Parte Ⅱ: Meccanismo di regolazione dell'autofagia nei topi PD indotti da MPTP tramite la via di segnalazione MTOR di Echinacoside
Mar 06, 2022
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Miglioramento dei sintomi neurocomportamentali nei topi PD indotti da MPTP da Echinacoside
L'echinacoside ha ridotto il tempo di arrampicata nei topi PD indotti da MPTP
Il T-turn e il T-Total nel gruppo M erano notevolmente più lunghi di quelli del gruppo N (P < 0.01).="" il="" t-turn="" e="" il="" t-total="" nel="" gruppo="" eh="" sono="" diminuiti="" significativamente="" rispetto="" a="" quelli="" nel="" gruppo="" m="" (p="">< 0.01).="" rispetto="" al="" gruppo="" eh="" e="" al="" gruppo="" m,="" i="" due="" indici="" precedenti="" nel="" gruppo="" cq="" e="" nel="" gruppo="" wo="" sono="" aumentati="" in="" modo="" significativo="" (rispettivamente="" p=""><0,01 e="" p=""><0,05). i="" confronti="" tra="" il="" gruppo="" eh="" e="" il="" gruppo="" ra="" hanno="" mostrato="" che="" non="" c'era="" alcuna="" differenza="" significativa="" in="" t-turn="" e="" t-total="" (come="" illustrato="" nella="" figura="">
L'echinacoside fa bene alla salute
L'echinacoside ha aumentato l'attività spontanea nei topi PD indotti da MPTP
Il numero di allevamento entro cinque minuti e la distanza totale entro 30 minuti sono tutti diminuiti significativamente nel gruppo M rispetto a quelli nel gruppo N (P < 0.01).="" i="" due="" indici="" precedenti="" sono="" aumentati="" significativamente="" nel="" gruppo="" eh="" e="" nel="" gruppo="" ra="" rispetto="" a="" quelli="" del="" gruppo="" m="" (p=""><{7}}.01). rispetto="" al="" gruppo="" eh,="" il="" numero="" di="" allevamenti="" e="" la="" distanza="" totale="" sono="" diminuiti="" significativamente="" nel="" gruppo="" cq="" e="" nel="" gruppo="" wo="" (p=""><0,01). non="" ci="" sono="" state="" differenze="" statisticamente="" significative="" nei="" due="" indici="" precedenti="" tra="" il="" gruppo="" eh="" e="" il="" gruppo="" ra="" (p=""> 0,05) (come mostrato nella Figura 1B).
Figura I Il neurocomportamento nei topi di ciascun gruppo.
（A） Il test del polo nei topi di ciascun gruppo∶ Tempo di svolta （T-Tumn）; Tempo totale di attenuazione （下Totl）.
（B） L'attività spontanea nei topi di ciascun gruppo: i tempi di erezione entro cinque minuti (Numero di allevamento); La distanza del movimento orizzontale entro 30 minuti (Distanza totale).
(C) L'analisi dell'andatura nei topi di ciascun gruppo: la lunghezza del passo dell'arto anteriore; La lunghezza del passo dell'arto posteriore.
(D) Il rotarod nei topi di ciascun gruppo: il tempo di permanenza sul rotarod (noto anche come latenza alla caduta)
Note:*P<0.05,**p><0.0i, compared="" with="" the="" model=""><0.0l, compared="" with="" the="" high-dose="">echinacosidegruppo, n =6.
