PARTE Ⅱ: Effetto degli estratti di Cistanche Tubulosa sulla funzione riproduttiva maschile nei ratti diabetici indotti da streptozotocina-nicotinamide

Contatto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Zwe-Ling Kong ® Athira Johnson® Fan-Chi Ko, Jia-Ling He e Shu-Chun Cheng

Dipartimento di Scienze Alimentari, Università Nazionale dell'Oceano di Taiwan, Pei-Ning Road, Keelung 20224, Taiwan; athirajohnson07@gmail.com (AJ); makeadrea@hotmail.com (F.-CK); k46255@gmail.com (J.-LH); riceroll826@gmail.com (S.-CC)

* Corrispondenza: kongzl@mail.ntou.edu.tw; Tel.: più 886-2-2462-2192; Fax: più 886-2-2463-4203

Astratto:Il diabete è una malattia cronica caratterizzata da iperglicemia dovuta alla diminuzione dei livelli di insulina o all'inefficienza dei tessuti nell'utilizzarla efficacemente. L'infertilità è nota come una delle principali conseguenze del diabete e colpisce il sistema riproduttivo maschile causando compromissione dello sperma e disfunzione gonadica. La Cistanche tubulosa è una pianta parassitaria che ha la capacità di migliorare la memoria, l'immunità e le capacità sessuali, ridurre l'impotenza e ridurre al minimo la stitichezza. Questo studio si è concentrato sullo studio degli effetti antinfiammatori e protettivi dell'echinacoside (ECH) nell'estratto di Cistanche tubulosa (CTE) sul sistema riproduttivo maschile di ratti diabetici. Gli effetti antiossidanti, antinfiammatori e protettivi della CTE sono stati valutati sia con metodi in vitro che in vivo. I risultati in vitro mostrano che l'ECH ha inibito la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e migliorato l'espressione della proteina StAR, CYP11A1, CYP17A1 e HSD17p3. L'analisi in vivo è stata effettuata con tre dosi di echinacoside (ECH) (80, 160 e 320 mg/kg) in CTE. In totale, sono stati somministrati 0,571 mg/kg di rosiglitazone (RSG) come controllo positivo. Il diabete è stato indotto da streptozotocina (STZ) (65 mg/kg) e nicotinamide (230 mg/kg) in combinazione con una dieta ricca di grassi (45%). Gli studi in vivo hanno confermato che l'ECH ha migliorato i livelli di zucchero nel sangue, la resistenza all'insulina, la resistenza alla leptina e la perossidazione lipidica. Può ripristinare la kisspeptina 1 (KiSS1), il recettore accoppiato alla proteina G GPR 54, soppressore della segnalazione delle citochine 3 (SOCS-3) e l'espressione dell'acido ribonucleico messaggero (mRNA) della sirtuina 1 (SIRT1) nell'ipotalamo e recuperare il sesso livello ormonale. Pertanto, questo studio ha confermato gli effetti antiossidanti, antinfiammatori e steroidogenesi della CTE.

Parole chiave:diabete; infertilità; Estratto di Cistanche tubulosa (CTE); echinacoside (ECH); attività antinfiammatoria; attività antiossidante; effetti della steroidogenesi

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Effetti protettivi dell'echinacoside (ECH) daCistanche tubulose

3. Risultati

3.1.Analisi in vitro

3.1.1. Confronto delle attività antiossidanti di ECH, CTE e RES

L'elevato stress ossidativo a lungo termine e l'infiammazione cronica sono le principali cause di complicanze del diabete [16]. I CTE contengono vari glicosidi feniletanoidi come l'echinacoside (ECH) e l'acteoside, con potenziale attività antiossidante [17]. Il test di scavenging radicale DPPH è stato condotto per valutare l'attività antiossidante dell'ECH. Trolox e resveratrolo (3,5,4'-triidrossistilbene, RES) sono stati presi rispettivamente come controllo standard e positivo. Come mostrato nella Figura 1, l'ECH ha mostrato una migliore attività di scavenging dei radicali e l'attività era significativamente superiore a quella del controllo positivo (RES).

