L'echinacoside inverte il rimodellamento miocardico e migliora la funzione cardiaca

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Yajuan Ni1|Jie Deng1|Xin Liu1|Qing Li1|Juanli Zhang1|Hongyuan Bai1|Jingwen Zhang2

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Il rimodellamento miocardico è un'importante base patologica dell'insufficienza cardiaca, lo stress ossidativo mitocondriale è un promotore di ipertrofia miocardica, fibrosi e apoptosi. L'ECC è il principale componente attivo di una medicina tradizionale cinese Cstanches Herba, numerosi studi indicano che possiede una forte capacità antiossidante nelle cellule nervose e nei tumori, inibisce lo stress ossidativo mitocondriale, protegge la funzione mitocondriale, ma il meccanismo specifico non è chiaro. SIRT1/FOXO3a/MnSOD è un importante asse antiossidante, lo studio rileva che l'ECH si lega in modo covalente a SIRT1 come ligando e sovraregola l'espressione di SIRT1 nelle cellule cerebrali. Ipotizziamo che l'ECH possa invertire il rimodellamento miocardico e migliorare la funzione cardiaca dell'insufficienza cardiaca regolando l'asse di segnalazione SIRT1/FOXO3a/MnSOD e inibendo lo stress ossidativo mitocondriale nei cardiomiociti. Qui, in primo luogo, induciamo un modello cellulare di stress ossidativo mediante ISO con cellule AC{7}} e pre-trattamo con ECH, il livello di ROS mitocondriale, danno ossidativo mtDNA, MMP, proteina carbonilata, perossidazione lipidica, ROS intracellulare e vengono rilevate apoptosi, confermano l'effetto dell'ECH sullo stress ossidativo mitocondriale e la funzione in vitro. Quindi, stabiliamo un modello di ratto HF indotto da ISO e pre-trattato con ECH. Vengono misurati gli indici della funzione cardiaca, il rimodellamento miocardico, lo stress ossidativo mitocondriale e la funzione, l'espressione dell'asse di segnalazione SIRT1/FOXO3a/MnSOD, i dati indicano che l'ECH migliora la funzione cardiaca, inibisce l'ipertrofia miocardica, la fibrosi e l'apoptosi aumenta l'espressione di SIRT1/FOXO3a/ Asse di segnalazione MnSOD, riduce i danni ossidativi mitocondriali, protegge la funzione mitocondriale. Concludiamo che l'ECH inverte il rimodellamento miocardico e migliora la funzione cardiaca regolando l'asse SIRT1/FOXO3a/MnSOD e inibendo lo stress ossidativo mitocondriale nei ratti HF.

PAROLA CHIAVE Sechinacoside, insufficienza cardiaca, stress ossidativo mitocondriale, rimodellamento miocardico

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1|INTRODUZIONE

L'insufficienza cardiaca (HF) è l'esito finale della maggior parte delle malattie cardiovascolari ad alta prevalenza e prognosi sfavorevole e, con la tendenza all'invecchiamento della popolazione, i ricoveri e la mortalità per insufficienza cardiaca cronica (CHF) sono aumentati drasticamente in tutto il mondo.1 Negli ultimi 20 anni, i trattamenti farmacologici per l'insufficienza cardiaca hanno fatto grandi progressi, ma l'effetto è molto limitato, quindi sono urgentemente necessari nuovi farmaci. Il rimodellamento miocardico è un'importante base patologica dell'insufficienza cardiaca ed è caratterizzato da ipertrofia miocardica, apoptosi, fibrosi interstiziale, le cellule del miocardio sono disorganizzate e portano a una riduzione della frazione di eiezione (LVEF), un aumento delle dimensioni telediastoliche e sistoliche del ventricolo sinistro (LVIDd e LVIDs) e diminuzione dell'accorciamento frazionale del ventricolo sinistro (LVFS).2 Ma i meccanismi alla base non erano ancora del tutto chiari. Negli ultimi anni numerosi studi hanno confermato che lo stress ossidativo è un importante promotore del rimodellamento miocardico.3-7

Lo stress ossidativo è una condizione in cui le specie reattive dell'ossigeno (ROS) o i radicali liberi sono generati in modo eccessivo e portano al danno ossidativo dei componenti cellulari, questo, a sua volta, causa la disfunzione cellulare.8 I mitocondri sono la principale fonte di ROS intracellulari, a causa di perdite dalla catena di trasporto degli elettroni respiratori e i mitocondri sono la posizione più sensibile agli effetti dei ROS.9 Studi sull'insufficienza cardiaca hanno identificato un aumento della generazione di ROS dal complesso I della catena respiratoria.8 L'aumento della produzione di ROS attacca in primo luogo i componenti mitocondriali e provoca un eccesso di stress ossidativo , si manifesta come carbonilazione delle proteine, perossidazione lipidica e danno al DNA,10 e disfunzione dei mitocondri, che di conseguenza portano a un'eccessiva formazione di ROS,8 forma un circolo vizioso. È dimostrato che lo stress ossidativo prolungato può causare ipertrofia miocardica e fibrosi miocardica,11-13 e causare apoptosi delle cellule del miocardio attraverso l'attivazione dell'apoptosi mitocondriale come risultato della carbonilazione delle proteine ​​della membrana mitocondriale e della perdita del potenziale della membrana mitocondriale.14 Quindi , si ritiene che l'inibizione dello stress ossidativo mitocondriale possa essere una nuova strategia per prevenire il rimodellamento miocardico e persino l'insufficienza cardiaca.15-17