L'echinacoside ha prolungato i passi degli arti anteriori e posteriori nei topi PD indotti da MPTP
Il passo degli arti anteriori e posteriori si è ridotto significativamente nel gruppo M rispetto a quelli del gruppo N (P < {{0}}.01).="" il="" passo="" degli="" arti="" anteriori="" e="" posteriori="" è="" aumentato="" significativamente="" nel="" gruppo="" eh="" e="" nel="" gruppo="" ra="" rispetto="" a="" quelli="" del="" gruppo="" m="" (p=""><{6}}.01). rispetto="" al="" gruppo="" eh="" e="" al="" gruppo="" m,="" i="" passi="" degli="" arti="" anteriori="" e="" posteriori="" erano="" significativamente="" ridotti="" nel="" gruppo="" cq="" e="" nel="" gruppo="" wo="" (rispettivamente="" p=""><0,01 e="" p=""><0,05). non="" ci="" sono="" state="" differenze="" statisticamente="" significative="" nei="" passi="" degli="" arti="" anteriori="" e="" posteriori="" tra="" il="" gruppo="" eh="" e="" il="" gruppo="" ra="" (come="" dimostrato="" nella="" figura="">
L'echinacoside ha prolungato la latenza alla caduta nei topi PD indotti da MPTP
Il tempo di permanenza sul rotarod, noto anche come latenza alla caduta, è stato significativamente ridotto nel gruppo M rispetto al gruppo N (P < {{0}}.01).="" la="" latenza="" alla="" caduta="" è="" aumentata="" significativamente="" nel="" gruppo="" eh="" e="" nel="" gruppo="" ra="" rispetto="" al="" gruppo="" m="" (p="">< 0.01).="" la="" latenza="" alla="" caduta="" si="" è="" ridotta="" significativamente="" nel="" gruppo="" cq="" e="" nel="" gruppo="" wo="" (p=""><0,01 e="" p=""><0,05, rispettivamente)="" rispetto="" al="" gruppo="" eh="" e="" al="" gruppo="" m.="" non="" ci="" sono="" state="" differenze="" statisticamente="" significative="" nella="" latenza="" a="" cadere="" tra="" il="" gruppo="" eh="" e="" il="" gruppo="" ra="" (p=""> 0,05) (come mostrato nella Figura 1D).
Echinacosidefa bene alla salute
L'echinacoside ha aumentato il contenuto di DA e metaboliti nello striato nei topi PD indotti da MPTP
Rispetto al gruppo N, il contenuto di DA, DOPAC e HVA nel gruppo M si è ridotto significativamente (P < {{0}}.01).="" il="" contenuto="" di="" da,="" dopac="" e="" hva="" è="" aumentato="" significativamente="" nel="" gruppo="" eh="" e="" nel="" gruppo="" ra="" rispetto="" a="" quelli="" del="" gruppo="" m="" (p=""><0.01). rispetto="" al="" gruppo="" eh="" e="" al="" gruppo="" m,="" il="" contenuto="" di="" da,="" dopac="" e="" hva="" è="" diminuito="" significativamente="" nel="" gruppo="" cq="" e="" nel="" gruppo="" wo="" (p=""><0.01 e="" p=""><0,05, rispettivamente)="" .="" non="" ci="" sono="" state="" differenze="" statisticamente="" significative="" nei="" contenuti="" di="" da,="" dopac="" e="" hva="" tra="" il="" gruppo="" eh="" e="" il="" gruppo="" ra="" (p=""> 0,05) (come mostrato nella Figura 2A-C). Rispetto al gruppo N, il contenuto di 5-HT è diminuito significativamente nel gruppo M (P <0,01) e="" il="" contenuto="" di="" 5-ht="" nel="" gruppo="" eh="" è="" aumentato="" significativamente="" (p=""><0,01). rispetto="" al="" gruppo="" eh,="" il="" contenuto="" di="" 5-ht="" è="" diminuito="" significativamente="" nel="" gruppo="" cq="" e="" nel="" gruppo="" wo="">< 0.01)="" (as="" demonstrated="" in="" figure="">
Figura 2 Rilevamento del contenuto del neurotrasmettitore nello striato mediante il metodo elettrochimico in fase liquida ad alte prestazioni (HPLC-ECD).
(A) Dopamina (DA):
(B) acido diidrossifenibacetico (DOPAC);
(C) acido omovanllico (HVA);
(D) 5-idrossitriptamina (5-HT).
Note:*P < 0.05.*P<00 i.="" compared="" with="" the="" model="" group;=""><><001.compared with="" the="" high-dose="">echinacosidegruppo
L'echinacoside ha aumentato l'espressione di TH nella Substantia Nigra e ha ridotto l'espressione di -synuclein nei topi PD
In primo luogo, è stata condotta una doppia colorazione con immunofluorescenza per TH e -sinucleina. Rispetto al gruppo N, l'espressione di TH nella substantia nigra si è ridotta significativamente nel gruppo M, mentre l'espressione di -sinucleina è aumentata significativamente. Tuttavia, rispetto al gruppo M, l'espressione di -sinucleina è diminuita significativamente nel gruppo EH e nel gruppo RA. Le espressioni di -sinucleina sono aumentate significativamente nel gruppo CQ e nel gruppo WO, che erano persino superiori a quelle del gruppo M (come dimostrato nella Figura 3).