3.1.2 Vitalità cellulare di ECH su cellule LC-540 e TM3 Leydig

Il test MTT è stato eseguito per valutare la vitalità cellulare di diverse concentrazioni di ECH. Le cellule LC-540 e le cellule TM3 Leydig hanno mostrato oltre l'80% di vitalità dopo essere state trattate con ECH (Figura 2). Rispetto alle altre concentrazioni, una concentrazione di 100-|dM (diluizioni di 100 rM in FBS al 2%) di ECtf ha mostrato una migliore vitalità cellulare nelle cellule di Leydig ffM3. Il risultato ha indicato che l'aumento della concentrazione di ECH non contribuisce ad alcuna tossicità significativa per le cellule.

3.1.3.Effetto di ECH sulla produzione di superossido indotta dall'età mediante test NBT in LC-540 e TM3 Leyd ig Cells

Gli AGE causano danni ossidativi nel corpo a causa dell'ossidazione del glucosio e della formazione di radicali liberi come O2-, radicali idrossilici e gruppi carbonile [18]. Dopo essere state stimolate con 50 Rg/mL di AGE, le cellule LC-540 (Figura 3a) e TM3 (Figura 3b) sono state trattate con ECH e RES (5/M e 10 cucchiaini ciascuna). I risultati hanno mostrato che la produzione di anione superossido è stata aumentata nel gruppo di controllo (AGO stimolati), ma la produzione di anione superossido è stata ridotta dopo il trattamento con ECH e RES. Dalla figura 3, ii si è compreso che ECH e RES riducono il livello di produzione di superossido e proteggono le cellule dal danno ossidativo. Nel caso delle cellule LC-540, 10 ECH hanno mostrato un'attività quasi simile al gruppo normale. La produzione di superossido in entrambe le cellule è diminuita con un aumento della concentrazione sia di ECH che di RES.

3.1.4.Effetto di ECH sulla produzione di H2O2 in cellule di Leydig LC-540 stimolate dall'età

Il test DCFH-DA è stato eseguito per rilevare la presenza di specie ossidative. Dopo essere entrato nelle cellule, il colorante fluorescente DCFH-DA viene ossidato dall'H2O2 intracellulare e forma diclorofluoresceina (DCF). Come mostrato nella Figura 4, c'è stato un aumento significativo della produzione intracellulare di H2O2 nel gruppo AGE-stimolato (controllo), mentre l'aggiunta di 10 ECH e RES ha ridotto significativamente la produzione di H2O2 nelle cellule. La somministrazione di 10 ECH ha prodotto solo il 47,1% circa della produzione di H2O2, significativamente inferiore rispetto al gruppo di controllo.

3.1.5. Effetto dell'ECH sui livelli di espressione della proteina RAGE e NF-kB nelle cellule di Leydig LC-540 stimolate dall'età

L'analisi Western blot è stata eseguita per confermare la presenza di RAGE nelle cellule LC-540 di Leydig. L'effetto dell'ECH sui livelli di espressione proteica RAGE (Figura 5a) e NF-kB (Figura 5b) nelle cellule di Leydig stimolate da AGE è stato mostrato nella Figura 5. I risultati hanno mostrato che una concentrazione di 50/mL di AGE induceva RAGE e NF-kB più elevati l'espressione nelle cellule LC-540 di Leydig e 10 concentrazioni di ECH e RES ha ridotto significativamente l'espressione di RAGE e NF-kB. L'espressione di NF-kB era significativamente inferiore in RES ed ECH rispetto agli antagonisti RAGE. Quindi, i risultati hanno confermato che l'ECH ha ridotto il livello di infiammazione diminuendo il livello di RAGE e NF-kB.

3.1.6. Effetto dell'ECH sulla via di sintesi del testosterone nelle cellule di Leydig LC-540 stimolate dall'età.

Il processo di spermatogenesi e infertilità maschile dipende dalla presenza di testosterone. Come mostrato nella Figura 6, le espressioni delle proteine ​​StAR (Figura 6a), CYP11A1 (Figura 6b), CYP17A1 (Figura 6c) e HSD17p3 (Figura 6d) erano significativamente ridotte nelle cellule di Leydig LC-540 stimolate dall'età ( gruppo di controllo). Le espressioni delle proteine ​​StAR, CYP11A1, CYP17A1 e HSD17p3 erano significativamente aumentate quando venivano aggiunti l'antagonista RAGE, RES ed ECH. L'aumentata espressione delle proteine ​​​​StAR e CYP11A1 è stata osservata in entrambi i gruppi trattati con ECH e RES. Il livello di espressione del CYP17A1 era quasi simile nei gruppi RES ed ECH. Le espressioni della proteina HSD17&3 nelle cellule di Leydig trattate con ECH erano molto superiori a quelle delle cellule trattate con antagonisti RES e RAGE. L'aumento dell'espressione delle proteine ​​​​StAR, CYP11A1, CYP17A1 e HSD17p3 indicava la normale produzione di testosterone.