L'echinacoside (ECH), un glicoside feniletanoide naturale, è il principale componente attivo di Cistanches Herba, che è la medicina tradizionale cinese. Negli ultimi anni, l'ECH è stata ampiamente studiata nel sistema nervoso e nei tumori ed è stato riportato che possiede una varietà di effetti farmacologici, come proprietà antiossidanti, antinfiammatorie, antiapoptotiche e antitumorali.18,19In cellule nervose, ECH migliora significativamente la capacità antiossidante, riduce la produzione di ROS, migliora il potenziale della membrana mitocondriale (MMP) e aumenta la vitalità cellulare,20 mostra effetti protettivi sulla funzione mitocondriale e inibisce lo stress ossidativo mitocondriale, protegge dal danno ossidativo e migliora la memoria, infine previene neurodegenerazione.21,22 L'ECC aumenta anche l'attività della SOD e svolge un ruolo protettivo nel tessuto cerebrale e nel tessuto retinico,19,23 ma il meccanismo specifico per il suo effetto antiossidante non è chiaro.

SIRT1 è strettamente correlato allo stress ossidativo e l'asse di segnalazione SIRT1/FOXO3a/MnSOD è l'asse antiossidante più importante ed è responsabile della soppressione dello stress ossidativo mitocondriale, MnSOD si distribuisce ampiamente nei mitocondri ed è principalmente responsabile dell'eliminazione dei ROS mitocondriali, quindi inibendo lo stress ossidativo, i composti che attivano questo asse antiossidante possono inibire lo stress ossidativo.24,25 Studi recenti hanno dimostrato che l'ECH esercita i suoi effetti farmacologici regolando molteplici vie di segnalazione, come p-AKT, mTOR/STAT3, TGF-beta 1/Smads e la via di segnalazione SIRT1.26-29 un nuovo studio rileva che l'ECH si lega in modo covalente a SIRT1 come ligando e sovraregola l'espressione di SIRT1 nelle cellule cerebrali.26 Suggerisce che l'ECH può inibire lo stress ossidativo mitocondriale nei cardiomiociti e invertire il miocardio rimodellamento. Tuttavia, la ricerca sugli effetti dell'ECH si è concentrata sul sistema nervoso o sul tumore, gli effetti ei meccanismi dell'ECH sullo stress ossidativo mitocondriale nei cardiomiociti e sul rimodellamento del miocardio rimangono sconosciuti. Qui, in primo luogo, induciamo un modello cellulare di stress ossidativo mediante ISO e confermiamo l'effetto dell'ECH sullo stress ossidativo mitocondriale e sulla funzione in vitro. Quindi, stabiliamo un modello di ratto HF indotto da ISO e dimostriamo che l'ECH inverte il rimodellamento miocardico e migliora la funzione cardiaca regolando l'asse di segnalazione SIRT1/FOXO3a/MnSOD e inibendo lo stress ossidativo mitocondriale nei ratti HF. I risultati hanno lo scopo di fornire prove sperimentali per lo sviluppo di nuovi farmaci per prevenire l'insufficienza cardiaca.

2|MATERIALI E METODI

2.1|Coltura cellulare e trattamento

Le cellule AC16 vengono acquistate da Bena Culture Collection. Le cellule vengono mantenute in un integratore di terreno Eagle modificato da Dulbecco (DMEM; Hyclone, GE Healthcare, USA) con il 10% di siero bovino fetale (10% FBS; Gibco) in flaconi T-75 (Corning Glassworks, Corning, New York, Stati Uniti). Le condizioni sono mantenute a 37 gradi in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO2. Una volta che le cellule raggiungono il 70 percento -80 percento di confluenza, le cellule del gruppo ISO (Sigma, USA) vengono incubate con un mezzo contenente 10 uM ISO (Sigma, USA) per 24 ore, le cellule del gruppo ECH vengono pretrattate con 50 uM ECH (MCE , USA) per 30 minuti prima dell'esposizione ISO. Le celle di controllo (Ctrl) non vengono trattate.

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2.2|Rilevamento del livello di ROS mitocondriale mediante chemiluminescenza di luminol

I mitocondri vengono isolati e purificati dalle cellule AC-16 utilizzando il kit di isolamento dei mitocondri (Sigma, USA) secondo le istruzioni del produttore. Le concentrazioni proteiche sono determinate dal kit di analisi delle proteine ​​BCA (Biotech). Il livello di ROS mitocondriale viene rilevato dal luminale (3-idrazide aminoftalico 5-amino-2,3-diidro{5}},4-ftalazinedione) utilizzando un kit Elisa (GERMED SCIENTIFIC INC, USA), reagisce con i ROS e provoca l'emissione di fotoni, che è uno spettro di banda con un picco a circa 460 nm, e l'Unità di Luce Relativa (RLU) viene rilevata dallo strumento di misura della chemiluminescenza e convertita in RLU/ug proteina mitocondriale.

