PARTE Ⅰ: Effetto degli estratti di Cistanche Tubulosa sulla funzione riproduttiva maschile nei ratti diabetici indotti da streptozotocina-nicotinamide
Mar 04, 2022
Contatto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Zwe-Ling Kong ® Athira Johnson® Fan-Chi Ko, Jia-Ling He e Shu-Chun Cheng
Astratto:Il diabete è una malattia cronica caratterizzata da iperglicemia dovuta alla diminuzione dei livelli di insulina o all'inefficienza dei tessuti nell'utilizzarla efficacemente. L'infertilità è nota come una delle principali conseguenze del diabete e colpisce il sistema riproduttivo maschile causando compromissione dello sperma e disfunzione gonadica.Cistanche tubuloseè una pianta parassitaria che ha la capacità di migliorare la memoria, l'immunità e le capacità sessuali, ridurre l'impotenza e ridurre al minimo la stitichezza. Questo studio si è concentrato sullo studio degli effetti antinfiammatori e protettivi dell'echinacoside (ECH) inEstratto di Cistanche tubulosa(CTE) sul sistema riproduttivo maschile di ratti diabetici. Gli effetti antiossidanti, antinfiammatori e protettivi della CTE sono stati valutati sia con metodi in vitro che in vivo. I risultati in vitro mostrano che l'ECH ha inibito la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e migliorato l'espressione della proteina StAR, CYP11A1, CYP17A1 e HSD17p3. L'analisi in vivo è stata effettuata con tre dosi di echinacoside (ECH) (80, 160 e 320 mg/kg) in CTE. In totale, sono stati somministrati 0,571 mg/kg di rosiglitazone (RSG) come controllo positivo. Il diabete è stato indotto da streptozotocina (STZ) (65 mg/kg) e nicotinamide (230 mg/kg) in combinazione con una dieta ricca di grassi (45%). Gli studi in vivo hanno confermato che l'ECH ha migliorato i livelli di zucchero nel sangue, la resistenza all'insulina, la resistenza alla leptina e la perossidazione lipidica. Può ripristinare la kisspeptina 1 (KiSS1), il recettore accoppiato a proteine G GPR 54, soppressore della segnalazione delle citochine 3 (SOCS-3) e l'espressione dell'acido ribonucleico messaggero (mRNA) della sirtuina 1 (SIRT1) nell'ipotalamo e recuperare il sesso livello ormonale. Pertanto, questo studio ha confermato gli effetti antiossidanti, antinfiammatori e steroidogenesi della CTE.
Parole chiave:diabete; infertilità;Estratto di Cistanche tubulosa (CTE); echinacoside (ECH); attività antinfiammatoria; attività antiossidante; effetti della steroidogenesi
Trattamento per il diabete:Estratto di Cistanche tubulosa(CTE)
1. Introduzione
Il diabete mellito (DM) è una condizione in cui i livelli di glucosio nel sangue sono aumentati a causa dell'inefficienza del pancreas nel produrre abbastanza insulina o dell'incapacità del corpo di usarla in modo efficace. Secondo l'OMS, il numero di persone con diabete è passato da 108 milioni nel 1980 a 422 milioni nel 2014 [1]. Esistono quattro categorie principali: pre-diabete (uno stadio precedente al diabete), tipo 1 (in cui il pancreas non produce insulina), tipo 2 (il corpo non utilizza l'insulina) e diabete gestazionale (che si verifica durante la gravidanza). Lo stress ossidativo si verifica a causa dello squilibrio tra la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e antiossidanti [2] che porta infine alla condizione diabetica. Le complicanze del diabete includono insufficienza renale, danni ai nervi, cecità, ictus, infarto, morte fetale e infertilità. [1]. Gli studi dimostrano che i nuclei degli spermatozoi, l'acido desossiribonucleico (DNA) e i mitocondri sono stati significativamente danneggiati nei pazienti diabetici di sesso maschile [3]. Lo stress ossidativo durante il trasporto dello sperma altererà il processo del sistema riproduttivo maschile [4,5].
