PARTE Ⅰ: L'analogo dell'acido epossiicosatrienoico mirato ai reni, EET-F01, riduce l'infiammazione, lo stress ossidativo e la nefrotossicità indotta dal cisplatino

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John D. Imig, Md Abdul Hye Khan & et al.

1. Introduzione

La malattia renale nei pazienti oncologici e nei sopravvissuti è emersa come un grave problema sanitario e continua ad aumentare drasticamente [1–3]. Le più recenti terapie contro il cancro hanno aumentato i tassi di guarigione e i tempi di sopravvivenza, ma le anomalie dei fluidi e degli elettroliti associati alla terapia e il danno renale acuto che progredisce verso la malattia renale cronica sono sequele comuni [3-5]. Anche i farmaci antitumorali, gli inibitori della tirosin-chinasi del recettore del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGFRI) e i derivati ​​del platino possono causare gravi danni renali che ne compromettono significativamente l'uso efficace e sicuro [3-5]. Vi è una significativa necessità clinica di nuove terapie per trattare e fermare efficacemente le malattie renali nei pazienti oncologici. Questo problema sanitario ha portato allo sviluppo, all'evoluzione e all'emergere di una sottospecialità, Onco Nephrology [5]. I trattamenti attuali rallentano solo la perdita della funzione renale o non hanno alcun beneficio [2,5,6]. Sono urgentemente necessari nuovi approcci. La nostra ricerca in corso sta attaccando questa emergente arena del cancro e siamo concentrati sullo sviluppo di analoghi dell'acido epossiicosatrienoico (EET) per proteggere il rene dalla tossicità associata alla terapia del cancro.

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Gli analoghi dell'EET sono basati sulla parte farmacoforica degli EET e sono progettati con una migliore solubilità e resistenza all'autoossidazione e al metabolismo da parte dell'epossido idrolasi solubile (sEH)[7,8]. Precedenti studi hanno dimostrato che gli analoghi sintetici dell'EET sono protettivi del rene in diverse condizioni patologiche come l'ipertensione, indotta da farmacinefrotossicitàe nefrite lupica [9-13]. Gli analoghi dell'EET riducono il danno renale in questi stati patologici attraverso attività vasodilatatrice, diuretica, antinfiammatoria, antiossidante e anti-apoptotica[10-13]. Questi studi hanno chiaramente dimostrato che un approccio basato sull'EET combatte il danno renale in situazioni patologiche di diverse eziologie. Recentemente, sono stati fatti tentativi per sviluppare analoghi dell'EET che possiedono la proprietà unica di colpire il rene. Una nuova forma di analogo EET mirato ai reni è stata progettata e sintetizzata coniugando il farmacoforo EET con acido folico (EET-F01). Nel presente studio, abbiamo studiato la capacità diEET-F01mirare al rene rispetto all'analogo EET, EET-A. EET-FO1 e EET-A sono stati confrontati per la loro capacità di ridurre il danno renale indotto da cisplatino. Infine, questo studio ha ulteriormente delineato le azioni protettive antinfiammatorie e antiossidanti dei reniEET-F01.

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2. Risultati

2.1. EET-F01Mira al tessuto renale

Le strutture chimiche per EET-A e EET-FO1 sono fornite nella Figura 1. Purezza per EET-A eEET-F01 was >95 percento come determinato da NMR. Nello studio su animali acuti, dosi uguali in peso di EET-A eEET-F01sono stati somministrati per via endovenosa per 6 ore seguite da plasma e prelievo di tessuto renale. Abbiamo dimostrato un livello plasmatico 5-volte più alto diEET-F01rispetto a EET-A dopo 6-h somministrazione continua (Figura 1). È interessante notare che abbiamo anche dimostrato che dopo 6-h somministrazione continua il contenuto renale di EET-A era quasi irrilevabile rispetto aEET-F01contenuto nel rene (Figura 1). Questi dati lo dimostranoEET-F01prende di mira il rene.

Figura 1. Confronto tra plasma e rene EET-F01 e EET-A dopo somministrazione ev per 6 ore.Pannello superiore: strutture chimiche per EET-A eEET-F01. Pannello di sinistra: concentrazione plasmatica di EET-FO1 e EET-A. Pannello di destra: livelli renali diEET-F01e EET-A. Dati espressi come media±SEM, n=3/gruppo.

2.2. EET-F01Protegge dal cisplatinoNefrotossicità

In una serie separata di esperimenti, gruppi di ratti sono stati pretrattatiEET-F01e EET-A per due giorni prima dell'induzione della nefropatia da cisplatino e quindi ulteriormente trattati con i composti in esame per altri 5 giorni. Le azioni protettive dei reni diEET-F01e EET-A sono stati determinati dai livelli di BUN, dal contenuto urinario di NAG e dai livelli urinari di KIM-1.EET-F01era efficace quanto l'EET-A nel ridurre BUN, NAG, KIM-1 e danno istologico renale cinque giorni dopo l'induzione del cisplatinonefrotossicità(Figura 2). Successivamente, è stato condotto un esame istologico per valutare ulteriormente la nefrotossicità del cisplatino. La somministrazione di cisplatino ha provocato un danno tubulare manifestato da vacuolizzazione e desquamazione delle cellule epiteliali renali insieme a una grave formazione di gesso proteico intratubulare nelle regioni corticali e midollari del rene. EET-A eEET-F01il trattamento ha protetto il rene dal cisplatinonefrotossicitànei ratti (Figura 2).EET-F01era efficace a 20 mg/kg/die e a una dose 10- volte inferiore di 2 mg/kg/die nonostante il suo peso molecolare quasi 2 volte maggiore dovuto al folato rispetto a EET-A. Questi dati lo dimostrano chiaramenteEET-F01mira al rene e facilita una dose più bassa, ma comunque efficace. Pertanto, abbiamo sviluppato un analogo EET mirato ai reni,EET-F01, che dimostra un eccellente potenziale come terapeutico per le malattie renali.