2.3|8-OHdG viene utilizzato per valutare il danno ossidativo del DNA mitocondriale

Il danno ossidativo del DNA mitocondriale viene valutato rilevando il contenuto di 8-idrossi{1}}deossiguanosina (8-OHG). I mitocondri purificati nelle cellule vengono isolati utilizzando un kit di isolamento dei mitocondri come sopra (Sigma). Le concentrazioni proteiche sono determinate dal kit di analisi delle proteine ​​BCA (Biotech). Quindi, vengono dissociati per determinare il livello di 8-OHdG utilizzando un kit Elisa (GERMED SCIENTIFIC INC, USA) secondo le istruzioni del produttore. L'assorbanza del cambiamento di colore viene misurata in uno spettrofotometro alla lunghezza d'onda di 450 nm. La concentrazione di 8-OHdG nei campioni viene quindi determinata confrontando la DO dei campioni con la curva standard e convertita in ng/ml.

2.4|Misurazione dell'MMP da parte di JC-1

I mitocondri vengono isolati e purificati dall'AC-16 e la concentrazione proteica viene determinata come menzionato sopra. Quindi i mitocondri vengono risospesi a una concentrazione di 1 mg/ml, la MMP viene misurata utilizzando un kit di analisi JC-1 secondo le istruzioni del produttore. L'intensità della fluorescenza è misurata alla lunghezza d'onda di eccitazione: 490 nm, fenditura 5 nm, lunghezza d'onda di emissione: 590 nm, fenditura 5 nm con uno strumento spettrofotometro,30 i risultati sono rappresentati come FLU/ugP.

2.5|Rilevamento di cellule apoptotiche mediante citometria a flusso in cellule AC-16

La citometria a flusso viene utilizzata per valutare l'apoptosi cellulare. Un kit di rilevamento dell'apoptosi dell'Annessina V-FITC/PI (CWBIO, Cina) viene utilizzato per rilevare le cellule apoptotiche e necrotiche secondo le istruzioni del fornitore. L'apoptosi allo stadio iniziale, l'apoptosi o la necrosi allo stadio avanzato, i detriti cellulari e le cellule vitali sono identificati come annessina V (più)/PI (-), annessina V (più)/PI (più), annessina V (-)/PI ( più ) e annessina V (-)/PI (-), rispettivamente. Le intensità di fluorescenza vengono analizzate utilizzando un citometro a flusso (BD FACSVerse™ Flow Cytometer, BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Ogni esperimento viene ripetuto 3 volte.

2.6|Valutato il ROS intracellulare mediante citometro a flusso

Dopo il trattamento, le cellule vengono tripsinizzate, lavate due volte con PBS. Le cellule vengono quindi risospese in PBS, colorate con DCFH-DA (Beyotime, Cina) alla concentrazione finale di 1 μM e incubate per 1 ora a 37 gradi in un'incubatrice con CO2, quindi testate in un citometro a flusso a 488 nm di eccitazione . L'intensità della fluorescenza rappresenta il livello di ROS intracellulare.

2.7|Testare il contenuto di proteine ​​carboniliche nei mitocondri delle cellule AC-16

Dopo il trattamento, i mitocondri purificati vengono isolati e sonicati su ghiaccio e trattati con 1% di streptomicina solfato per precipitare gli acidi nucleici mitocondriali, viene determinata la concentrazione proteica. Il contenuto di proteine ​​carboniliche viene testato utilizzando un kit Elisa (GERMED SCIENTIFIC INC, USA) basato sulla derivatizzazione del gruppo carbonile con dinitrofenilidrazina (DNPH), secondo le istruzioni del kit, la DO viene misurata con un lettore di micropiastre e convertita in nmol/ mg di proteine ​​rispetto alla curva standard.

2.8|Determinazione del livello di perossidazione lipidica nei mitocondri delle cellule AC-16

Dopo il trattamento, le cellule vengono raccolte e lisate, i mitocondri vengono isolati e purificati e crackizzati mediante ultrasuoni, la concentrazione proteica è determinata dal kit di analisi delle proteine ​​BCA (Biotech), la perossidazione lipidica è determinata dal livello di malondialdeide (MDA) tramite il test TBARS , utilizzando un kit (Nan jing Jian cheng, Cina) e il livello MDA viene misurato seguendo il protocollo del produttore. La DO viene rilevata a 586 nm da un lettore di micropiastre e convertita in μmol/g di proteina confrontandola con la curva standard.