Il processo di spermatogenesi è controllato dall'asse ipotalamo-ipofisi-gonadi (HPG). L'ormone di rilascio delle gonadotropine (GnRH) prodotto dall'ipotalamo stimola la produzione dell'ormone luteinizzante (LH) e dell'ormone follicolo-stimolante (FSH). Le cellule di Leydig si trovano adiacenti al tubulo seminifero e producono testosterone sotto il controllo di LH. L'FSH innesca la produzione della proteina legante l'antigene (ABP) che aiuta a far passare l'ormone maschile. Pertanto, l'infertilità e altri problemi sorgono principalmente a causa dei disturbi che si verificano nell'asse HPG. La somministrazione della combinazione di streptozotocina-nicotinamide induce il diabete nei ratti sperimentali. La streptozotocina è un composto chimico tossico per le cellule p produttrici di insulina nel pancreas e la nicotinamide è una vitamina idrosolubile che protegge le cellule p dal danno completo [6].
Cistanche tubulosa è una specie vegetale del deserto conosciuta anche come "Rou Cong-Rong" [7]. È una pianta parassitaria non clorofillica che cresce principalmente sulla radice dell'albero di Calotropis Procera ed è ampiamente distribuita nelle terre aride di Gansu, Qinghai, Xinjiang, Mongolia, Iran e India. Il nome comune di Cistanche tubulosa è "Desert Hyacinth". È ampiamente accettato nella medicina tradizionale cinese e gli è stato dato il nome di "Ginseng del deserto". È ampiamente usato in campo medicinale per trattare la leucorrea morbosa, la metrorragia profusa, le malattie renali croniche, la stitichezza, l'impotenza e l'infertilità. Componenti chimici diCistanche tubulosesono costituiti da glicosidi feniletanoidi non volatili (PHG), iridoidi, lignani, oli volatili, alditoli, oligosaccaridi e polisaccaridi [8]. Gli studi dimostrano che l'echinacoside di questa erba protegge il fibroblasto danneggiato regolando i livelli di ROS [9]. Questo composto produce attività antiossidante, vasorilassante e antinfiammatoria insieme a neuroprotezione e prevenzione dell'osteoporosi [10,11].
Questo studio aveva lo scopo di indagare ileffetto dell'estratto di Cistanche tubulosacontenente ECH sulla disfunzione riproduttiva del ratto diabetico indotto da streptozotocina-nicotinamide.
Cistanche tubulose
2. Materiali e metodi
2.1.Materiali
ECH e CTE sono stati acquistati da Sinopharm Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Taiwan). I prodotti finali di glicazione avanzata (AGE) sono stati acquistati da Biovision (San Francisco, CA, USA). Le linee cellulari LC-540 e TM3 sono state acquistate dal Food Industry Research and Development Institute (Hsinchu, Taiwan). Ratti maschi Sprague-Dawley (SD) di cinque settimane sono stati acquistati dal National Laboratory Animal Center (Taipei, Taiwan). Feed Lab Diet® è stato acquistato da PMI Nutrition International, Inc. (Taipei, Taiwan). 2,2-difenil{7}}picrylidrazyl (DPPH) è stato ottenuto da Sigma (St. Louis, MO, USA). Anche il metanolo e l'acido 4-(2-idrossietil){10}}piperazinetansolfonico (HEPES) sono stati acquistati da Sigma. Il medium Eagle/F12 modificato di Dulbecco e la tripsina-EDTA sono stati ottenuti da GIBCO (New York, NY, USA). 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-yl)-2, 5-difeniltetrazolio bromuro (MTT), dicloro-diidro-fluoresceina diacetato (DCFH-DA), dimetilsolfossido (DMSO) e nitroblue tetrazolio (NBT) sono stati acquistati da Sigma. I kit enzimatici di glucosio sono stati ottenuti da Kyokutoseiyaku, Tokyo, Giappone. I kit ELISA per insulina sono stati acquistati da Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (Uppsala, Svezia). T-PER Tissue Protein Extraction Reagent è stato acquistato da Thermo Scientific (Chicago, IL, USA). Anticorpi policlonali anti-umano/topo/ratto fattore nucleare-kappa B NF-kB sono stati acquistati da Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA. Gli anticorpi policlonali anti-topo/recettore di ratto per i prodotti finali della glicazione avanzata (RAGE), gli anticorpi policlonali anti-umano/topo/ratto StAR e gli anticorpi monoclonali anti-umano/topo/citocromo P{30}}A1 sono stati acquistati da Gene Tex (Irvine, California, USA). Gli anticorpi policlonali CYP11A1 anti-umano/topo/ratto sono stati ottenuti da Cell Signaling Technology (Beverly, PA, USA). Il reagente easy-Blue è stato acquistato da Invitrogen, Thermo Fisher Scientific (Carlsbad, CA, USA). L'agarosio e il marcatore del DNA 100 bp sono stati ottenuti da Promega, Corporation (Madison, WI, USA). RNeasy Lipid Tissue Mini Kit è stato acquistato da QIAGEN, Hilden, Germania.