Figura 3 doppia colorazione di immunofluorescenza di TH e a-sinucleina nel sostanziale nigra nei topi di ciascun gruppo.
La figura mostrava la doppia colorazione con immunofluorescenza della tirosina idrossilasi (TH)
-sinucleina nella substantia nigra nei topi di ciascun gruppo n =6
l'ingrandimento del microscopio a fluorescenza: 200×.TH è stato sanguinato con fluorescenza verde,
Il 2° studente sanguinava con fluorescenza rossa, il DAPI blu rappresentava i nudi.
La sovrapposizione del 2° rosso verde era la cellula positiva a doppia colorazione (giallo).
Quindi, è stata adottata una macchia occidentale per misurare i due indicatori di cui sopra. I risultati hanno mostrato che l'espressione proteica di TH nel gruppo M era significativamente inferiore a quella nel gruppo N (P < {{0}}.01).="" le="" espressioni="" proteiche="" di="" th="" nel="" gruppo="" eh="" e="" nel="" gruppo="" ra="" sono="" aumentate="" in="" modo="" significativo="" rispetto="" a="" quelle="" del="" gruppo="" m="" (p=""><{7}}.{{1{13}}}}1). le="" espressioni="" proteiche="" di="" th="" nel="" gruppo="" cq="" e="" nel="" gruppo="" wo="" erano="" significativamente="" diminuite="" rispetto="" a="" quelle="" nel="" gruppo="" eh="" (p=""><0,01). anche="" l'espressione="" proteica="" della="" -sinucleina="" nel="" gruppo="" m="" è="" aumentata="" rispetto="" al="" gruppo="" n="" (p=""><0,01). tuttavia,="" le="" espressioni="" proteiche="" di="" -sinucleina="" nel="" gruppo="" eh="" e="" nel="" gruppo="" ra="" sono="" diminuite="" significativamente="" rispetto="" a="" quelle="" nel="" gruppo="" m="" e="" le="" differenze="" erano="" statisticamente="" significative="" (p=""><0,01). rispetto="" al="" gruppo="" eh="" e="" al="" gruppo="" m,="" le="" espressioni="" proteiche="" della="" -sinucleina="" nel="" gruppo="" cq="" e="" nel="" gruppo="" wo="" sono="" aumentate="" in="" modo="" significativo="" e="" le="" differenze="" erano="" statisticamente="" significative="" (p=""><0,01) (come="" mostrato="" nella="" figura="">
Figura 4 I cambiamenti delle espressioni proteiche di TH e -sinucleina nel sostanziale nigra nei topi di ciascun gruppo.
Note∶甲P<><00i,compared with="" the="" model="" group;=""><><00i,compared with="" the="" high-dose="">echinacosidegruppo n=6.
L'echinacoside ha ridotto l'espressione di P62 nella Substantia Nigra nei topi PD indotti da MPTP
In primo luogo, è stata adottata una macchia occidentale per rilevare l'espressione proteica di P62. I risultati hanno rivelato che l'espressione proteica di P62 nel gruppo M è aumentata notevolmente rispetto al gruppo N (P < 0.01).="" le="" espressioni="" proteiche="" di="" p62="" nel="" gruppo="" eh="" e="" nel="" gruppo="" ra="" sono="" diminuite="" notevolmente="" rispetto="" al="" gruppo="" m="" e="" le="" differenze="" erano="" statisticamente="" significative="" (p=""><{8}}.01). rispetto="" al="" gruppo="" eh,="" le="" espressioni="" proteiche="" di="" p62="" nel="" gruppo="" cq="" e="" nel="" gruppo="" wo="" sono="" aumentate="" notevolmente="" (p=""><0,01) (come="" mostrato="" nella="" figura="" 5c).="" quindi,="" è="" stata="" condotta="" la="" colorazione="" con="" immunofluorescenza="" per="" p62="" e="" dapi.="" è="" stato="" riscontrato="" che="" rispetto="" al="" gruppo="" n,="" il="" p62="" nella="" substantia="" nigra="" è="" aumentato="" in="" modo="" più="" evidente="" nel="" gruppo="" m,="" le="" espressioni="" di="" p62="" sono="" diminuite="" nel="" gruppo="" eh="" e="" nel="" gruppo="" ra="" e="" le="" espressioni="" di="" p62="" sono="" aumentate="" nel="" gruppo="" cq="" e="" wo="" gruppo="" (come="" dimostrato="" nella="" figura="">
Figura 5 I cambiamenti delle espressioni proteiche della colorazione con immunofluorescenza Becin I, LC3ll P62 e P62 nella substantia nigra nei topi di ciascun gruppo.
