L'echinacoside stimola la proliferazione cellulare e previene l'apoptosi cellulare nelle cellule MODE-K epiteliali intestinali mediante la regolazione dell'espressione del fattore di crescita trasformante- 1

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Yamin Jia, Qiunong Guan, Yuhai Guo e Caigan Du

Astratto

Cistanche deserticola MA(C. deserticola) è stato ampiamente utilizzato come lassativo a base di erbe in erboristeria per il trattamento della sindrome dell'intestino irritabile o della stitichezza, eechinacoside da cistanche(ECH) è uno dei principali ingredienti bioattivi di questa erba. Il nostro scopo era di studiare l'effetto dell'ECH sulla crescita e la morte delle cellule epiteliali intestinali. MODE-K, una linea cellulare epiteliale intestinale, è stata utilizzata come modello in vitro dell'intestino. La proliferazione cellulare è stata misurata mediante il test del metil tiazolo tetrazolio (MTT). L'apoptosi cellulare è stata determinata con la colorazione con annessina-V. Qui abbiamo mostrato che nelle cellule MODE-K in coltura, l'ECH stimolava significativamente la proliferazione cellulare e migliorava la sopravvivenza cellulare riducendo l'apoptosi cellulare in presenza di H2O2 o la miscela di citochine pro-infiammatorie, mentre trasformava il fattore di crescita (TGF)- 1 l'espressione è stata sovraregolata in modo dose-dipendente. Il knockdown dell'espressione del TGF- 1 ha interrotto sia le attività proliferative che quelle citoprotettive dell'ECH, il che è stato ulteriormente confermato dalla neutralizzazione dell'attività del TGF- 1 utilizzando l'anticorpo anti-TGF- 1. Questi dati suggeriscono che l'ECH come uno degli ingredienti bioattivi in ​​erbe C. deserticola e altri può migliorare la riparazione del tessuto della mucosa stimolando la proliferazione delle cellule epiteliali intestinali e prevenendo la morte cellulare attraverso la sovraregolazione del TGF-.

Parole chiave: Cistanche deserticola, epitelio intestinale, proliferazione cellulare, apoptosi cellulare, fattore di crescita trasformante (TGF)-

introduzione

Cistanche deserticola MA(C. deserticola) è comunemente noto come Rou Cong Rong in erboristeria cinese ed è diventato una nuova coltura in Cina grazie al suo uso medico (1). Il suo beneficio clinico è stato riportato nel trattamento di molti problemi di salute tra cui la stitichezza cronica (2, 3) ei suoi effetti benefici sono associati alla sua attività lassativa a livello intestinale; migliora l'inumidimento delle feci, favorendo il movimento intestinale nei pazienti (4, 5), così come nei modelli animali (6, 7). Il nostro recente studio dimostra che la somministrazione orale di un estratto acquoso di C. deserticola riduce significativamente il numero di iperplasia infiammatoria nell'intestino di topi inclini al cancro del colon-retto (8).

Echinacoside da cistanche (ECH) is a major component of phenylethanoid glycosides (PhG) (>50% del PhG totale) isolato da C. deserticola (9) ed è stato utilizzato come biomarcatore per il controllo di qualità del farmaco lassativo contenente C. deserticola Ronggui Tongbian Capsule (10) o per il controllo di qualità della produzione di C. deserticola coltivata (11). È stato dimostrato che l'ECH è citoprotettivo sia in un modello animale di malattia di Parkinson (12, 13) che in un modello di danno polmonare (14) e in cellule di feocromocitoma in coltura (PC12) (15, 16); ed è stato dimostrato che migliora la divisione cellulare delle cellule fibroblastiche umane (MRC-5) (17). In questo studio, è stato esaminato l'effetto dell'ECH come principale ingrediente bioattivo di C. deserticola sulla proliferazione cellulare e sulla sopravvivenza nelle cellule epiteliali intestinali in coltura al fine di comprendere l'azione farmacologica della fitoterapia contenente C. deserticola nel trattamento dei disturbi intestinali .