2.2.Metodi
2.2.1. Analisi in vitro
Coltura cellulare LC{{0}} e TM3: le linee cellulari LC-540 sono state coltivate a 37 OC in mezzo di Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) integrato con bicarbonato di sodio (1,5 g/L), L -glutamina (2 mM), aminoacidi non essenziali (0.1 mM), piruvato di sodio (1.0 mM) e siero fetale bovino (FBS) (10 percento) in un 5 percentuale di incubatrice a CO2 (incubatrice a CO2, Napco 5410, Taiwan). La linea cellulare TM3 è stata coltivata in terreno Eagle modificato Dulbecco/s (DMEM) integrato con glucosio (4,5 g/L), piruvato di sodio (0,5 mM), L-glutammina (2,5 mM), bicarbonato di sodio (1,2 g/L), 4-(2-idrossietil){30}}acido piperazinetansolfonico (HEPES, 15 mM) e siero fetale di vitello (FCS, 10 percento) o siero di cavallo (5 percento) a 37 OC in un 5 percentuale di CO2 incubatore.
Determinazione della vitalità cellulare dell'echinacoside (ECH): il reagente 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazolio bromuro (MTT) è stato utilizzato per il test di vitalità cellulare. La concentrazione cellulare è stata regolata a 2 x 105 cellule/ml in una 96-piastra a pozzetti. Quindi, 20 µl di ECH (diluito nel 2% di mezzo) sono stati aggiunti e incubati per 24 ore a 37°C in un incubatore di CO2 al 5%. Successivamente, sono stati aggiunti 100 卩L di reagente MTT e incubati per 4hat37 OC in condizioni di oscurità. L'assorbanza è stata misurata a 570 nm (lettore ELISA, Dynatech MR5000, Kloten, Svizzera).
Restive CeH viabiHiy ( percento )=[(Campione a 570 nm — Vuoto a 570 nm)]/[(Acontrollo a 570 — Vuoto a 570)] x 100.
Saggio di riduzione del nitroblue tetrazolio (NBT) e 2,2-difenil-1-picrylidrazyl (DPPH): il numero di cellule è stato aggiustato a 1x 1{{10}}6 cellule/mL . Quindi, 50 mg/mL di ECH, resveratrolo (RES) e prodotti finali di glicazione avanzata (AGE) (controllo) sono stati aggiunti e co-coltivati per 18 ore a 37°C. Quindi, 0,3 mL di soluzione di NBT (0,1 mg/mL di NBT, 5 percento di FBS e 3 percento di dimetilsolfossido (DMSO) disciolti in 10 mL di DMEM) sono stati aggiunti e incubati a 37 OC in 5 percento di CO2 per 1 ora. Dopo centrifugazione (a 800 xg per 3 min) il supernatante è stato rimosso e sono stati aggiunti 200 µl di DMSO e agitati per 5 min in un oscillatore ad ultrasuoni (Delta Ultrasonic Cleaner D 200, Keelung, Taiwan). L'assorbanza è stata misurata a 630 nm. Per il test radicale DPPH, Trolox (in alcol al 95%) è stato preso come standard. Quindi, 75 µl di soluzione di DPPH 0,5 mM sono stati miscelati con 25 µl di campioni e lasciati reagire a temperatura ambiente in un luogo buio per 30 minuti. La miscela è stata agitata e l'assorbanza è stata misurata a 517 nm.
