Effetto degli estratti di Cistanche Tubulosa sulla funzione riproduttiva maschile nei ratti diabetici indotti da streptozotocina-nicotinamide-Ⅱ

3.2. Analisi in vivo

3.2.1. Effetti del CTE sul peso corporeo e sull'apporto calorico

Dopo 6 settimane di sperimentazione, il gruppo diabetico (HFD-DM) ha mostrato un peso corporeo più elevato rispetto al gruppo di controllo. Il gruppo HFD-DME4 ha mostrato un peso corporeo inferiore rispetto ai gruppi HFD-DM e HFD-DMER (Figura 7a). L’apporto calorico del gruppo di controllo era significativamente inferiore rispetto agli altri gruppi. Non c'era alcuna differenza significativa tra l'apporto calorico degli altri cinque gruppi (Figura 7b).

3.2.2. Test di tolleranza al glucosio orale (OGTT) per determinare la riuscita induzione del diabete

Il test di tolleranza al glucosio orale (OGTT) è utilizzato come uno strumento promettente per rilevare il diabete mellito. Livelli aumentati di glucosio nel sangue indicano la condizione diabetica. Come mostrato nella Figura 8a, il livello di glucosio plasmatico era inferiore nei gruppi CTE rispetto al gruppo DM a 0, 30, 90 e 120 minuti. Inoltre, l'area sotto la curva (AUC) della concentrazione di glucosio nel plasma ha mostrato che nei gruppi CTE e RSG il tasso di assorbimento del glucosio nel sangue era aumentato (Figura 8b).

3.2.3. Contenuto totale di glucosio, colesterolo e trigliceridi nel plasma

Il livello di glucosio nel sangue a digiuno era più alto nel gruppo DM e più basso nel gruppo DME2 (eccetto il controllo) rispetto agli altri. Non è stata riscontrata alcuna differenza significativa nel colesterolo totale tra i gruppi, ad eccezione del gruppo DME4. Nel gruppo DME4, il livello di colesterolo era inferiore rispetto agli altri. Il livello di trigliceridi era più alto nel gruppo DM e più basso nel gruppo DME4 e il contenuto di trigliceridi diminuiva con un aumento della concentrazione di CTE (Tabella 2). I risultati mostrano che il livello di glucosio plasmatico, colesterolo e trigliceridi era più alto nel gruppo DM e il livello era significativamente diminuito durante il trattamento con CTE.

3.2.4. Livelli plasmatici di insulina, livelli plasmatici di leptina e valori di valutazione del modello di omeostasi – resistenza all’insulina (HOMA-IR)

I livelli plasmatici di insulina, leptina e valori HOMA-IR sono mostrati nella Tabella 3. Il gruppo DM aveva livelli plasmatici di insulina e leptina plasmatica più elevati rispetto al gruppo di controllo. Anche l'indice HOMA-IR era significativamente più alto nel gruppo DM. I valori plasmatici di insulina, leptina e HOMA-IR diminuivano con un aumento della concentrazione di CTE. La leptina plasmatica era significativamente ridotta nei gruppi CTE, ma il gruppo del farmaco RSG (DMR) non ha mostrato alcuna differenza significativa rispetto al gruppo DM.

3.2.5. Effetto della CTE sui livelli plasmatici di LH e testosterone nei ratti diabetici

Come mostrato nella Tabella 4, le concentrazioni di testosterone nei ratti diabetici (DM) erano significativamente diminuitele concentrazioni di testosterone erano significativamente aumentatea varie dosi di CTE. Inoltre, i risultati hanno mostrato una leggera diminuzione del livello di LH nel gruppo DM rispetto a DMR, DME1, DME2 e DME4. La produzione di LH era maggiore nel gruppo DME4.