Materiali e metodi

Coltura cellulare

MODE-K è una linea cellulare epiteliale intestinale derivata da topi C3H/HeJ (18) che è stata gentilmente fornita dal dottor Theodore Steiner (Vancouver Coastal Health Research Institute, Vancouver, Canada). Le cellule MODE-K sono state coltivate nel mezzo Eagle's modificato (DMEM) di Dulbecco, integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS) a 37 gradi sotto un 5% di CO2 nell'atmosfera dell'aria.

echinacoside da cistanche (ECH) preparazione

ECH (echinacoside da cistanche) è stato ulteriormente purificato dall'estratto commerciale di C. tubulosa (contenente maggiore o uguale al 70% di ECH, Tianlife TLCT-E70; Sinphar Tian-Li Pharmaceutical Co., Ltd., Hangzhou, Cina) mediante estrazione ripetuta con etanolo, seguita da aria- essiccazione in una cappa chimica. La sostanza rimanente è stata ulteriormente essiccata mediante liofilizzazione. L'ECH nel prodotto finale è stata confermata dalla cromatografia liquida ad alte prestazioni (Fig. 1).

Atterramento dell'espressione del fattore di crescita trasformante (TGF)- 1

L'espressione di TGF- 1 nelle cellule MODE-K è stata abbattuta dall'espressione stabile di shRNA specificamente contro il trascritto di TGF- 1 (19). In breve, sequenze di oligonucleotidi per la generazione di shRNA mirati all'mRNA di topo TGF- 1 (5′-AAC CAA GGA GAC GGA ATA CAG-3′) e controllo non specifico (criptato) (5′-AAT CGC ATA GCG TAT GCC GTT-3′) sono stati precedentemente descritti (19, 20) e sono stati sintetizzati da Integrated DNA Technologies Inc. (Coralville, IA, USA). Ciascuna sequenza è stata ligata in un vettore pHEX-siRNA (21). I vettori sono stati trasfettati in cellule MODE-K utilizzando Lipofectamine2000 (Invitrogen-Gibco, Carlsbad, CA, USA) seguendo il protocollo del produttore. Sia le cellule trasfettate con shRNA anti-TGF- 1 (MODE-Ktgfb) che le cellule scrambled trasfettate con shRNA (MODE-Kscr) sono state coltivate in presenza di zeocina (fino a 500 ug/mL) (Invitrogen-Gibco) e selezionate mediante smistamento cellulare mediante citometria a flusso per la proteina a fluorescenza verde (GFP). Più del 95 percento delle cellule trasfettate ha mostrato una forte fluorescenza verde in citometria a flusso o microscopia.

Saggio di metiltiazol tetrazolio (MTT).

Il test MTT è stato utilizzato per misurare la proliferazione o la vitalità cellulare nelle colture. Le cellule sono state seminate a 2500 per pozzetto in 96-micropiastre a pozzetti e ogni condizione è stata testata almeno in quadruplicato. In breve, 10 μL di 0,5 mg/ml di 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT; Sigma- Aldrich Canada, Oakville, ON, Canada) sono stati aggiunti a ciascun pozzetto e incubati a 37 gradi per 4 ore. I cristalli di formazano nelle cellule vitali sono stati quindi disciolti in 100 μL/pozzetto di dimetilsolfossido (DMSO, Sigma-Aldrich Canada). L'assorbanza del colore in ciascun pozzetto è stata quantificata come unità di assorbimento (AU) a una lunghezza d'onda di 560 nm utilizzando un lettore di micropiastre ELx808 (BioTek, Winooski, VT, USA). La percentuale di variazione della proliferazione cellulare nelle colture trattate con farmaci rispetto al controllo non trattato con farmaci è stata calcolata come segue: percento=(trattato con farmaci - Controllo) / Controllo × 100 percento. Il tasso di crescita è stato calcolato come segue: Tasso di crescita (AU/giorno)=(AUend − AUbegin) / ora (giorno), dove il tempo rappresentava il periodo dell'esame, AUend rappresentava le unità di assorbanza alla fine dell'esame , e AU inizia a rappresentare le unità di assorbanza all'inizio dell'esame.

Analisi dell'apoptosi mediante ordinamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS).