Analisi del contenuto di specie reattive dell'ossigeno (ROS): il numero di cellule è stato regolato a 2 x 105 cellule/mL in una piastra a pozzetti 12- contenente il 2% di FBS. Quindi, 50 µL/mL di ECH, RES e AGE sono stati aggiunti alla piastra e incubati a 37 OC per 24 ore. Dopo 24 ore, è stato aggiunto 2Z,7Z-diclorofluoresceina-diacetato (DCFH-DA) e incubato a 37°C per 30 minuti. Dopo centrifugazione (400 x g, 5 min), il supernatante è stato rimosso e le cellule lavate due volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Dopo che le cellule sono state sospese in 1 mL di PBS e i livelli di ROS sono stati determinati utilizzando un citometro a flusso (citometro a flusso, Becton Dickinson, CA, USA).
Identificazione e analisi quantitativa delle proteine: le proteine sono state estratte utilizzando il reagente di estrazione proteica (T-PER). La densità cellulare è stata regolata a 2 x 105 cellule/ml in una 12-piastra a pozzetti e 50 µl/ml di ECH, RES e un recettore per l'antagonista del prodotto finale della glicazione avanzata (RAGE), e sono stati aggiunti AGE e incubato a 37 OC in un incubatore al 5% di CO2 per 24 h. Dopo, sono stati aggiunti 400 µl di T-PER, raschiati via le cellule e centrifugati a 125,{12}}xg per 20 minuti (4 OC). Il supernatante è stato raccolto e conservato presso -80 OC (-80 congelatore OC, Nuaire, Plymouth, MN, USA) per ulteriori analisi. Il kit di acido bicinconinico (BCA) è stato utilizzato per la quantificazione delle proteine. Quindi, 10 µL di soluzione cellulare standard e 200 RL di reagente BCA sono stati aggiunti a 8-piastre a pozzetti e incubati a 37 O Cin in un incubatore a CO2 al 5% per 30 minuti. L'assorbanza è stata misurata a 562 nm. L'analisi dell'identificazione delle proteine è stata eseguita mediante elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato (SDS)-poliacrilammide (SDS-PAGE). I campioni sono stati preparati aggiungendo il lisato proteico al buffer di caricamento delle proteine ed è stata eseguita l'analisi western blot per rilevare le proteine specifiche.