3.2.6. Effetto della CTE sui parametri dello sperma dei ratti diabetici

I risultati sperimentali hanno mostrato che il gruppo DM aveva una significativa diminuzione del numero e della motilità degli spermatozoi rispetto al gruppo di controllo, mentre il tasso di anomalie spermatiche era significativamente aumentato nel gruppo DM. È interessante notare che il numero di spermatozoi, la motilità degli spermatozoi e il tasso di anomalie spermatiche del gruppo DMR sono migliorati, ma la motilità degli spermatozoi non raggiunge un livello significativo rispetto al gruppo DME4. DME2 ha mostrato una conta spermatica migliore rispetto a tutti gli altri e il tasso di motilità era significativamente aumentato nel gruppo DME4. Non è stata riscontrata alcuna differenza significativa tra il numero di spermatozoi anomali tra i gruppi trattati con RSG e CTE (Tabella 5).

3.2.7. Effetto della CTE sulla morfologia dei tubuli seminiferi nei ratti diabetici

La Figura 9 mostra la colorazione H&E della sezione del testicolo. La freccia nera indica la cella di Leydig e la freccia bianca indica la cella di Sertoli. Sia la cellula di Leydig che la cellula di Sertoli nel gruppo DM hanno mostrato una significativa atrofia ed è stata osservata una cavità nel lume. La struttura delle cellule di Leydig e del Sertoli è stata ripristinata nei gruppi trattati con CTE e RSG. Lo spessore del tubulo seminifero era maggiore nei gruppi CTE e RSG rispetto al gruppo DM.

3.2.8. Effetto della CTE sugli mRNA KiSS1, GPR54, SOCS-3 e SIRT1 nell'ipotalamo dei ratti diabetici

L'espressione di KiSS1 (Figura 10a), GPR54 (Figura 10b), SOCS-3 (Figura 10d) e SIRT1 (Figura 10c) è stata mostrata nella Figura 10. L'espressione dell'mRNA di KiSS1 e del recettore GPR54 nei ratti diabetici era significativamente inferiore rispetto al gruppo di controllo. I livelli di espressione dell'mRNA di KiSS1 e GPR 54 in DMR, DME1, DME2 e DME4 erano significativamente aumentati. In particolare, l'espressione dell'mRNA di GPR54 era significativamente aumentata nel DME4 ed era quasi simile al gruppo di controllo.

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Questo esperimento ha esplorato ulteriormente la quantità di mRNA SOCS-3 e SIRT1 nell'ipotalamo dei ratti. L'espressione dell'mRNA SOCS-3 nei ratti diabetici era aumentata in modo significativo, indicando che l'impedenza della leptina era più grave. I gruppi DMR, DME1, DME2 e DME4 hanno mostrato miglioramenti significativi rispetto al gruppo diabetico. L'espressione dell'mRNA di SIRT1 nel gruppo DM era diminuita significativamente ed era significativamente aumentata nei gruppi DME1 e DME4.

3.2.9. Effetto del CTE sugli enzimi antiossidanti nel plasma e nei testicoli dei ratti diabetici

La tabella 6 mostra che l'attività plasmatica della SOD, l'attività della GPx e l'attività della catalasi dei ratti diabetici erano diminuite in modo significativo e le attività erano aumentate nei gruppi trattati con CTE e RSG. Oltre a ciò, DME4 ha mostrato miglioramenti significativi nell’attività GPx rispetto ad altri. I risultati hanno mostrato che le attività SOD e catalasi nei ratti diabetici erano significativamente diminuite dopo sei settimane. L'attività SOD e catalasi del gruppo DMR non raggiunge un livello significativo. I gruppi trattati con CTE hanno mostrato miglioramenti significativi nell'attività SOD e catalasi. L'aumento delle attività della catalasi e della SOD nei gruppi CTE è stato osservato anche nei testicoli (Tabella 7). L'attività più elevata di SOD e catalasi è stata osservata rispettivamente nel gruppo DME1 e nei gruppi DME2.