2.9|Animali e cure

Giovani ratti maschi Sprague-Dawley del peso di 120-140g vengono acquisiti dal Centro per animali laboratoriali dell'Università di Xi'an Jiao tong (Shaanxi, Cina). L'indagine è conforme a The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, pubblicata dal National Institutes of Health degli Stati Uniti (pubblicazione NIH n.85-23, rivista nel 1996), e i protocolli sperimentali sono stati approvati dalle autorità locali ( Comitato Etico Biomedico del Dipartimento di Medicina dell'Università di Xi' a Jiao Tong). Il modello di insufficienza cardiaca nel ratto è stabilito come descritto in precedenza da noi.31 In breve, l'isoproterenolo (10 mg/kg) viene somministrato una volta al giorno mediante iniezione intraperitoneale per 2 settimane (definito come gruppo HF), l'ECH viene somministrato con 20 ug/g una volta al giorno mediante iniezione intraperitoneale a 30 minuti prima del trattamento dell'ISO (definito come gruppo ECH) e la somministrazione dura 2 settimane. Gli animali di controllo vengono somministrati con lo 0,9% di NaCl (definito come gruppo Ctrl). Le misurazioni ecocardiografiche vengono eseguite per valutare la funzione cardiaca.

2.10|Misure ecocardiografiche

Gli animali vengono anestetizzati mediante un'iniezione intraperitoneale di 300 mg/kg di cloralio idrato. Il sistema ecografico SONOS-2500 con un trasduttore a ultrasuoni da 7,5 MHz (HP, USA) viene utilizzato per eseguire esami ecocardiografici. La frazione di eiezione del ventricolo sinistro (LVEF), l'accorciamento frazionale del ventricolo sinistro (LVFS), le dimensioni telediastoliche del ventricolo sinistro (LVIDd), le dimensioni telesistoliche del ventricolo sinistro (LVIDs), la frequenza cardiaca (HR), lo spessore del setto interventricolare in diastole (IVSTd). ), lo spessore della parete posteriore del ventricolo sinistro in diastole (LVPWTd) viene misurato come descritto in precedenza da noi.32

FIGURA 1 50μmol ECH inibisce efficacemente lo stress ossidativo mitocondriale delle cellule AC-16 indotto da 10μmol/L ISO e protegge la funzione mitocondriale e riduce l'apoptosi.

2.11|Viene misurato il rapporto peso cardiaco/peso corporeo (HW/BW).

Il ratto viene pesato prima dell'anestesia, il cuore fresco viene isolato e lava via il sangue con 0.1mol/L PBS, taglia via vasi e altro tessuto ridondante e il cuore viene pesato, quindi HW/BW(mg/100g) viene calcolato.

2.12|Colorazione istologica

I cuori dei ratti vengono sezionati e fissati in paraformaldeide al 4%, incorporati in paraffina e sezionati in fette spesse 5 μm. La colorazione con ematossilina-eosina (HE) viene utilizzata per osservare i cambiamenti patologici e il tricromo di Masson viene utilizzato per valutare le fibre di collagene del tessuto del miocardio di ratto. La frazione di volume del collagene cardiaco (CVF) e l'area della sezione trasversale dei cardiomiociti vengono misurate con Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA).

2.13|Colorazione TUNEL

Si preleva il tessuto miocardico dal ventricolo sinistro e si esegue il test TUNEL come descritto in precedenza da noi32

2.14|Microscopio elettronico a trasmissione

Il tessuto cardiaco fresco viene fissato in glutaraldeide al 2,5% a 4 gradi, il tessuto viene quindi tagliato in 1 mm3 di volume e fissato nuovamente in glutaraldeide al 2,5% a 4 gradi per 2 ore, quindi viene lavato con 0.1mol/L PBS, fissato in acido osmico all'1%, disidratato con acetone, annegate con resina epossidica, vengono realizzate fette ultrasottili che si assottigliano di circa 8{17}}0 nm, colorate con acetato di uranile e citrato di piombo e quindi osservate al microscopio elettronico a trasmissione (H{ {13}}, Hitachi Limited, Giappone). Per quantificare l'effetto protettivo dell'ECH nella morfologia mitocondriale, la circonferenza mitocondriale media, l'area della sezione trasversale mitocondriale media, la percentuale di degenerazione e la percentuale di vacuolizzazione nei mitocondri vengono analizzate statisticamente con Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, USA).

2.15|PCR quantitativa

L'RNA totale viene preparato dal tessuto ventricolare sinistro con il reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad, USA). Il cDNA viene sintetizzato utilizzando il TUREscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara, Giappone). Le sequenze di primer specifiche del collagene che ho utilizzato per la PCR in tempo reale sono le seguenti: avanti: 5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTC-3′, inverso: 5′-GTGGAGTCGGCAATTGCA-3′. GAPDH avanti 5'-GGC AAG GTC ATC CCA GAG CT-3', reverse 5'-CGC CTG CTT CAC CAC CTT CT-3'. La PCR quantitativa in tempo reale (qPCR) viene eseguita con SYBRPremix Ex Taq (Perfect Real Time) (Takara, Giappone). Il livello relativo di mRNA viene calcolato normalizzando a GAPDH, secondo il metodo 2-ΔΔCT.