2.2.2.Analisi in vivo
Progettazione di modelli animali: ratti maschi Sprague-Dawley (SD) di sessanta {0}} settimane sono stati acquistati dal National Laboratory Animal Center (Taipei, Taiwan). Ogni ratto è stato alloggiato individualmente in gabbie disinfettanti in acciaio inossidabile a temperatura controllata (23 土 1 grado) e umidità (40-60 percento) con un ciclo di luce di 12 ore/12 ore di buio. Cibo e acqua sono stati forniti ad libitum. Ogni ratto è stato addomesticato nella prima settimana e gli è stata somministrata la dieta 5001 per roditori di laboratorio come dieta principale. Tutte le procedure hanno seguito lo standard del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (approvazione IACUC n. 101026) della National Taiwan Ocean University, Taiwan. Dopo l'addomesticamento, i ratti sono stati divisi in due gruppi: il gruppo di controllo (Con) che è stato alimentato con la dieta di laboratorio 5001 e il gruppo diabetico che è stato alimentato con una dieta ricca di grassi (HFD, 40%) per l'intero esperimento. Dopo essere stati nutriti con HFD per 4 settimane, ai ratti del gruppo diabetico è stata iniettata streptozotocina (65 mg/kg) (STZ) per indurre il diabete mellito (DM). Entro 15 minuti dall'iniezione di STZ, è stata iniettata nicotinamide (230 mg/Kg di peso corporeo). Una settimana dopo l'iniezione, è stato condotto un test di tolleranza al glucosio orale (OGTT) per determinare il successo dell'induzione del diabete mellito (DM). Successivamente, gli animali sono stati divisi in sei gruppi: il controllo (alimentato con lab diet 5001); gruppo DM (DM più 45% HFD); gruppo DMR (DM più rosiglitazone: 0,571 mg/kg BW) più 45% HFD; gruppo DME1 (DM più CTE: 80 mg/kg di peso corporeo) più 45% HFD; gruppo DME2 (DM più CTE: 160 mg/kg di peso corporeo) più 45% HFD; e il gruppo DME4 (DM più CTE: 320 mg/kg di peso corporeo) più il 45% di HFD. Rosiglitazone (RSG) è stato preso come controllo positivo. Sono state utilizzate tre dosi di CTE (80, 160 e 320 mg/kg) secondo la raccomandazione delle linee guida per la valutazione funzionale degli alimenti salutari della Taiwan Food and Drug Administration (TFDA). I trattamenti sono stati somministrati fino alla fine dell'esperimento. Tutti i ratti sperimentali sono stati sacrificati dopo 6 settimane. Il sangue raccolto dai ratti è stato centrifugato a 3000 rpm per 15 minuti a 4 gradi.
Mian ingredienti efficaci di cistanche tubulosa
Il supernatante è stato esaminato per la seguente analisi
Determinazione del glucosio totale, dei trigliceridi e del colesterolo: La determinazione del glucosio è stata effettuata mediante kit enzimatici del glucosio. Quindi, 20 campioni di plasma sanguigno sono stati aggiunti ai reagenti e mantenuti a 37 gradi per 5 minuti. I trigliceridi totali e la concentrazione di colesterolo totale sono stati determinati utilizzando kit enzimatici di trigliceridi e colesterolo. Quindi, 10 ^L di plasma sanguigno sono stati aggiunti ai reagenti e l'esperimento è stato condotto secondo le istruzioni del produttore. L'assorbanza è stata misurata a 510 nm.
Glucosio plasmatico totale/trigliceridi/colesterolo (mg/dL)=(-ABlank)/(Astandard - ABlank) x 200.
Un campione: Assorbanza dei campioni di sangue, ABlank: Valore di assorbanza dei kit senza campione, A standard: Valore di assorbanza del reagente standard, 200: Reagenti standard a una concentrazione di 200 mg/dL.
Determinazione dell'insulina, della leptina e del modello omeostatico-insulino-resistenza (HOMA-IR): il livello di insulina è stato determinato mediante kit ELISA per insulina. Qui, 25 di plasma sanguigno sono stati aggiunti ai reagenti e l'assorbanza è stata misurata a 450 nm. Il contenuto totale di leptina è stato determinato utilizzando un kit di test immunometrico dell'enzima leptina. Quindi, sono stati analizzati 100 plasma e l'assorbanza è stata misurata a 450 nm utilizzando un lettore ELISA. L'intero esperimento è stato condotto secondo le istruzioni del produttore. Il valore HOMA-IR è stato determinato dall'equazione di valutazione del modello di omeostasi=Concentrazione di insulina plasmatica a digiuno (mU/mL) x concentrazioni di glucosio plasmatico a digiuno (mmol/L)/22,5.
Perossidazione lipidica plasmatica: qui, {0}},5 mL di plasma sanguigno sono stati miscelati con 1 mL di reagente (15%, p/v di acido tricloroacetico in 0,25 N di acidi cloridrici (HCl ) e 0,375 percento, p/v di acido tiobarbiturico in 0,25 N HCl) e posto a bagnomaria (bagno d'acqua, BUCHI461, Zurigo, Svizzera) a 100 gradi C per 15 min. Dopo il raffreddamento, è stato aggiunto 1 mL di n-butanolo, agitato vigorosamente e centrifugato a 1500 xg per 10 minuti. Il surnatante è stato raccolto e l'assorbanza è stata misurata a 532 nm [12].