3.2.10. Effetti della CTE sullo stress ossidativo e sull'infiammazione nel plasma e nei testicoli dei ratti diabetici

La produzione di ossido nitrico (NO) nel plasma (Figura 11a) e nei testicoli (Figura 11b) è stata mostrata nella Figura 11. La produzione di NO nel gruppo DM era significativamente aumentata sia nei testicoli che nel plasma rispetto al gruppo di controllo. Una riduzione graduale della produzione di NO è stata osservata nei gruppi DME1, DME2 e DME4 (nel plasma). Anche il gruppo DMR ha mostrato una significativa riduzione della produzione di NO. Nel caso del testicolo, è stata osservata una leggera riduzione della produzione di NO nei gruppi CTE, mentre il gruppo DMR non ha ridotto significativamente la produzione di NO.

Come mostrato nelle Figure 12 e 13, i livelli di TNF e IL-6 erano significativamente aumentati nei ratti diabetici (sia nel plasma che nei testicoli), indicando che l'infiammazione è più grave. Nel plasma, il livello di TNF è simile nei gruppi trattati con CTE e RSG (Figura 12a). I gruppi CTE (in particolare DME2) hanno ridotto significativamente il livello di TNF- nel testicolo (Figura 12b). Il livello di IL-6 era significativamente ridotto nel plasma dei gruppi CTE e RSG (Figura 13a). Nel testicolo si è osservata una tendenza alla riduzione del livello di IL-6, ma questo non ha raggiunto un livello significativo (Figura 13b).

3.2.1.1. Effetti della CTE sullo stress ossidativo e sull'infiammazione negli spermatozoi di ratti diabetici indotti da una dieta ricca di grassi

La Figura 14 mostra il contenuto di anione superossido nello sperma di ratto. I risultati hanno mostrato che la produzione di anione superossido nello sperma dei ratti diabetici è aumentata in modo significativo e non è stato osservato alcun miglioramento significativo nel gruppo DMR. I gruppi DME1 e DME4 hanno mostrato una produzione significativamente ridotta di anione superossido.

3.2.12. Effetti della CTE sulla perossidazione lipidica negli spermatozoi di ratti diabetici indotti da una dieta ricca di grassi

Gli studi hanno dimostrato che la perossidazione lipidica era aumentata sia nei pazienti con diabete di tipo 1 che di tipo 2 [19]. Il livello di malondialdeide (MDA) nel plasma, nello sperma e nei testicoli è mostrato nella Tabella 8. Il livello di MDA nel plasma, nei testicoli e nello sperma del gruppo DM era significativamente più alto e il trattamento con CTE e RSG riduceva la produzione di MDA. È stata osservata una riduzione significativa nei gruppi DME4 e DMEI nel plasma. Questo studio ha scoperto che i ratti diabetici non solo aumentavano il grado di perossidazione lipidica nel plasma, ma aumentavano anche i testicoli e gli spermatozoi. Un miglioramento significativo è stato osservato a varie dosi di CTE.

4. Discussione

Il diabete è una malattia cronica associata ad un elevato livello di zucchero nel sangue. Lo squilibrio tra i livelli di antiossidanti e ROS porterà alla condizione chiamata stress ossidativo. Superossido, radicale idrossile, perossido di idrogeno, ossido nitrico e ossigeno singoletto sono alcuni degli esempi di ROS che contribuiranno alle condizioni di diabete attraverso lo stress ossidativo [20].Cistanche tubuloseè una pianta del deserto che contiene componenti attivi comepolisaccaridi, oligosaccaridi, glicosidi feniletanoidi (echinacoside, verbascoside), acido palmitico, acido linoleico, iridoidi, alditoli e lignani. Questa pianta è in grado di produrre effetti antinfiammatori, neuroprotettivi, antibatterici, antivirali, antiossidanti, antitumorali e immunomodulatori [21]. Gli studi della letteratura mostrano che i glicosidi feniletanoidi della Cistanche tubulosa sono la ragione principale dell’attività antiossidante [22]. Il resveratrolo (RES) e il rosiglitazone (RSG) sono stati presi come controllo positivo rispettivamente per gli studi in vitro e in vivo. L'RSG è un potente sensibilizzatore dell'insulina e ha un'affinità con l'isoforma del recettore attivato dal proliferatore del perossisoma (PPARc). Controlla l'iperglicemia nei pazienti diabetici [23]. RES ha attività antiossidante naturale e agisce come vasodilatatore, regolando il metabolismo delle lipoproteine, inibendo l’aggregazione piastrinica e prevenendo il cancro [24,25]. La nostra indagine ha indicato che l'ECH mostra una migliore attività di eliminazione dei radicali rispetto a CTE e RES (Figura 1). Resta inoltre inteso che l'ECH non provoca alcuna tossicità significativa alle cellule di Leydig LC-540 e TM3 (Figura 2).