Per la determinazione dell'apoptosi cellulare è stata utilizzata l'analisi FACS con colorazione dell'Annessina-V-ficoeritrina (Annessina-V-PE) e 7-amino-actinomicina D (7-AAD) (Annexina-V positiva: apoptosi precoce ; 7-AAD: apoptosi tardiva/necrotica) secondo il protocollo del produttore (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Pertanto, nel grafico FACS, le cellule vitali erano nel quadrante in basso a sinistra, le cellule apoptotiche tardive nel quadrante in alto a sinistra (7-solo positivo per AAD), le cellule apoptotiche nel quadrante in alto a destra (sia annessina-V che {{ 10}}AAD positivo) e cellule apoptotiche precoci nel quadrante inferiore destro (solo annessina-V positiva). In breve, dopo il trattamento, le cellule sono state rilasciate mediante breve incubazione con una soluzione di tripsina-EDTA (Sigma Aldrich Canada) e quindi incubate con Annexin-V-PE in 1 × buffer di legame per 15 min. Dopo essere state lavate con PBS, le cellule sono state colorate con 7-AAD. L'intensità della fluorescenza delle cellule apoptotiche è stata misurata utilizzando la citometria a flusso e analizzata rispetto ai controlli di sfondo utilizzando il software CELLQUEST (BD Biosciences) o FlowJo (Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA).

Reazione a catena semiquantitativa della trascrizione inversa-polimerasi (RT-PCR)

I livelli di mRNA del TGF{{0}} sono stati determinati in modo semiquantitativo rispetto a quelli della gliceraldeide-3- fosfato deidrogenasi (GAPDH) come controllo interno utilizzando i kit RT-PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA ) come descritto in precedenza (19). Sia i trascritti TGF- 1 che GAPDH nella stessa preparazione di cDNA sono stati amplificati mediante PCR con 35 cicli di 94 gradi per 1 minuto, 57 gradi per 1 minuto e 15 s e 72 gradi per 1 minuto e 30 s dopo l'iniziale fase di denaturazione a 94 gradi per 1 min. È stato aggiunto un passaggio di estensione finale a 72 gradi per 10 minuti. Le coppie di primer specifiche per TGF- 1 e GAPDH sono state derivate da un precedente rapporto (19) (mTGF- 1: senso, 5′-TAC TAT GCT AAA GAG GTC ACC CGC e anti-senso, 5 ′- CTG TAT TCC GTC TCC TTG GTT CAG; mGAPDH: senso, 5′-ATC ACT GCC ACC CAG AAG ACT G, e anti-senso, 5′-CCC TGT TGC TGT AGC CGT ATT C). Il prodotto PCR risultante (25 μL) è stato sottoposto a elettroforesi su un gel di agarosio all'1% in tampone Tris-acetato-EDTA (TAE) contenente 0,5 ug/mL di bromuro di etidio e visualizzato sotto luce UV. I livelli di espressione di TGF- 1 sono stati comparati semiquantitativamente a quelli di GAPDH.

Macchia occidentale

I livelli cellulari di TGF- 1 sono stati esaminati mediante western blotting come descritto in precedenza (19). Le bande proteiche TGF- 1 nella macchia sono state identificate con l'anti-TGF monoclonale- 1 (A75-3) (BD Biosciences). La stessa macchia è stata nuovamente sondata utilizzando IgG anti--actina (Sigma-Aldrich Canada) per confermare la presenza di proteine ​​caricate in ciascun campione.

Saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) I livelli di TGF secreto- 1 nei supernatanti di coltura sono stati determinati mediante ELISA. Le cellule MODE-K (1,8 × 105 cellule/pozzetto in 0,5 mL di terreno DMEM) in 24-piastre a pozzetti in triplicato sono state coltivate durante la notte, seguite da incubazione in assenza o presenza di ECH(echinacoside da cistanche). I supernatanti di coltura sono stati raccolti dopo 24 ore di trattamento e la quantità di rilascio di TGF- 1 è stata determinata utilizzando il sistema di test immunologico TGF 1 Emax® seguendo il protocollo del produttore (Promega, Madison, WI, USA).

analisi statistiche

L'analisi della varianza a una o due vie (ANOVA) è stata utilizzata come appropriato per i confronti tra i gruppi. I dati sono stati raccolti da 3 a 4 esperimenti individuali in ogni studio per l'analisi statistica. Un valore P minore o uguale a 0.05 è stato considerato significativo.