Concentrazione di malondialdeide (MDA) (nM/mL)=[(Acampione a 532 nm - In bianco a 532 nm)/ (Astandard a 532 nm - In bianco a 532 nm)] x 5.
Determinazione dei livelli di testosterone plasmatico e ormone luteinizzante (LH): il kit ELISA per il testosterone è stato utilizzato per misurare il livello di testosterone nel plasma sanguigno. Il kit RIA è stato utilizzato per determinare la concentrazione di LH. Quindi, sono stati aggiunti 50 µL di plasma ei calcoli sono stati basati sulla concentrazione dell'ormone LH-RP-3 (standard). Gli ulteriori passaggi sono stati condotti secondo le istruzioni del produttore.
Determinazione del fattore di necrosi tumorale (TNF)-a e della concentrazione di interleuchina-6 (IL-6): l'anticorpo catturato è stato diluito 250 volte nel tampone di rivestimento, aggiunto a un {{4} }piastra a pozzetti (100 µl/pozzetto) e mantenuta a 4 gradi C per una notte. Il supernatante è stato aspirato e lavato cinque volte con tampone di lavaggio (1 volta PBS, 0,05 percento Tween 20). Dopo incubazione (1 h) con 200 ^g di diluente del test, le cellule sono state lavate 5 volte con tampone di lavaggio e 100 ^L di TNF-una soluzione standard o campioni di test sono stati aggiunti a ciascun pozzetto e incubati per 2 h. Dopo il lavaggio, sono stati aggiunti 100 RL di IL{18}} anticorpi rilevati e incubati a 1 temperatura ambiente. Il supernatante è stato aspirato e lavato 5 volte. Quindi, 480 RL di enzima avidina-perossidasi di rafano (HRP) sono stati aggiunti e incubati per 30 minuti a temperatura ambiente. Il supernatante è stato aspirato e lavato cinque volte con tampone di lavaggio. Quindi, sono stati aggiunti 100 RL di soluzione di substrato e incubati per 15 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, a ciascun pozzetto sono stati aggiunti 50 RL di soluzione di arresto (acido fosforico 1M) e l'assorbanza è stata misurata a 450 nm.
Il vantaggio di Cistanche Echinacoside: Anti-ossidazione
Analisi dei parametri dello sperma e del testicolo
Raccolta del campione di sperma: La raccolta del campione di sperma è stata eseguita secondo il metodo precedentemente riportato in [13]. Lo sperma è stato raccolto dal supernatante e utilizzato per ulteriori analisi.
Il numero di spermatozoi, motilità spermatica e sperma anormale: il numero di spermatozoi è stato calcolato utilizzando l'emocitometro e la soluzione di blu di trypan. Quindi, 100 RL di liquido spermatico sono stati miscelati con una soluzione di blu di trypan e il numero di spermatozoi, la motilità e gli spermatozoi anormali sono stati calcolati utilizzando un emocitometro e un microscopio [14].
Nitro blue Tetrazolio NBT Riduzione e perossidazione lipidica di sperma e testicolo: La perossidazione lipidica e la riduzione NBT sono state analizzate secondo la stessa procedura dell'analisi del plasma.
Determinazione dell'attività della superossido dismutasi (SOD) e della catalasi: l'attività della superossido dismutasi (SOD) è stata analizzata utilizzando il kit RANSEL. Qui, {{0}}.05 ml di omogenati testicolari sono stati aggiunti a 1,7 ml di soluzione di reazione (0,05 mM di xantina, 0,025 mM 2-({ {9}}iodofenile)- 3-(4-nitrofenolo)-5-feniltetrazolio cloruro (INT)). Dopo la miscelazione, sono stati aggiunti 0,25 ml di xantina ossidasi (80 U/L) e fatti reagire a temperatura ambiente per 30 s a temperatura ambiente. L'assorbanza è stata misurata a 505 nm. La concentrazione proteica dell'omogenato testicolare è stata determinata mediante il kit di dosaggio proteico Bio-Rad DC ed è stata calcolata la sua attività specifica (proteina U/mg). L'attività della catalasi (CAT) è stata determinata secondo un metodo precedentemente riportato [15].