3.2.Analisi in vivo

3.2.1. Effetti della CTE sul peso corporeo e sull'assunzione di calorie

Dopo 6 settimane di sperimentazione, il gruppo diabetico (HFD-DM) ha mostrato un peso corporeo maggiore rispetto al gruppo di controllo. Il gruppo HFD-DME4 ha mostrato un peso corporeo inferiore rispetto ai gruppi HFD-DM e HFD-DMER (Figura 7a). L'apporto calorico del gruppo di controllo era significativamente inferiore rispetto agli altri gruppi. Non c'era alcuna differenza significativa tra l'apporto calorico degli altri cinque gruppi (Figura 7b).

3.2.2.Test di tolleranza al glucosio orale (OGTT) per determinare il successo) 1 Inductien of Diabetes

Il test di tolleranza al glucosio orale (OGTT) viene utilizzato come strumento promettente per rilevare il mellito diabetico. Un aumento del livello di glucosio nel sangue indica una condizione diabetica. Come mostrato nella Figura 8a, il livello di glucosio plasmatico era inferiore nei gruppi CTE rispetto al gruppo DM a 0, 30, 90 e 120 min. Inoltre, l'area sotto la curva (AUC) della concentrazione di glucosio plasmatico lo ha mostrato nei gruppi CTE e RSG.3.2.3 Contenuto totale di glucosio plasmatico, colesterolo e trigliceridi

Il livello di glucosio nel sangue a digiuno era più alto nel gruppo DM e più basso nel gruppo DME2 (eccetto il controllo) rispetto ad altri. Non c'era alcuna differenza significativa nel colesterolo totale tra i gruppi ad eccezione del gruppo DME4. Nel gruppo DME4, il livello di colesterolo era inferiore rispetto agli altri. Il livello di trigliceridi era più alto nel gruppo DM e più basso nel gruppo DME4 e il contenuto di trigliceridi era diminuito con l'aumento della concentrazione di CTE (Tabella 2). I risultati mostrano che il livello di glucosio plasmatico, colesterolo e trigliceridi era più alto nel gruppo DM e il livello era significativamente ridotto durante il trattamento con CTE.

3.2.4. Livelli di insulina plasmatica, livello di leptina plasmatica e valori di valutazione del modello di omeostasi-insulino-resistenza (HOMA-IR)

I livelli di insulina plasmatica, leptina e valori di HOMA-IR sono mostrati nella Tabella 3. Il gruppo DM aveva livelli plasmatici di insulina e leptina plasmatica più elevati rispetto al gruppo di controllo. Anche l'indice HOMA-IR era significativamente più alto nel gruppo DM. I valori plasmatici di insulina, leptina e HOMA-IR sono diminuiti con un aumento della concentrazione di CTE. La leptina plasmatica è stata significativamente ridotta nei gruppi CTE, ma il gruppo farmaco RSG (DMR) non ha mostrato alcuna differenza significativa rispetto al gruppo DM.

3.2.5. Effetto della CTE sui livelli plasmatici di LH e testosterone nei ratti diabetici

Come mostrato nella Tabella 4, le concentrazioni di testosterone nei ratti diabetici (DM) erano significativamente diminuite, mentre le concentrazioni di testosterone erano significativamente aumentate a varie dosi di CTE. Inoltre, i risultati hanno mostrato una leggera diminuzione del livello di LH nel gruppo DM rispetto a DMR, DME1, DME2 e DME4. La produzione di LH è stata maggiore nel gruppo DME4.