Risultati

Stimolazione della proliferazione cellulare in colture cellulari MODE-K

La proliferazione cellulare è essenziale per la riparazione dei tessuti. L'effetto di ECH(echinacoside da cistanche)sulla proliferazione cellulare è stato esaminato in cellule MODE-K in coltura. Come mostrato in Fig. 2A, l'aggiunta di ECH ha stimolato la proliferazione cellulare, misurata dall'aumento della vitalità cellulare utilizzando il test MTT, in modo dose-dipendente. Rispetto al numero di cellule nelle colture non trattate con farmaci, il numero di cellule nelle colture trattate con ECH è aumentato del 25,6% ± 14,82% nelle colture con 6,26 ug/mL di ECH, 33,6% ± 14.0% con il 25 ug/mL di ECH, 64,4 percento ± 9,0 percento con 50 ug/mL di ECH e 99,4 percento ± 11,7 percento con 100 ug/ ml di ECH dopo 48-h di incubazione (P < 0.0{{50}}01).="" per="" confermare="" ulteriormente="" questa="" osservazione,="" è="" stato="" esaminato="" l'effetto="" di="" ech="" sulla="" curva="" di="" crescita="" cellulare="" mode-k="" in="" un="" periodo="" di="" {{30}}giorno.="" come="" mostrato="" in="" fig.="" 2b,="" l'aggiunta="" di="" 10="" ug/ml="" ottimizzato="" di="" ech="" ha="" aumentato="" significativamente="" il="" numero="" di="" cellule="" vitali="" dopo="" il="" tempo="" di="" incubazione="" rispetto="" a="" quelle="" in="" colture="" non="" trattate="" con="" farmaci="" (un="" controllo="" basale),="" indicato="" da="" l'aumento="" di="" au="" per="" colture="" con="" ech="" da="" 0.3{{70}}="" ±="" 0.02="" all'inizio="" del="" trattamento="" ech="" (0-punto="" temporale)="" a="" 1,49="" ±="" 0,08="" dopo="" 2="" giorni="" di="" incubazione="" e="" 2,20="" ±="" 0,11="" dopo="" 4="" giorni="" di="" incubazione,="" mentre="" per="" le="" colture="" non="" trattate="" con="" farmaci="" (solo="" medie)="" l'aumento="" è="" stato="" da="" 0,24="" ±="" 0,01="" all'inizio="" a="" 1,22="" ±="" 0,12="" dopo="" 2="" giorni="" e="" 1,68="" ±="" 0,11="" dopo="" 4="" giorni="" (medio="" vs.="" ech,="" p="">< 0,0001).="" i="" tassi="" di="" crescita="" in="" queste="" due="" colture,="" calcolati="" in="" base="" alla="" curva="" di="" crescita="" (fig.="" 2b),="" hanno="" indicato="" che="" l'ech="" ha="" migliorato="" significativamente="" i="" tassi="" di="" crescita="" nelle="" colture="" sia="" al="" giorno="" 2="" (0,56="" nelle="" colture="" trattate="" con="" ech="" rispetto="" a="" 0,35="" nei="" controlli="" non="" trattati="" con="" farmaci)="" sia="" giorno="" 3="" (0,43="" nelle="" colture="" trattate="" con="" ech="" contro="" 0,22="" nei="" controlli="" non="" trattati="" con="" farmaci)="" (fig.="" 2c).="" presi="" insieme,="" questi="" dati="" indicano="" che="" l'ech="" stimola="" la="" proliferazione="" cellulare="" nelle="" cellule="" epiteliali="" intestinali="">

Fig. 2. Stimolazione della crescita cellulare in cellule epiteliali intestinali coltivate mediante ECH. Le cellule MODE-K (2,500 cellule/pozzetto) sono state seminate in 96-piastre a pozzetti durante la notte, seguite da incubazione in presenza o assenza di ECH. Il numero di cellule vitali nelle colture è stato misurato mediante saggio MTT. A) Le colture sono state trattate con varie concentrazioni di ECH per 48 ore. L'aumento (percentuale) del numero di cellule nelle colture trattate con ECH è stato calcolato sulla base delle colture non trattate con farmaci come riferimento basale. P < 0,0001="" (anova="" unidirezionale).="" b)="" le="" colture="" sono="" state="" trattate="" con="" 10="" ug/ml="" di="" ech="" per="" 4="" giorni.="" le="" curve="" di="" crescita="" delle="" colture="" trattate="" con="" ech="" rispetto="" a="" quelle="" non="" trattate="" con="" farmaci="" (solo="" medie)="" sono="" state="" determinate="" dalle="" unità="" di="" assorbimento="" (au)="" a="" 560="" nm="" nel="" test="" mtt.="" p="">< 0,0001="" (medio="" vs.="" ech,="" anova="" a="" due="" vie).="" i="" dati="" sono="" presentati="" come="" media="" ±="" derivazione="" standard="" (ds)="" di="" esperimenti="" indipendenti.="" c)="" il="" tasso="" di="" crescita="" (variazione="" au/giorno)="" è="" stato="" calcolato="" sulla="" base="" della="" crescita="">e, il numero medio di ogni giorno.