2.16|Analisi Western blot dell'espressione della proteina SIRT1, FOXO3a, MnSOD

La proteina totale del tessuto ventricolare sinistro viene estratta su ghiaccio utilizzando il tampone RIPA freddo (BioRad, USA) con cocktail di inibitori della proteasi (Sigma-Aldrich). La concentrazione è determinata con il metodo BCA. Le procedure di Western blot sono descritte in precedenza.33 In breve, il campione proteico viene frazionato su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide al 15%, trasferito su membrane PVDF (BioRad, USA), bloccato con latte scremato al 5% e incubato con anticorpo MYH di topo (diluito 1:200, Santa Cruz, USA). Quindi, incubato con un anticorpo di topo di capra coniugato con perossidasi di rafano (diluito 1:2,{10}}, Santa Cruz, USA). Il livello relativo di proteine ​​viene calcolato normalizzando il valore medio dei raggi in -actina. Le bande proteiche sono rilevate da un sistema di chemiluminescenza (ChemiDoc XRS, BioRad).

2.17|Misurazione dello stress ossidativo mitocondriale nel miocardio di ratto

I mitocondri purificati del miocardio di ratto vengono isolati utilizzando il kit di isolamento dei mitocondri (Sigma, USA) secondo le istruzioni del produttore, ROS mitocondriale, MMP, danno ossidativo del mtDNA, contenuto proteico carbonilato e livello di perossidazione lipidica nei mitocondri sono tutti rilevati utilizzando gli stessi metodi di esperimenti cellulari sopra descritti. Da notare, il ROS nel tessuto miocardico viene rilevato con sonde fluorescenti DCFH-DA, l'intensità della fluorescenza viene rilevata con lo strumento di misurazione dell'etichettatura enzimatica, i risultati sono rappresentati come proteina mitocondriale RLU/ug.

2.18|analisi statistica

Tutti i dati sono presentati come medie ± SEM. L'ANOVA unidirezionale viene utilizzata per confrontare le differenze tra più gruppi, seguita dal test post hoc di Tukey per la significatività. Tutte le statistiche sono determinate utilizzando il software SPSS15.0 (SPSS Inc, IL, USA). Un valore di probabilità di P < .05="" è="" considerato="">

3|RISULTATI

3.1|50 μM ECH inibisce efficacemente il danno ossidativo mitocondriale e l'apoptosi nelle cellule AC-16

Le celle non trattate vengono impostate come un gruppo Ctrl. In primo luogo, come mostra la Figura 1A, l'ECH inibisce i ROS mitocondriali indotti dall'ISO. Le cellule trattate con ISO mostrano un aumento significativo del ROS mitocondriale rispetto a Ctrl e questo aumento è significativamente attenuato dal pretrattamento con 50 μM ECH. In secondo luogo, l'ECH può inibire il danno ossidativo del mtDNA indotto dall'ISO. 8-Si ritiene che l'OHdG sia una delle lesioni del DNA più abbondanti risultanti dallo stress ossidativo ed è un biomarcatore del danno e della riparazione ossidativa del DNA. Come mostra la Figura 1B, viene rilevato il contenuto di 8-OHdG nei mitocondri purificati dalle cellule AC-16, i risultati mostrano che il livello di 8-OHdG nei mitocondri dalle cellule trattate con ISO è aumentato notevolmente, ma la modifica è stata invertita di 50 μM ECH. In terzo luogo, l'ECH è efficace per proteggere l'MMP, che è compromesso dall'ISO. L'intensità della fluorescenza è significativamente ridotta nelle cellule trattate con ISO rispetto alle cellule Ctrl, mentre il pretrattamento con 50 μM ECH attenua notevolmente la riduzione di MMP, come mostra la Figura 1C. In quarto luogo, l'ECH protegge dal danno ossidativo della proteina mitocondriale nelle cellule AC-16. Come mostra la Figura 1D, il contenuto di proteine ​​carboniliche nei mitocondri delle cellule di trattamento ISO è significativamente aumentato e l'ECH attenua l'effetto. In quinto luogo, l'ECH inibisce anche la perossidazione lipidica mitocondriale nelle cellule AC-16 indotta da ISO. Come mostra la Figura 1E, il livello di perossidi lipidici nei mitocondri delle cellule ISO è ovviamente superiore a quello delle cellule Ctrl, mentre questo aumento è significativamente ridotto dal pretrattamento ECH 50μM. Infine, l'ECH inibisce l'accumulo di ROS intracellulari. Come mostra la Figura 1F, il livello di ROS intracellulare nelle cellule ISO è notevolmente aumentato ed è notevolmente ridotto nelle cellule pretrattate con ECH. La Figura 1G mostra che il tasso di apoptosi delle cellule AC-16 è significativamente aumentato dopo incubazioni di 24 ore con 10 μM di ISO, rispetto alle cellule Ctrl, mentre le cellule di pretrattamento con 50 μM di ECH riducono significativamente l'apoptosi indotta da ISO.

FIGURA 2 L'ipertrofia cardiaca dei ratti HF indotta dall'ISO è alleviata e la funzione cardiaca è significativamente migliorata dal trattamento con ECH.