3.2.6.Effetto della CTE sui parametri spermatici dei ratti diabetici

I risultati sperimentali hanno mostrato che il gruppo DM aveva una significativa diminuzione del numero di spermatozoi e della motilità rispetto al gruppo di controllo, mentre il tasso di anomalie degli spermatozoi era significativamente aumentato nel gruppo DM. È interessante notare che il numero di spermatozoi, la motilità degli spermatozoi e il tasso di anomalie degli spermatozoi del gruppo DMR sono migliorati, ma la motilità degli spermatozoi non raggiunge un livello significativo rispetto al DME4. Il DME2 ha mostrato un numero di spermatozoi migliore di tutti loro e il tasso di motilità è stato significativamente aumentato nel gruppo DME4. Non c'era alcuna differenza significativa tra il numero di spermatozoi anormali tra i gruppi trattati con RSG e CTE (Tabella 5).

3.2.7.Effetto del CTE sul morfolo dei tubuli seminiferi nei ratti diabetici

La Figura 9 mostra la colorazione H&E della sezione del testicolo. La freccia nera indica la cella di Leydig e la freccia bianca indica la cella di Sertoli. Sia la cellula di Leydig che la cellula di Sertoli nel gruppo DM hanno mostrato una significativa atrofia e una cavità era visibile nel lume. La struttura delle cellule di Leydig e del Sertoli è stata ripristinata nei gruppi trattati con CTE e RSG. La thictasess del tubulo seminifero era maggiore nei gruppi CTE e RSG rispetto al gruppo DM.

3.2.8. Effetto della CTE sugli mRNA di KiSS1, GPR54, SOCS-3 e SIRT1 nell'ipotalamo di ratti diabetici

L'espressione di KiSS1 (Figura 10a), GPR54 (Figura 10b), SOCS-3 (Figura 10d) e SIRT1 (Figura 10c) è stata mostrata nella Figura 10. L'espressione dell'mRNA di KiSS1 e del recettore GPR54 nei ratti diabetici era significativamente inferiore rispetto al gruppo di controllo. Il livello di espressione dell'mRNA di KiSS1 e GPR 54 in DMR, DME1, DME2 e DME4 è stato significativamente aumentato. In particolare, l'espressione dell'mRNA GPR54 era significativamente aumentata in DME4 ed era quasi simile al gruppo di controllo.

Questo esperimento ha ulteriormente esplorato la quantità di mRNA di SOCS-3 e SIRT1 nell'ipotalamo dei ratti. L'espressione dell'mRNA di SOCS-3 nei ratti diabetici è stata aumentata in modo significativo indicando che l'impedenza della leptina era più grave. I gruppi DMR, DME1, DME2 e DME4 hanno mostrato miglioramenti significativi rispetto al gruppo diabetico. L'espressione dell'mRNA di SIRT1 nel gruppo DM è stata ridotta

3.2.9.Effetto della CTE sugli enzimi antiossidanti nel plasma e nel testicolo di ratti diabetici

La tabella 6 mostra che l'attività plasmatica della SOD, l'attività GPx e l'attività della catalasi dei ratti diabetici erano significativamente diminuite e le attività erano aumentate nei gruppi trattati con CTE e RSG. In aggiunta a questo, DM E4 ha mostrato miglioramenti significativi nell'attività GPx rispetto ad altri. I risultati hanno mostrato che le attività di SOD e catalasi nei ratti diabetici erano significativamente diminuite dopo sei settimane. L'attività SOD e catalasi del gruppo DMR non raggiunge un livello significativo. I gruppi trattati con CTE hanno mostrato miglioramenti significativi nella SOD e nell'attività della catalasi. L'aumento delle attività di catalasi e SOD nei gruppi CTE è stato osservato anche nel testicolo (Tabella 7). L'attività più alta di SOD e catalasi è stata osservata rispettivamente nel gruppo DME1 e nel gruppo DME2.

3.2.10.Effetti della CTE sullo stress ossidativo e sull'infiammazione nel plasma e nel testicolo di ratti diabetici

Nella figura è stata mostrata la produzione di ossido nitrico (NO) nel plasma (Figura 11a) e nel testicolo (Figura lib). La produzione di NO nel gruppo DM è stata significativamente aumentata sia nel testicolo che nel plasma rispetto al gruppo di controllo. Una graduale riduzione della produzione di NO è stata osservata nei gruppi DME1, DME2 e DME4 (nel plasma). Anche il gruppo DMR ha mostrato una significativa riduzione della produzione di NO. Nel caso del testicolo, è stata osservata una leggera riduzione della produzione di NO nei gruppi CTE, mentre il gruppo DMR non riduce significativamente la produzione di NO.

