta dal Comitato Etico dell'Anyang Institute of Technology