Note:*P<><00l, compared="" with="" the="" model=""><>< 0.0i,="" compared="" with="" the="" high-dose="">echinacosidegruppo
L'ingrandimento del microscopio a fluorescenza: 200×.P62 è stato etichettato con fluorescenza rossa. La DAPI blu rappresentava il nudo, n= 6.
L'echinacoside ha aumentato l'espressione di Beclin 1 e LC3II nella Substantia Nigra nei topi PD indotti da MPTP
In primo luogo, è stata adottata una macchia occidentale per determinare l'espressione proteica di Beclin 1 nella substantia nigra nei topi di ciascun gruppo. È stato riscontrato che l'espressione proteica di Beclin 1 nel gruppo M è aumentata in modo significativo rispetto al gruppo N (P <0.01). tuttavia,="" gli="" aumenti="" dell'espressione="" proteica="" di="" beclin="" 1="" nel="" gruppo="" eh="" e="" nel="" gruppo="" ra="" erano="" più="" evidenti="" (p=""><{8}}.01). rispetto="" al="" gruppo="" eh="" e="" al="" gruppo="" m,="" le="" espressioni="" proteiche="" di="" beclin="" 1="" nel="" gruppo="" cq="" e="" nel="" gruppo="" wo="" sono="" diminuite="" in="" modo="" significativo="" e="" le="" differenze="" erano="" statisticamente="" significative="" (p=""><0,01) (come="" dimostrato="" nella="" figura="">
Poiché LC3 è un indicatore chiave dell'autofagia, è stata condotta una doppia colorazione per TH e LC3. I risultati hanno mostrato che il numero di cellule LC3 positive nel gruppo M è aumentato significativamente rispetto a quello del gruppo N. Il numero di cellule LC3 positive nel gruppo EH e nel gruppo RA è aumentato in modo più significativo rispetto al gruppo M. Tuttavia, quando si utilizza l'inibitore dell'autofagia, il numero di cellule LC3 positive nel gruppo WO era significativamente inferiore a quello del gruppo M, mentre il numero di cellule LC3 positive non è diminuito in modo significativo nel gruppo CQ (come mostrato nella Figura 6) . Quindi, una macchia occidentale è stata utilizzata per rilevare l'espressione proteica di LC3 nella substantia nigra nei topi di ciascun gruppo. I risultati hanno indicato che l'espressione proteica di LC3II nel gruppo M è aumentata significativamente rispetto al gruppo N (P <{9}}.01). le="" espressioni="" proteiche="" di="" lc3ii="" nel="" gruppo="" eh,="" nel="" gruppo="" ra="" e="" nel="" gruppo="" cq="" sono="" tutte="" aumentate="" in="" modo="" significativo="" rispetto="" al="" gruppo="" m="" (p=""><0.01). nel="" gruppo="" wo,="" l'espressione="" proteica="" di="" lc3ii="" è="" diminuita="" rispetto="" al="" gruppo="" eh="" e="" al="" gruppo="" m="" e="" le="" differenze="" erano="" statisticamente="" significative="" (p=""><0,01 e="" p=""><0,05, rispettivamente)="" (come="" dimostrato="" nella="" figura="">
Echinacosideè buono per guarireth
I cambiamenti dell'ultrastruttura e degli autofagosomi di Substantia Nigra osservati dal microscopio elettronico a trasmissione
Attraverso l'osservazione dell'ultrastruttura di substantia nigra, è stato riscontrato che, ad eccezione del gruppo N, i topi mostravano tutti vari gradi di danno dell'ultrastruttura di substantia nigra, manifestato come rigonfiamento dei mitocondri, espansione del reticolo endoplasmatico ruvido, espansione del Golgi, aumento di lisosomi e formazione di autofagosomi con struttura a doppia membrana. Il numero di autofagosomi nel gruppo EH, nel gruppo RA e nel gruppo CQ è aumentato significativamente rispetto ad altri gruppi. Il numero di autofagosomi nel gruppo CQ era superiore a quello nel gruppo M, il che era coerente con i risultati di un aumento dell'espressione proteica di LC3II nella doppia colorazione a fluorescenza e nel Western blot. Ha anche suggerito che il numero di LC3II e autofagosomi fosse correlato in una certa misura. Non c'è stato un aumento evidente degli autofagosomi nel gruppo WO, suggerendo che in questo gruppo, l'aumento dell'autofagia causato daechinacosideè stato inibito (come dimostrato nella Figura 7).