Come mostrato nelle Figure 12 e 13, il livello di TNF-a e IL-6 era significativamente aumentato nei ratti diabetici (sia nel plasma che nel testicolo), indicando che l'infiammazione è più grave. Nel plasma, il livello di TNF-a è simile nei gruppi trattati con CTE e RSG (Figura 12a). I gruppi CTE (soprattutto DME2) hanno ridotto significativamente il livello di TNF-a nel testicolo (Figura 12b). Il livello di IL-6 è stato significativamente ridotto nel plasma dei gruppi CTE e RSG (Figura 13a). Nel testicolo si è verificata una tendenza alla riduzione del livello di IL-6, ma questo non ha raggiunto un livello significativo (Figura 13b).

3.2.11.Effetti della CTE sullo stress ossidativo e sull'infiammazione negli spermatozoi di ratti diabetici indotti dalla dieta ricca di grassi

La Figura 14 mostra il contenuto di anioni superossido nello sperma di ratto. I risultati hanno mostrato che la produzione di anione superossido nello sperma dei ratti diabetici è aumentata in modo significativo e non è stato osservato alcun miglioramento significativo nel gruppo DMR. I gruppi DME1 e DME4 hanno mostrato una produzione significativamente ridotta di anione superossido.

3.2.12. Effetti della CTE sulla perossidazione lipidica negli spermatozoi di ratti diabetici indotta dalla dieta ricca di grassi

Gli studi hanno dimostrato che la perossidazione lipidica era aumentata sia nei pazienti con diabete di tipo 1 che di tipo 2 [19]. Il livello di malondialdeide (MDA) nel plasma, nello sperma e nel testicolo è stato mostrato nella Tabella 8. Il livello di MDA nel plasma, nel testicolo e nello sperma del gruppo DM era significativamente più alto e il trattamento con CTE e RSG ha ridotto la produzione di MDA. Una riduzione significativa è stata osservata nei gruppi DME4 e DMEI nel plasma. Questo studio ha scoperto che i ratti diabetici non solo aumentavano il grado di perossidazione lipidica nel plasma, ma aumentavano anche i testicoli e lo sperma.

Effetti dell'estratto di Cistanche tubulosa: Anti-stress ossidativo e infiammatorio

4. Discussione

Il diabete è una malattia cronica associata a un alto livello di zucchero nel sangue. Lo squilibrio tra i livelli di antiossidanti e ROS porterà alla condizione chiamata stress ossidativo. Il superossido, il radicale idrossile, il perossido di idrogeno, l'ossido nitrico e l'ossigeno singoletto sono alcuni degli esempi di ROS che contribuiranno alla condizione del diabete attraverso lo stress ossidativo [20]. La Cittanche tubulosa è una pianta del deserto che contiene componenti attivi come polisaccaridi, oligosaccaridi s, glicosidi feniletanoidi (echinacoside, verbascoside), acido palmitico, acido linoleico, iridoidi, alditoli e lignani. Questa pianta è in grado di produrre effetti antinfiammatori, neuroprotettivi, antibatterici, antivirali, antiossidanti, antitumorali e immunomodulatori [21]. Studi di letteratura mostrano che i glicosidi feniletanoidi di Cistanche tubulosa sono la ragione principale dell'attività antiossidante [22]. Il resveratrolo (RES) e il rosiglitazone (RSG) sono stati presi come controllo positivo rispettivamente per gli studi in vitro e in vivo. L'RSG è un potente sensibilizzante dell'insulina e ha un'affinità verso l'isoforma del recettore attivato dal proliferatore del perossisoma (PPARc). Controlla l'iperglicemia nei pazienti diabetici [23]. RES ha attività antiossidante naturale, agisce come vasodilatatore, regolando il metabolismo delle lipoproteine, inibendo l'aggregazione piastrinica e prevenendo il cancro [24,25]. La nostra indagine ha indicato che l'ECH mostra una migliore attività di scavenging radicale rispetto a CTE e RES (Figura 1). Resta inoltre inteso che l'ECH non causa alcuna tossicità significativa per le cellule LC-540 e TM3 Leydig (Figura 2).