Protezione delle cellule MODE-K dall'apoptosi

Proteggere le cellule dall'apoptosi è un meccanismo per prevenire ulteriori danni ai tessuti. L'attività citoprotettivo di ECH(echinacoside da cistanche)è stato esaminato in cellule MODE-K in coltura stimolate con perossido di idrogeno (H2O2) o miscela di citochine pro-infiammatorie (TNF- e IFN-). H2O2 è una specie reattiva dell'ossigeno generata dal metabolismo ossidativo e rappresenta uno scenario di stress ossidativo, mentre TNF- e IFN- sono citochine prominenti prodotte da cellule immunitarie attivate che riflettevano la situazione sotto l'infiammazione immuno-mediata. Come mostrato in Fig. 3, l'aggiunta di ECH (50 ug/mL) ha ridotto significativamente l'apoptosi, compreso il suo livello basale nelle colture trattate con H2O2, evidenziato da una diminuzione dell'apoptosi dai livelli basali di 5,3{{47 }} percento ± 1,24 percento nelle colture non trattate con farmaci al 3,76 percento ± 1.01 percento nelle colture trattate con ECH, dal 26,93 percento ± 1.86 percento nelle colture non trattate con farmaci al 14,08 percento ± 1,30 percento nelle colture trattate con ECH in presenza di 0,3 μM di H2O2 e dal 38,90 percento ± 1,76 percento nelle colture non trattate con farmaci al 19,88 percento ± 1,02 percento nelle colture trattate con ECH in presenza di 0,6 μM di H2O2 (P <0,0001 ,="" con="" trattamento="" medio/non="" farmacologico="" vs.="" trattato="" con="" ech).="" un="" simile="" effetto="" citoprotettivo="" dell'ech="" è="" stato="" osservato="" nelle="" colture="" stimolate="" con="" una="" miscela="" di="" citochine="" (fig.="" 4);="" l'apoptosi="" (51,5="" percento="" ±="" 6,30="" percento)="" nelle="" colture="" senza="" l'aggiunta="" di="" ech="" (controlli="" medi/non="" trattati="" con="" farmaci)="" era="" significativamente="" superiore="" a="" quella="" (38,50="" percento="" ±="" 5,60="" percento)="" nelle="" colture="" trattate="" con="" ech="" (p="0.0204," con="" trattamento="" medio="" non="" farmacologico="" rispetto="" a="" trattamento="" con="" ech),="" suggerendo="" che="" ech="" proteggeva="" le="" cellule="" mode-k="" dall'apoptosi="" indotta="" da="" citochine="" pro-infiammatorie.="" nel="" loro="" insieme,="" l'ech="" ha="" attività="" citoprotettiva="" contro="" l'apoptosi="" cellulare="" indotta="" dall'ossidazione="" di="" h2o2="" e="" la="" citotossicità="" delle="" citochine="">

Up-regolazione dell'espressione del TGF in cellule MODE-K in coltura

L'evidenza in letteratura suggerisce che il TGF- 1 svolge un ruolo importante nel danno e nella riparazione dei tessuti (22, 23) e nel recupero del tratto gastrointestinale dalla colite o dalla malattia infiammatoria intestinale (24). Per esaminare se il TGF- 1 svolge un ruolo nella proliferazione cellulare indotta da ECH e nella citoprotezione nelle cellule epiteliali intestinali in coltura, come dimostrato sopra, l'effetto di ECH(echinacoside da cistanche)sull'espressione di TGF{{0}} in cellule MODE-K in coltura è stata esaminata. I livelli di trascrizione di TGF- 1 sono stati esaminati mediante RT-PCR semiquantitativa, mentre i suoi livelli proteici sono stati determinati mediante western blotting (livelli cellulari totali) o ELISA (livelli proteici secreti). Come mostrato in Fig. 5A, la sovraregolazione dose-dipendente dei livelli di mRNA di TGF- 1 è stata osservata in colture trattate con ECH sia a 24 che a 48 ore dopo l'aggiunta di ECH. Una tendenza simile all'aumento dei livelli di proteina TGF{{10}} all'interno delle cellule è stata dimostrata dall'analisi western blotting (Fig. 5B). Dopo 24-h di incubazione in 0,5 mL di terreno di coltura contenente varie concentrazioni di ECH, anche i livelli secreti di TGF- 1 sono stati aumentati in modo indipendente dalla dose; da 186,4 ± 18,39 pg/mL in colture non trattate con farmaci (livelli basali) a 186,4 ± 18,39 pg/mL in colture con 25 ug/mL di ECH, 263,4 ± 14,14 pg/mL con 50 ug/mL di ECH e 266,4 ± 15,56 pg/mL con 100 ug/mL di ECH (P <0,0001). tutti="" questi="" dati="" indicano="" chiaramente="" che="" l'ech="" aumenta="" la="" produzione="" di="" tgf-="" 1="" nelle="" cellule="" epiteliali="" intestinali="" nelle="">