3.2|L'ECH inverte il rimodellamento miocardico e migliora la funzione cardiaca dei ratti HF indotti da ISO

Come mostrato nella Figura 2A, i cuori nei ratti HF sono ipertrofia evidente e sono invertiti dal trattamento con ECH. Come mostrano le Figure 2B-D e L, ECH riduce HW/BW. I risultati dell'ecocardiografia mostrano che LVEF e LVFS sono significativamente ridotti nel gruppo HF, LVIDd, LVIDs e IVSTd sono significativamente aumentati nel gruppo HF. Tuttavia, ECH riduce significativamente LVIDd, LVIDs, IVSTd e migliora LVEF e LVFS, non vi è alcuna differenza significativa in HR tra i tre gruppi, LVPWTd è aumentato in HF, ma nessuna differenza tra ECH e Ctrl, o tra ECH e HF, tutto come La figura 2E-K mostra. I risultati della colorazione HE indicano che l'ipertrofia miocardica, il disturbo organizzato o la necrosi degenerativa, l'infiltrazione di cellule infiammatorie e l'iperemia interstiziale e l'edema nei ratti HF e l'ECC allevia significativamente questi danni, l'ipertrofia miocardica e il disturbo organizzato sono alleviati, il la necrosi degenerativa e l'infiltrato infiammatorio sono ridotti, come mostrato nella Figura 3A. Viene misurata l'area della sezione trasversale del cardiomiocita, è significativamente aumentata dopo l'ISO ed è diminuita nel gruppo trattato con ECH, come mostra la Figura 3E. Le valutazioni della deposizione di collagene mediante colorazione di Masson rivelano che il contenuto di collagene del ventricolo sinistro nei ratti HF è ovviamente aumentato e apparentemente diminuito dopo il trattamento con ECH, che ovviamente diminuisce la CVF. L'analisi PCR in tempo reale rivela che le trascrizioni di procollagene di tipo Ⅰ sono sovraregolate nei ratti ISO e sottoregolate nei ratti ECH, questi risultati sono coerenti tra loro, come mostrano le figure 3B e FG, i dati indicano che l'ECH riduce efficacemente la deposizione di collagene . Il numero di cellule TUNEL-positive nei cardiomiociti è significativamente aumentato nei ratti HF rispetto a Ctrl, ECH riduce notevolmente l'apoptosi delle cellule del miocardio e la Figura 3C-D mostra l'immagine rappresentativa delle cellule TUNEL-positive rispettivamente nei campi a bassa e alta potenza e Figura 3H mostra il tasso di apoptosi delle cellule del miocardio. Questi risultati indicano che l'ECH inverte efficacemente l'ipertrofia miocardica, la fibrosi interstiziale miocardica e l'apoptosi e migliora la funzione cardiaca nei ratti HF indotti da ISO.

FIGURA 3 I risultati della colorazione istologica dimostrano che l'ECH inverte il rimodellamento ventricolare sinistro dei ratti HF indotto dall'ISO.

3.3|L'ECH protegge l'ultrastruttura del miocardio nei ratti HF

I risultati delle micrografie elettroniche a trasmissione mostrano che il danno all'ultrastruttura del miocardio potrebbe essere attenuato dall'ECC, come mostra la Figura 4A-B. Le miofibrille sono disposte verticalmente, la struttura del sarcomero è evidente, i miofilamenti sono disposti ordinatamente e la linea Z è chiara. I mitocondri sono disposti in modo ordinato e la struttura è chiara nei ratti Ctrl. Tuttavia, le miofibrille sono disorganizzate, rotte e disciolte, la struttura del sarcomero è sfocata, l'assenza della linea Z, la zona di contrazione miocardica è visibile, il numero e il volume dei mitocondri sono aumentati, i mitocondri hanno forme e dimensioni diverse, disposti in disordine, la struttura non è chiara, il gonfiore e la frammentazione della cresta, il collasso o l'aggregazione e si sono disciolti nel vacuolo nei ratti HF. L'ECC ovviamente attenua questi cambiamenti, la maggior parte delle fibre muscolari cardiache sono disposte in modo ordinato e i filamenti del miocardio sono chiari, esiste la linea Z, sebbene sia evidente una certa dissoluzione dei filamenti, la struttura del sarcomero è chiara, la densità del mitocondriale è diminuita, le forme e le dimensioni sono alleviate, disposte in modo più ordinato, il gonfiore dei mitocondri e la frammentazione della cresta, il collasso o l'aggregazione e la vacuolizzazione sono evidentemente ridotte dall'ECC rispetto all'HF. Il gonfiore dei mitocondri e la frammentazione della cresta, il collasso o l'aggregazione e la parziale vacuolizzazione sono identificati come degenerazione mitocondriale. I risultati dimostrano che l'ECH protegge efficacemente l'ultrastruttura del miocardio e in particolare protegge la morfologia mitocondriale nei ratti HF, come mostra la Figura 4C-F.

FIGURA 4 ECH protegge l'ultrastruttura dei cardiomiociti e la morfologia mitocondriale dei ratti HF indotti da ISO.

3.4|ECH aumenta l'espressione proteica di SIRT1, FOXO3a e MnSOD

L'analisi Western Blot dimostra che il livello di espressione proteica di SIRT1, FOXO3a e MnSOD è significativamente down-regolato nei ratti HF, tuttavia, ECH ovviamente sovra-regola la ridotta espressione proteica. Le bande proteiche rappresentative dei risultati dell'analisi statistica e dell'immunoblotting sono mostrate nella Figura 5. La parte dei dati indica che l'ECH aumenta l'espressione proteica di SIRT1, FOXO3a e MnSOD.