Gli AGE sono stati usati per indurre condizioni di stress nelle cellule di Leydig. La produzione di AGE, l'infiammazione, lo stress ossidativo e il diabete sono interconnessi. La condizione iperglicemica del diabete favorisce il danno cellulare attraverso la produzione di AGE e stress ossidativo. Gli AGE inducono tossicità delle cellule p, che promuove ulteriormente il reclutamento delle cellule immunitarie e la morte cellulare. Un livello elevato di AGE promuove l'espressione di due tipi di recettori chiamati RAGE e AGER1 [26]. Il gocciolamento e il successivo trasferimento di un elettrone dalla catena respiratoria mitocondriale all'ossigeno molecolare durante lo stress ossidativo provoca la formazione di un anione superossido. I nostri risultati mostrano che la produzione di anione superossido indotto dagli AGE è stata aumentata nel gruppo di controllo e sono stati osservati ulteriori miglioramenti con entrambi i trattamenti ECH e RES. Secondo il nostro studio, si è capito che la produzione di superossido (Figura 3) e H2O2 (Figura 4) indotta dagli AGE era diminuita in presenza di ECH e RES.

NF-kB è noto come l'importante mediatore dell'infiammazione associata al diabete [27]. L'espressione di NF-kB porta alla disfunzione delle cellule p e alla morte cellulare. L'attivazione di NF-KB da parte dello stress ossidativo stimola la risposta pro-infiammatoria, la sovraregolazione dell'endotelina e l'apoptosi [28]. L'espressione di RAGE e NF-kB è stata aumentata nei gruppi stimolati dall'AGE e la successiva riduzione è stata osservata nelle cellule trattate con ECH e RES (Figura 5).

Il testosterone è uno steroide anabolizzante e un ormone sessuale maschile primario sintetizzato dal colesterolo. Il processo inizia con la scissione ossidativa della catena laterale del colesterolo da parte del gene della scissione della catena laterale del colesterolo (CYP11A). Questo gene è localizzato nella membrana mitocondriale e converte il colesterolo in pregnenolone. Successivamente, il gene CYP17A1 dal reticolo endoplasmatico rimuove due atomi di carbonio in più e produce più steroidi C19. In aggiunta a questo, il pregnenolone viene ossidato per formare androstenedione/progesterone dall'idrossisteroide deidrogenasi (3-p-HSD). Infine, il testosterone è prodotto dalla riduzione del gruppo cheto nella 17a posizione di carbonio dell'androstenedione da parte della 17-beta-idrossisteroide deidrogenasi (17-p-HSD). Le cellule di Leydig sono coinvolte nella maggiore produzione di testosterone. Il trasferimento del colesterolo nella membrana mitocondriale interna richiede l'azione della proteina regolatoria acuta steroidogenica (StAR). Gli studi attuali mostrano che l'espressione di StAR, CYP11A1, CYP17A1 e HSD17p3 è stata ridotta nelle cellule trattate con AGE (controllo) e che è stato mostrato un enorme aumento nelle cellule trattate con ECH e RES (Figura 6). Pertanto, i risultati mostrano che la produzione di testosterone è aumentata nei gruppi trattati con ECH e RES.

Durante una condizione diabetica, il trasporto di glucosio agli organi è limitato e, di conseguenza, i livelli di glucosio aumentano [29]. Quindi, la condizione iperglicemica è uno dei marcatori importanti per il rilevamento del diabete. I nostri studi mostrano che il livello di glucosio plasmatico era aumentato nei gruppi diabetici e l'AUC del gruppo DM era significativamente più alta rispetto agli altri gruppi (Figura 8). Insieme al glucosio plasmatico, il contenuto di colesterolo totale e trigliceridi era significativamente aumentato nel gruppo DM (Tabella 2). L'aterosclerosi è facilitata da un aumento del livello di colesterolo e trigliceridi [30]. Tuttavia, il livello di colesterolo e trigliceridi era diminuito nei gruppi trattati con CTE e RSG. Il contenuto di trigliceridi del gruppo DME4 ha raggiunto un valore quasi simile al gruppo di controllo.