Perdita della stimolazione della crescita e della citoprotezione dell'echinacoside mediante knockdown genetico dell'espressione del TGF- 1

Per chiarire se il TGF- 1 ha contribuito alla stimolazione della crescita e alla riduzione dell'apoptosi nell'ECH(echinacoside da cistanche)-cellule trattate, l'espressione di TGF- 1 nelle cellule MODE-K è stata abbattuta esprimendo stabilmente anti-TGF- 1 shRNA, mediante la quale è stata generata una nuova linea cellulare MODE-Ktgfb. L'espressione della proteina TGF- 1 è stata ampiamente ridotta nelle cellule MODE-Ktgfb rispetto a quella nelle cellule MODE-Kscr che esprimevano stabilmente shRNA criptato (Fig. 6A). Come mostrato in Fig. 6B, la stimolazione proliferativa dell'ECH era significativamente compromessa nelle cellule MODE-Ktgfb; simile alla risposta proliferativa all'ECH nelle cellule MODE-K parentali (Fig. 2), il numero di cellule vitali è stato aumentato nelle cellule MODE-Kscr dopo la stimolazione ECH, aumento del 28,3% ± 12,4% nelle colture con 25 ug/mL di ECH, Aumento del 54,2% ± 6,8% con 5{{30}} ug/mL di ECH e aumento del 122,7% ± 20,8% nelle colture con 100 ug/mL di ECH. Al contrario, il numero di cellule è diminuito in presenza di ECH nelle colture cellulari MODE Ktgfb, 12,0% ± 5,0% di diminuzione nelle colture con 25 ug/mL di ECH, 18,3% ± 4,1% di diminuzione con 50 ug/mL di ECH e 30,4 percento ± 3,3 percento è diminuito con 100 ug/mL di ECH. L'analisi statistica con ANOVA a due vie ha indicato la differenza significativa di risposta proliferativa all'ECH tra questi due gruppi (P <0,0001). questi="" dati="" suggeriscono="" che="" la="" perdita="" dell'espressione="" di="" tgf-="" 1="" nelle="" cellule="" epiteliali="" intestinali="" compromette="" la="" stimolazione="" della="" crescita="">

Per esaminare ulteriormente se l'espressione TGF- 1 sovraregolata in ECH(echinacoside da cistanche)-le cellule trattate hanno provocato una riduzione dell'apoptosi, l'attività anti-apoptotica dell'ECH è stata esaminata nelle cellule MODE-Ktgfb rispetto alle cellule MODE-Kscr. Come mostrato in Fig. 6C, rispetto alle colture cellulari MODE-Kscr, i livelli di apoptosi erano più alti nelle colture cellulari MODE-Ktgfb in assenza di citochine (11,2% ± 0.42% in MODE-Ktgfb vs .9,6 percento ± 0,99 percento in MODE-Kscr) e in presenza di citochine (20,95 percento ± 0.07 percento in MODE- Ktgfb rispetto a 15,4 percento ± 1,56 percento in MODE-Kscr) (P=0.0{{60}}}13), suggerendo che TGF- 1 è un anti -fattore apoptotico nelle cellule MODE K. L'aggiunta di ECH (50 ug/mL) alle colture cellulari MODE-Kscr ha ridotto significativamente i livelli basali di apoptosi (9,6% ± 0,99% nel trattamento non farmacologico contro 8,3% ± 0,43% nel trattamento con ECH) e il 30,2% della riduzione dell'apoptosi è stato riscontrato in colture stimolate con citochine (15,4% ± 1,56% nel non trattato con farmaci rispetto al 10,75% ± 1,05% nel trattamento con ECH). Tuttavia, nelle colture cellulari MODE-Ktgfb, l'ECC non ha ridotto i livelli basali di apoptosi (11,2% ± 0,42% nel trattamento non farmacologico rispetto al 12,0% ± 0,43% nel trattamento con ECH) e solo il 16,71% della riduzione dell'apoptosi, rispetto a Il 30,2% nelle colture cellulari MODE-Kscr è stato osservato in colture stimolate con citochine (20,95% ± 0,07% nel trattamento non farmacologico rispetto al 17,45% ± 0,35% nel trattamento con ECH). Questi dati indicano che il knockdown dell'espressione del TGF- 1 nelle cellule epiteliali intestinali peggiora l'apoptosi e diminuisce l'attività citoprotettivo dell'ECH.