Figura 7 I cambiamenti ultrastrutturali e la formazione di autofagosoma nel sostanziale nigra nei topi di ciascun gruppo.
(A) Il normale gruppo di controllo salino, con la struttura normale della substantia nigra;
(B) il gruppo modello, con le manifestazioni di gonfiore dei mitocondri, espansione ruvida del reticolo endoplasmatico e formazione di lisosoma e autofagosoma:
(C e D) ilechinacosideopera. con una formazione relativamente maggiore di lisosoma e autofagosoma:
(E) il gruppo della rapamicina, con manifestazioni di rigonfiamento dei mitocondri e formazione di lisosomi e autofagosomi;
(F) il gruppo della clorochina, con manifestazioni di rigonfiamento dei mitocondri e formazione di lisosomi e autofagosomi:
(G e H) il gruppo wortmannin. con mitocondri notevolmente ingrossati, reticolo mik rouch edopbs espanso
(G) e gonfiore dei mitocondri2. espansione del reticolo endoplasmatico ruvido, evidente espansione dei Gds e aumento dei Misosomi.
L'effetto dell'echinacoside sull'espressione proteica di AKT e mTOR in Substantia Nigra nei topi PD indotti da MPTP
Western blot è stato utilizzato per rilevare l'espressione proteica di AKT e mTOR in ciascun gruppo. I risultati hanno rivelato che rispetto al gruppo N, l'espressione proteica di p-AKT/AKT è diminuita notevolmente nel gruppo M (P <0.01). le="" espressioni="" proteiche="" di="" p-akt/akt="" nel="" gruppo="" eh="" e="" nel="" gruppo="" ra="" sono="" aumentate="" notevolmente="" rispetto="" al="" gruppo="" m="" (p=""><{7}}.{{1{14}}}}1) e="" l'espressione="" proteica="" di="" p-akt/akt="" nel="" gruppo="" eh="" era="" superiore="" a="" quello="" nel="" gruppo="" ra="" (p="">< 0.01).="" rispetto="" al="" gruppo="" eh,="" le="" espressioni="" proteiche="" di="" p-akt/akt="" nel="" gruppo="" cq="" e="" nel="" gruppo="" wo="" sono="" diminuite="" notevolmente="" (p=""><0,01) (come="" mostrato="" nella="" figura="" 8).="" inoltre,="" è="" stato="" riscontrato="" che="" l'espressione="" proteica="" di="" p-mtor/mtor="" nel="" gruppo="" m="" era="" leggermente="" inferiore="" a="" quella="" del="" gruppo="" n="" (p=""><0,05), ma="" la="" diminuzione="" dell'espressione="" proteica="" di="" p-mtor/mtor="" era="" più="" significativa="" in="" il="" gruppo="" eh="" e="" il="" gruppo="" ra="" rispetto="" al="" gruppo="" m="" (p=""><0,01). rispetto="" al="" gruppo="" eh,="" l'espressione="" proteica="" di="" p-mtor/mtor="" è="" aumentata="" nel="" gruppo="" cq="" e="" nel="" gruppo="" wo="" (p=""><0,01) (come="" dimostrato="" nella="" figura="" 8,="" la="" parte="">
Figura 8 I cambiamenti delle espressioni proteiche di AKT e mTOR nel sostanziale nigra nei topi di ciascun gruppo.
Note: *P < {{0}}.05,="" **p="">< 0,01,="" rispetto="" al="" gruppo="" di="" modelli;="">< 0.01,="" compared="" with="" the="" high-dose="">echinacosidegruppo, n= 6.
Echinacosideè buono per guarireth
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