L'insulina è un ormone prodotto dalle cellule p del pancreas e funzionalizzato per controllare il livello di zucchero nel sangue nel corpo mentre la leptina è un ormone prodotto dagli adipociti ed è in grado di regolare l'assunzione di cibo e l'utilizzo dell'energia. Gli studi hanno indicato che la leptina è coinvolta nella fisiopatologia dell'obesità e c'è un'interazione positiva tra leptina e insulina [31]. I nostri studi mostrano che il livello di inulina e leptina plasmatica era più alto nel gruppo DM e il livello di insulina era diminuito con un aumento della concentrazione di CTE. Il gruppo RSG non mostra alcuna differenza significativa rispetto al gruppo DM. La resistenza all'insulina e la funzione delle cellule p sono state valutate da

Metodo HOMA-IR. Il valore HOMA-IR è aumentato nel gruppo DM ed era significativamente diverso dagli altri gruppi (Tabella 3).

Il DM influenza la funzione riproduttiva attraverso l'alternanza ormonale nell'asse HPG e gli studi hanno rivelato che l'espressione di insulina nel testicolo è influenzata anche dal diabete. È caratterizzato da vacuolizzazione delle cellule di Sertoli, aumento della frammentazione del DNA, alterata spermatogenesi e aumento dell'esaurimento delle cellule germinali. Lo stress ossidativo contribuisce anche ad anomalie nella funzione riproduttiva [32]. Il processo di formazione dello sperma nell'organo riproduttivo maschile (testicoli) è chiamato spermatogenesi. Il testicolo è composto da tubuli strettamente a spirale chiamati tubuli seminiferi. Le cellule di Sertoli sono visibili nelle pareti del tubulo seminifero e forniscono nutrimento allo sperma immaturo. L'indagine sui parametri spermatici ha indicato che il numero di spermatozoi e la motilità sono diminuiti e le anomalie sono aumentate nel gruppo DM (Tabella 5). Un effetto opposto è stato osservato nei gruppi trattati con CTE e RSG. Sia la cellula di Leydig che le cellule di Sertoli nel gruppo DM hanno mostrato una significativa atrofia e la cavità è stata osservata nel lume. Anche lo spessore del tubulo seminifero è diminuito nel gruppo DM. Un risultato migliore è stato osservato nei gruppi trattati con CTE e RSG (Figura 9). In aggiunta a questo, il livello di LH e testosterone è diminuito nel gruppo DM e i livelli sono aumentati nei gruppi trattati con CTE (Tabella 4). Negli uomini, un basso livello di testosterone sierico e una frequenza del polso di LH inferiore erano spesso associati all'obesità e al diabete mellito di tipo 2 [33].

Le kisspeptine codificate dal gene KiSS1 sono conosciute come il potente stimolatore dell'asse HPG e qualsiasi mutazione nel gene della kisspeptina porterà a bassi livelli di steroidi sessuali e gonadotropina. Gli studi mostrano che nei ratti diabetici indotti da STZ, i livelli di mRNA di Kiss1 erano diminuiti [33]. L'inizio e il mantenimento dell'infertilità dei mammiferi sono collegati al recettore 54 accoppiato alla proteina G (GPR54). La mutazione in GPR 54 è caratterizzata dall'assenza di maturazione sessuale e da bassi livelli di ormoni gonadotropici (LH e FSH). Le citochine pro-infiammatorie come IL-6 e TNF-a regolano l'espressione del soppressore della segnalazione delle citochine 3 (SOCS3) implicato nella resistenza all'insulina mediata dall'infiammazione nel fegato e negli adipociti [34]. SIRT 1 è un gene associato alla regolazione di diverse malattie dell'invecchiamento. Questo gene è espresso in modo prominente nelle cellule p del pancreas e regola la secrezione di insulina e previene l'apoptosi. Gli studi attuali hanno indicato che l'espressione di KiSS1, GPR54 e SIRT1 è diminuita nel gruppo DM, ma l'espressione è aumentata nei gruppi trattati con CTE (Figura 10). Un aumento delle espressioni SOCS-3 nel gruppo DM indicava la condizione infiammatoria. Il primo legame molecolare identificato tra obesità e infiammazione è stato il TNF-a. Quindi, un aumento del livello di TNF-a è un indicatore di infiammazione. Il livello ridotto di citochine pro-infiammatorie come TNF-a e IL-6 è stato osservato nei gruppi trattati con CTE (Figure 12 e 13).