Perdita di stimolazione della crescita e citoprotezione di ECH(echinacoside da cistanche)mediante neutralizzazione dell'attività del TGF- 1 mediante anticorpi

Per confermare ulteriormente che il TGF- 1 potrebbe essere necessario per la stimolazione della crescita e la citoprotezione dell'ECH(echinacoside da cistanche)nelle cellule epiteliali intestinali come descritto sopra (Fig. 6), l'effetto di neutralizzazione dell'anticorpo anti-TGF- 1 (Clone 9016; R&D Systems Inc. Minneapolis, MN, USA) su ECH-mediato la proliferazione cellulare e la sopravvivenza sono state esaminate in colture cellulari MODE-K. Come mostrato in Fig. 7A, l'aggiunta di ECH (25 ug/mL) ha stimolato un aumento del 44,3% ± 8,2% del numero di cellule nei controlli non trattati con anticorpi, ma in presenza di anticorpi anti-TGF- 1 , nelle stesse colture trattate con ECH è stata osservata una perdita dell'11,3% ± 9,10 del numero di cellule, suggerendo che la neutralizzazione dell'attività del TGF- 1 diminuiva la stimolazione della crescita dell'ECH nelle cellule epiteliali intestinali. Gli ulteriori esperimenti hanno dimostrato che l'anticorpo anti-TGF- 1 neutralizzava anche l'attività citoprotettivo dell'ECH nelle colture cellulari MODE-K; l'aggiunta di ECH ha ridotto l'apoptosi dal 4,37% ± 1,19% nelle colture non trattate con farmaci all'1,72% ± {{50}},01% nelle colture trattate con ECH dopo 24 h di incubazione e dall'11,13% ± 1,12% nelle colture non trattate con farmaci al 9,13% ± 0,02% nelle colture trattate con ECH dopo 48 h di incubazione (non farmaco/medio vs. ECH, ANOVA a due vie, P=0.0001). Tuttavia, in presenza di anticorpi anti-TGF- 1, l'apoptosi nelle colture trattate con ECH (2,88% ± 0,01% dopo 24-h di incubazione; 12,58% ± 0,02% dopo 48-h di incubazione ) non differiva significativamente da quelli nelle colture di controllo (non trattate con farmaci) (ANOVA a due vie, P=0.9427), il che implica che l'anticorpo anti-TGF- 1 interferisce con la sopravvivenza mediata da ECH nell'intestino cellule epiteliali.

Discussione

ECH(echinacoside da cistanche)non è solo un importante PhG nell'estratto di erbe Cistanche spp. ma si trova anche in molte altre piante medicinali come Echinacea spp. (25, 26). È stato riportato che questo composto naturale ha attività antiossidante in vitro e in vivo (13, 27, 28). Tuttavia, il meccanismo o i meccanismi della sua azione rimangono sconosciuti. I nostri risultati del presente studio dimostrano per la prima volta in un modello in vitro che l'ECH stimola la proliferazione e la sopravvivenza delle cellule epiteliali intestinali, che dipende dal TGF- 1.