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Figura 2. Il danno renale indotto dal cisplatino è ridotto dai trattamenti EET-F01 e EET-A.Pannello di sinistra: azoto ureico (BUN), Pannello centrale: N-acetil{1}}(D)-glucosaminidasi (NAG) urinario, Pannello di destra: molecola di danno renale-1 (KIM-1) in ratti trattati con cisplatino trattati con veicolo, EET-FO1 o EET-A. Pannello inferiore: microfotografie rappresentative della colorazione con acido periodico di Schiff (PAS) raffigurante la vacuolizzazione e la desquamazione delle cellule epiteliali renali insieme a una grave formazione di calchi tubolari proteici intratubulari nelle sezioni renali di diversi gruppi sperimentali.*p<0.05 vs.="" control-vehicle="" group;t=""><0.05 vs.="" cisplatin-vehicle="" group.data="" expressed="" as="" mean="" ±sem,="" n="">

2.3. EET-F01 e EET-A riducono l'infiammazione renale e lo stress ossidativo nel cisplatinoNefrotossicità

I livelli di espressione dell'mRNA di IL{0}} renale e TNFo hanno rivelato un aumento da 4 a 5- volte dell'indotto da cisplatinonefrotossicità. EET-F01e il trattamento con EET-A hanno ridotto i geni infiammatori renali IL-6 e TNF del 30-50 percento nel cisplatinonefrotossicità(Figura 3). Nei ratti trattati con cisplatino si osserva un'aumentata espressione renale dei geni marcatori ossidativi NADPH ossidasi subunità p47phox, p67phox, gp91phox e NOX4. I livelli di TBARS nel tessuto renale erano aumentati durante il trattamento indotto da cisplatinonefrotossicità. Questi aumenti indotti dal cisplatino dello stress ossidativo sono stati attenuati60-100 per cento diEET-F01e trattamento EET-A (Figure 4 e 5). Questi dati dimostrano che mirato ai reniEET-F01è efficace quanto l'EET-A nel ridurre l'infiammazione e lo stress ossidativo nel cisplatinonefrotossicità.

Figura 3. L'infiammazione renale nella nefrotossicità del cisplatino è ridotta dai trattamenti EET-F01 e EET-A.Analisi RT-PCR per le espressioni di mRNA di IL-6 (pannello di sinistra) e TNF (pannello di destra).*p<0.05 vs.="" control-vehicle="" group;=""><0.05 vs.="" cisplatin-vehicle="" group.="" data="" expressed="" as="" mean±sem,="" n="">

2.4. EET-A non migliora la crescita del tumore

L'uso di analoghi dell'EET potrebbe promuovere la metastasi del cancro se somministrato per lunghi periodi di tempo [14,15]. Sebbene l'attuale approccio terapeutico somministrerebbe analoghi dell'EET per un breve periodo di tempo per prevenire l'indotto da cisplatinonefrotossicità, abbiamo valutato gli effetti a lungo termine di EET-A sulla crescita tumorale di una linea cellulare di cancro al seno umano, MBA-MB-231, in topi atimici. Il volume e il peso del tumore sono aumentati alla stessa velocità nel veicolo o nei topi trattati con EET-A per un periodo di tre settimane (Figura 6). La valutazione istologica dei tumori non è riuscita a dimostrare alcun cambiamento nell'iperplasia o nella proliferazione cellulare nei topi trattati con EET-A. Questi dati dimostrano che l'EET-A non migliora la crescita del tumore.

Figura 4. Lo stress ossidativo renale nella nefrotossicità del cisplatino è ridotto dai trattamenti EET-F01 e EET-A.Analisi RT-PCR per le espressioni di mRNA di (a)p47phox, (b)p67phox, (c)gp91phox, (d) NOX4.*p<0.05 vs.control-vehicle=""><0.05 vs.="" cisplatin-vehicle="" group.="" data="" expressed="" as="" mean="" ±="" sem,="" n="">	Figura 5. Le sostanze reattive dell'acido tiobarbiturico renale (TBARS) nella nefrotossicità del cisplatino sono ridotte dai trattamenti EET-F01 e EET-A.*p<0.05 vs.control-vehicle=""><0.05 vs.="" cisplatin-vehicle="" group.="" data="" expressed="" as="" mean="" ±="" sem,="" n="">

Figura 6. La crescita del tumore di una linea cellulare di cancro al seno umano, MBA-MB-231, nei topi atimici non è alterata dal trattamento con EET-A.Pannello di sinistra: volume del tumore, Pannello di destra: peso del tumore nei topi portatori di tumore MBA-MB-231 trattati con veicolo (controllo) o EET-A. Pannello inferiore: microfotografie rappresentative della colorazione con acido periodico di Schiff (PAS) raffigurante iperplasia e proliferazione tumorale simili nei tumori al seno umani. Dati espressi come media ± SEM, n=5 topi e n=10 tumori/gruppo.

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