3.5|L'ECH inibisce lo stress ossidativo mitocondriale nel tessuto miocardico del ventricolo sinistro

In questa parte vengono misurati i ROS mitocondriali, le MMP, il danno ossidativo del DNA mitocondriale, il contenuto di proteine ​​carboniliche e il livello di perossidazione lipidica nei mitocondri nel tessuto miocardico ventricolare sinistro dei ratti e i risultati sono coerenti con gli esperimenti cellulari, vale a dire, L'ECH riduce il ROS mitocondriale, protegge l'MMP, allevia il grado di danno del mtDNA, riduce il contenuto di proteine ​​carboniliche e la perossidazione lipidica nel mitocondriale, come mostra la Figura 6.

FIGURA 5 ECH aumenta il livello di espressione proteica di SIRT1, FOXO3a e MnSOD che è sottoregolato nei ratti HF.

4|DISCUSSIONE

Questo studio dimostra che l'ECH esercita un ruolo efficace nella prevenzione del rimodellamento miocardico e nel miglioramento della funzione cardiaca attraverso la sovraregolazione dell'asse di segnalazione SIRT1/FOXO3a/MnSOD e inibendo lo stress ossidativo mitocondriale.

I mitocondri sono il principale sito di generazione di ROS come sottoprodotto della fosforilazione ossidativa, per la loro vicinanza a ROS, si ritiene che le proteine ​​mitocondriali, i lipidi e il mtDNA siano bersagli primari del danno ossidativo dopo un'eccessiva emissione di ROS mitocondriali,34,35 questo danno stimola un'ulteriore produzione di ROS, il circolo vizioso continua, ROS e stress ossidativo potrebbero portare a ipertrofia miocardica, apoptosi, fibrosi interstiziale e SC attraverso l'attivazione di molteplici vie di segnalazione.35 Quindi, sembra che i farmaci mirati all'inibizione dell'ossidativo mitocondriale lo stress sono efficaci per la prevenzione del rimodellamento miocardico. L'ECH è un glicoside feniletanoide naturale, un componente dell'erba tradizionale cinese Cistanche tubulosa. è ampiamente studiato ed è stato dimostrato che possiede tipi di attività farmacologiche negli ultimi anni, come azione antitumorale, antiapoptotica, antietà, neuroprotettiva e così via. Gli studi hanno dimostrato che le azioni farmacologiche dell'ECH dipendono principalmente dalla sua proprietà di attività antiossidante e antinfiammatoria,18,21 e l'ECH diminuisce i ROS mitocondriali e protegge la funzione mitocondriale dal danno ossidativo nelle cellule nervose.20,22 Qui, in primo luogo, abbiamo dimostrato che L'ECH riduce i ROS mitocondriali dei cardiomiociti, quindi, migliorando l'MMP, riducendo il danno ossidativo del mtDNA, delle proteine ​​​​e dei lipidi, inibendo efficacemente il danno ossidativo mitocondriale e riducendo l'apoptosi in vitro e in vivo, quindi inverte il rimodellamento miocardico e migliora la funzione cardiaca. Significa che l'ECH è un potenziale nuovo farmaco per la prevenzione del rimodellamento miocardico e dell'insufficienza cardiaca.

In condizioni normali, il ROS mitocondriale viene eliminato principalmente da MnSOD che si distribuisce nei mitocondri e protegge dal danno ossidativo mitocondriale. Ang II riduce significativamente l'espressione di MnSOD dei cardiomiociti e induce ipertrofia miocardica, tuttavia, il resveratrolo potrebbe aumentare l'espressione di MnSOD e inibire l'ipertrofia miocardica indotta da Ang II.36 Nell'insufficienza cardiaca, l'attività di MnSOD è significativamente ridotta e la generazione di ROS mitocondriali è elevata .37,38 Nei topi knockout per il gene MnSOD specifico per il cuore, non è stato possibile eliminare i ROS mitocondriali e i ROS sono aumentati nei cardiomiociti, questo ha portato a disfunzione mitocondriale e progressivo allargamento cardiaco, portando infine a insufficienza cardiaca.39 Nel presente studio, confermiamo che l'espressione di MnSOD è significativamente ridotta, che è attenuata dal trattamento ECH, e quindi, il ROS mitocondriale è ridotto e lo stress ossidativo mitocondriale è inibito. Significa che l'ECH protegge i cardiomiociti dal danno ossidativo attraverso la sovraregolazione dell'espressione di MnSOD, esploriamo ulteriormente i meccanismi molecolari alla base di questi effetti.