L'aggiunta di ECH(echinacoside da cistanche)riduce l'apoptosi cellulare nelle cellule MODE-K trattate con H2O2- o miscela di citochine pro-infiammatorie (TNF e IFN-) (Figg. 3 e 4) e anche in altri tipi cellulari (16, 29) e il knockdown dell'espressione di TGF- 1 o il blocco della sua attività comporta l'abolizione della sua attività anti-apoptotica (Figg. 6 e 7), indicando che la citoprotezione dell'ECH dipende dalla produzione di TGF- 1 (Fig. 5). Il nostro precedente studio ha dimostrato che il TGF- 1 induce l'espressione anti-apoptotica di Bcl-2 e previene l'apoptosi mediata dal TNF nelle cellule epiteliali tubulari renali (19). Risultati simili sono stati riportati in altri tipi di cellule; l'aggiunta di TGF- 1 nelle cellule endoteliali dell'arteria polmonare in coltura aumenta il livello basale di Bcl-2 e previene l'apoptosi indotta dalla deprivazione sierica e dal blocco del recettore del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) (30); e in colture di cellule progenitrici neurali (NPC), migliora (di circa il 76 percento) la sopravvivenza cellulare contro il trattamento con H2O2, che è correlato con la sovraregolazione dell'espressione di Bcl-2 (31). Sebbene l'effetto dell'ECH sull'espressione di Bcl-2 nelle cellule MODE-K non sia stato esaminato in questo studio, la correlazione dell'up-regulation di Bcl-2 con l'attività anti-apoptotica dell'ECH è stata riportata nel TNF - –cellule neuronali SHSY5Y trattate (29) o cellule PC12 trattate con H2O2- (15). Presi insieme, questi dati suggeriscono che l'attività anti-apoptotica dell'ECH può essere mediata dal TGF- 1 tramite un percorso Bcl-2.

È possibile che la citoprotezione di ECH(echinacoside da cistanche)potrebbe contribuire a un leggero aumento del numero di cellule vitali diminuendo la morte cellulare spontanea alla fine dell'incubazione, ma l'aggiunta di ECH (100 ug/mL) quasi raddoppia le cellule vitali dopo 48-h trattamento (Fig. 2A) , suggerendo che l'ECH stimola effettivamente la proliferazione cellulare che è ulteriormente confermata dai dati in Fig. 2, B e C. Un effetto simile dell'ECH è stato riportato nelle cellule fibroblastiche umane, MRC-5 (17): in MRC{ {6}} colture cellulari, ECH potrebbe ritardare la senescenza cellulare inducendo il ciclo cellulare dalla fase G1 alla fase S e alla fase G2. Come l'attività anti-apoptotica dell'ECH, l'attività proliferativa dell'ECH dipende dal TGF- 1 (Figg. 6 e 7) che è stato ben documentato come una citochina multifunzionale (32, 33). Il TGF- può stimolare la proliferazione cellulare o indurre l'arresto della crescita a seconda del tipo cellulare o del microambiente extracellulare; attiva molteplici vie di segnalazione tra cui Smad e non Smad (ad esempio, le protein chinasi attivate dal mitogeno) (34, 35), ma quale via media la proliferazione cellulare stimolata da ECH/TGF nelle cellule MODE-K necessita di ulteriori indagini.

Ad oggi, si sa poco sulle proteine ​​​​bersaglio di ECH(echinacoside da cistanche)o la via o le vie del segnale che regola. Uno studio mostra che il trattamento con ECH aumenta i livelli cellulari di guanosina monofosfato ciclico (cGMP) nelle cellule endoteliali (36) e l'aggiunta di 8-Bromo-cGMP aumenta modestamente l'espressione di TGF- 1 nei fibroblasti cardiaci (37 ). Tuttavia, se il trattamento con ECH eleva cGMP e in base al quale ECH stimola l'espressione di TGF- 1 nelle cellule epiteliali intestinali in coltura, sono necessarie ulteriori indagini.

In conclusione, il nostro studio dimostra che ECH(echinacoside da cistanche)induce la produzione di TGF- 1 che media la proliferazione cellulare e la sopravvivenza cellulare nelle cellule epiteliali intestinali coltivate. La segnalazione del TGF nell'epitelio intestinale è necessaria per la riparazione o la guarigione della lesione della mucosa nei topi con colite indotta da destrano solfato di sodio (38), suggerendo che l'ECH, forse C. deserticola a base di erbe contenente ECH o altri, può avere un potenziale terapeutico per promuovere il danno della mucosa riparazione nei pazienti.

Riconoscimento

YJ è stato supportato da una borsa di studio per studenti laureati del China Scholarship Council, in Cina.

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