Lo squilibrio tra ROS e antiossidanti porta alla condizione diabetica. La superossido dismutasi (SOD), la catalasi (CAT) e la glutatione perossidasi (GPX) sono noti come i principali antiossidanti responsabili del mantenimento del livello ottimale di ROS [35]. Dai risultati, è stato riscontrato che l'attività degli antiossidanti era significativamente più bassa nel gruppo DM. I gruppi trattati con CT hanno mostrato miglioramenti nella produzione di antiossidanti. Il gruppo trattato con RSG non ha mostrato miglioramenti significativi nell'attività antiossidante (Tabelle 6 e 7).

L'ossido nitrico (NO) è noto come un importante ROS che contribuisce all'infiammazione. I nostri studi sottolineano che il livello di NO era diminuito nei gruppi trattati con CTE (Figura 11). I risultati hanno mostrato che il contenuto di anioni superossido nello sperma dei ratti diabetici è aumentato in modo significativo e non vi è stato alcun miglioramento significativo dopo la somministrazione di RSG. La produzione di superossido è stata ridotta nei gruppi CTE.

La determinazione della MDA è molto utile per valutare la perossidazione lipidica. La perossidazione lipidica è il processo di ossidazione dei lipidi e, infine, provoca un danno cellulare. L'MDA è prodotto come risultato della perossidazione lipidica degli acidi grassi polinsaturi. Gli studi dimostrano che il livello di MDA è correlato con l'età e il livello di glucosio nel sangue a digiuno [36]. L'attuale studio ha indicato che il CTE migliora la perossidazione lipidica nel plasma, nei testicoli e nello sperma (Tabella 8).

Estratto di Cistanche tubulosa

5. Conclusioni

Lo stress ossidativo durante le condizioni diabetiche disturba il sistema riproduttivo maschile a causa della compromissione dello sperma e della disfunzione gonadica. La Cistanche tubulosa è una pianta del deserto ampiamente accettata dalla medicina cinese per i suoi effetti farmacologici. L'echinacoside (ECH) è il principale costituente della CTE responsabile delle attività antiossidanti e antinfiammatorie. I nostri risultati in vitro hanno indicato che l'ECH ha ripristinato la via di sintesi del testosterone e ha abbassato il livello di espressione della proteina NF-kB e RAGE. L'ECH ha inibito efficacemente la produzione di anione superossido e H2O2 nelle cellule di Leydig. Gli studi in vivo hanno rivelato che l'ECH ha ridotto i livelli di colesterolo, trigliceridi, TNF-a e IL-6. In aggiunta a questo, le espressioni di mRNA nell'ipotalamo dei ratti diabetici sono state significativamente migliorate. È anche da notare che l'ECH ha ridotto la perossidazione lipidica e ha migliorato la resistenza all'insulina nei ratti maschi diabetici. Le attività antiossidanti sono aumentate sia nel plasma che nel testicolo. Pertanto, i nostri studi hanno suggerito che l'ECH ha fornito una protezione efficace contro la disfunzione riproduttiva nei ratti maschi diabetici indotti da STZ.

Contributi dell'autore:F.-CK ha eseguito indagini, analisi formali e analisi del software. AJ e J.-LH hanno partecipato alla cura dei dati e hanno redatto il manoscritto. Z.-LK e AJ hanno ideato la revisione del manoscritto e l'hanno modificata. Z.-LK ha formulato la metodologia e ha supervisionato l'intero esperimento. S.-CC ha partecipato all'analisi formale, all'indagine e alla convalida. Tutti gli autori hanno contribuito all'analisi dei dati, alla stesura e alla revisione critica del documento, hanno dato l'approvazione finale della versione da pubblicare e si impegnano a essere responsabili di tutti gli aspetti del lavoro.

Finanziamento:Questo lavoro è stato finanziato dal Center of Excellence for the Oceans, National Taiwan Ocean University, dal programma Featured Areas Research Center nell'ambito del progetto Higher Education Sprout del Ministero dell'Istruzione (MOE), Taiwan.

Conflitto di interessi:Gli autori non hanno dichiarato alcun conflitto di interessi.

Riferimenti

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Integratori di Cistanche tubulosa