L'espressione di MnSOD è regolata da FOXO3a, che è un fattore di trascrizione e si lega nella regione del promotore del gene di MnSOD e porta alla promozione della trascrizione genica.40 SIRT1 è un molecolare a monte di FOXO3a e può attivare FOXO3a mediante deacetilazione. L'asse di segnalazione SIRT1/FOXO3a/MnSOD gioca un ruolo fondamentale nella protezione contro lo stress ossidativo in tipi di cellule, l'attivazione dell'asse di segnalazione da parte dell'estradiolo inibisce lo stress ossidativo ed esercita la protezione cardiaca24; L'attivazione dell'asse di segnalazione da parte del resveratrolo inibisce la morte cellulare indotta da stress ossidativo40; Altrimenti, l'angiotensina II inibisce la via SIRT1/FoxO3a/MnSOD e induce stress ossidativo mitocondriale, danno al mtDNA negli osteoblasti,41 l'adenilciclasi di tipo 5 aumenta lo stress ossidativo inibendo l'espressione di MnSOD attraverso la via Sirt1/FoxO3a.42 Il presente studio rileva che il l'espressione di SIRT1, FoxO3a e MnSOD è significativamente ridotta nei ratti HF e il ROS mitocondriale è elevato e lo stress ossidativo è potenziato, tuttavia i cambiamenti sono invertiti dall'ECH. Una nuova ricerca indica che l'ECH si lega direttamente a SIRT1 come ligando e forma un complesso con 9 legami covalenti e regola l'espressione di SIRT1 nelle cellule nervose.26 Coerentemente con questo studio, il presente studio dimostra che l'ECH aumenta anche l'espressione di SIRT1 nei cardiomiociti, quindi sovra-regola l'espressione genica di MnSOD attraverso FoxO3a e inibisce i ROS mitocondriali e lo stress ossidativo.

L'ischemia cronica a lungo termine può causare l'ibernazione miocardica, queste cellule miocardiche in letargo mostrano tipicamente una perdita di filamenti contrattili, ci sono granuli di glicogeno in eccesso nel citosol, nel reticolo sarcoplasmatico e i tubuli trasversali sono persi,43 inoltre, ci sono anomalie nella dimensione e nella forma mitocondriale , ipertrofia miocardica reattiva e fibrosi interstiziale, secondarie alla perdita di miociti.44 Nel nostro studio abbiamo anche osservato i cambiamenti di cui sopra nei ratti HF, mentre l'ECC allevia significativamente questi cambiamenti, poiché l'ultimo studio ha riportato che il recupero della funzione cardiaca dopo lo stress ischemico può essere un caratteristica dell'ibernazione miocardica,45 viene misurato anche il livello di glicogeno miocardico, i risultati indicano che non vi è alcuna differenza significativa tra i tre gruppi, come mostrato nella Figura 7J.

Lo studio precedente ha anche rilevato l'ibernazione miocardica in un modello di suino con insufficienza cardiaca non ischemica stimolando la parete libera del ventricolo sinistro con alta frequenza,46 poiché l'ostruzione microvascolare gioca un ruolo importante nell'ibernazione miocardica e nella conseguente disfunzione contrattile, e questo è notevolmente migliorato quando il l'ostruzione microvascolare è invertita da un farmaco.47 Al momento, alcuni studi concludono che la terapia di rivascolarizzazione è efficace nel miocardio in letargo,43 utilizzando la colorazione HE e Masson, osserviamo che la densità capillare e arteriolare del miocardio sono ovviamente ridotte nei ratti HF e sono alleviate in modo significativo da ECH, come mostrato nella Figura 7A-H. Studi precedenti hanno dimostrato che altri composti naturali, come il beta-glucano d'orzo, esercitano effetti cardioprotettivi aumentando l'espressione di MnSOD,48,49 e l'aumento di MnSOD è correlato all'aumento della densità capillare del miocardio e all'espressione di VEGF. Abbiamo eseguito RT-PCR per rilevare l'espressione di VEGF, i dati sono coerenti con il riscontro della colorazione istologica, il che significa che l'ECH può promuovere l'angiogenesi e aumentare la densità capillare del miocardio attraverso la regolazione dell'espressione di VEGF, come mostrato nella Figura 7I. Il presente studio rileva che l'ECH può proteggere e aumentare il capillare e l'arteriolare del miocardio attraverso la via di regolazione SIRTI/FOXO3a/MnSOD e l'espressione di VEGF, sopprimendo così il miocardio in letargo e contribuendo a migliorare la funzione cardiaca.

Cistanche contribuisceamigliorare la funzione cardiaca.

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Da notare che l'apoptosi dei cardiomiociti è ben nota per essere un importante cambiamento patologico nell'insufficienza cardiaca e il presente studio conferma infatti che una grande quantità di cellule apoptotiche nei ratti HF e nell'ECH riduce significativamente l'apoptosi attraverso la regolazione della via SIRTI/FOXO3a/MnSOD e l'inibizione stress ossidativo mitocondriale, come accennato in precedenza.

Soprattutto, l'ECH inverte il rimodellamento miocardico e migliora la funzione cardiaca sovraregolando l'asse di segnalazione SIRT1/FoxO3a/MnSOD, inibendo così lo stress ossidativo mitocondriale e riducendo il miocardio in letargo. Pertanto, si suggerisce che l'ECH sia un potenziale farmaco per la prevenzione o il trattamento del rimodellamento miocardico e dell'insufficienza cardiaca.