Colorazione H&E (ematossilina ed eosina).
Il testicolo è stato immerso nel 10 percento di formalina per 24 ore e conservato a 4 gradi C. Tagliato i tessuti alla dimensione micro e attaccati al vetrino. Dopo la fissazione (95 percento di metanolo più 5 percento di acido acetico), i vetrini sono stati immersi in ematossilina per 3 minuti, lavati con acqua corrente per 5 minuti e quindi immersi con il 50 percento, il 70 percento e il 90 percento di alcol per un minuto. Successivamente, i vetrini sono stati colorati con eosina per 10 s e immersi in alcol al 100% per un minuto fino a quando non si sono sbiaditi. Infine, il vetrino è stato immerso in xilene per un minuto. Successivamente, il vetrino è stato asciugato all'aria e sigillato. La provetta colorata è stata posta in un microscopio a contrasto di fase invertito (microscopio a differenza di fase invertito, Olympus CK-2, Tokyo, Giappone) per osservare la morfologia.
Analisi dell'ipotalamo
Il topo KISS1, il recettore accoppiato alla proteina G (GPR) 54, il soppressore della segnalazione delle citochine 3 (SOCS-3) e le sequenze geniche della sirtuina 1(SIRT1) sono state identificate dal database genico dell'NCBI (National Center for Biotechnology Information) ed è stato progettato un primer specifico utilizzando Primer 5.0 PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, USA.). I primer utilizzati nell'esperimento sono elencati nella Tabella 1.
Estrazione di acido ribonucleico (RNA) dall'ipotalamo. L'estrazione dell'RNA dall'ipotalamo del cervello è stata effettuata utilizzando il RNeasy Lipid Tissue Mini Kit. Gli mRNA ottenuti sono stati misurati quantitativamente mediante trascrizione inversa (RT) e reazione a catena della polimerasi (PCR). Il DNA complementare ottenuto dall'analisi RT è stato conservato a -20 gradi per un uso successivo. Il DNA estratto è stato sottoposto all'analisi della reazione a catena della polimerasi (PCR) utilizzando la Taq polimerasi. Quindi, 5~10 ^L del prodotto della PCR sono stati prelevati e analizzati mediante elettroforesi su un colloide di agar all'1,5%. L'immagine è stata scattata in un sistema di imaging UVP BioDoc-It. È stato prelevato acido desossiribonucleico complementare (cDNA) a trascrizione inversa ed è stata eseguita la PCR utilizzando il kit IQ SYBR Green Supermix. Successivamente, è stato analizzato con il software del sistema ottico iQTM 5. Le proteine sono state estratte utilizzando un reagente di estrazione proteica (T-PER). Quindi, 20 mg di omogenato testicolare sono stati aggiunti a 400 ^L di T-PER e centrifugati (centrifuga ad alta velocità, Hettich CR-12, Tuttlingen, Germania) a 4 gradi (125,000 xg) per 20 min. Il metodo seguente era simile all'analisi in vitro di "identificazione e quantificazione delle proteine".
2.3.Analisi statistica
I risultati sperimentali sono stati espressi come deviazione standard media 土 (media 土 SD) e i dati sono stati analizzati utilizzando il software Statistical Product & Service Solutions (SPSS) 11.0, IBM, Armonk, New York, NY, USA. Le differenze tra i gruppi sono state analizzate mediante l'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA). Confronti multipli di diversi gruppi sono stati analizzati dal test di Duncan al valore di p < 0.05="" come="" livello="">