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Gli AGE sono stati utilizzati per indurre condizioni di stress nelle cellule di Leydig. La produzione di AGE, l’infiammazione, lo stress ossidativo e il diabete sono interconnessi. La condizione iperglicemica del diabete promuove il danno cellulare attraverso la produzione di AGE e lo stress ossidativo. Gli AGE inducono tossicità cellulare, che promuove ulteriormente il reclutamento delle cellule immunitarie e la morte cellulare. Un livello elevato di AGE promuove l’espressione di due tipi di recettori chiamati RAGE e AGER1 [26]. Il gocciolamento e il successivo trasferimento di un elettrone dalla catena respiratoria mitocondriale all'ossigeno molecolare durante lo stress ossidativo determina la formazione di un anione superossido. I nostri risultati mostrano che la produzione di anione superossido indotta dagli AGE è aumentata nel gruppo di controllo e sono stati osservati ulteriori miglioramenti sia con i trattamenti ECH che con RES. Secondo il nostro studio, si è capito che la produzione di superossido (Figura 3) e H2O2 (Figura 4) indotta dagli AGE era diminuita in presenza di ECH e RES.

NF-κB è noto come l’importante mediatore dell’infiammazione associata al diabete [27]. L'espressione di NF-κB porta alla disfunzione cellulare e alla morte cellulare. L’attivazione di NF-κB da parte dello stress ossidativo stimola la risposta proinfiammatoria, la sovraregolazione dell’endotelina e l’apoptosi [28]. L'espressione di RAGE e NF-κB è stata aumentata nei gruppi stimolati con AGE e la successiva riduzione è stata osservata nelle cellule trattate con ECH e RES (Figura 5).

Testosteroneè uno steroide anabolizzante e primarioormone sessuale maschilesintetizzato dal colesterolo. Il processo inizia con la scissione ossidativa della catena laterale del colesterolo da parte del gene di scissione della catena laterale del colesterolo (CYP11A). Questo gene è localizzato nella membrana mitocondriale e converte il colesterolo in pregnenolone. Successivamente, il gene CYP17A1 del reticolo endoplasmatico rimuove due atomi di carbonio in più e produce più steroidi C19. In aggiunta a ciò, il pregnenolone viene ossidato per formare androstenedione/progesterone dall'idrossisteroide deidrogenasi (3- -HSD). Infine, il testosterone è prodotto dalla riduzione del gruppo cheto nella 17a posizione del carbonio dell'androstenedione da parte della 17-beta-idrossisteroide deidrogenasi (17- -HSD). Le cellule di Leydig sono coinvolte nella maggiore produzione di testosterone. Il trasferimento del colesterolo nella membrana mitocondriale interna richiede l'azione della proteina regolatrice acuta steroidogenica (StAR). Gli studi attuali mostrano che l'espressione di StAR, CYP11A1, CYP17A1 e HSD17 3 era diminuita nelle cellule trattate con AGE (controllo) e si è verificato un enorme aumento nelle cellule trattate con ECH e RES (Figura 6) . Pertanto, i risultati mostrano che la produzione diil testosterone era aumentato nei gruppi trattati con ECH e RES. 

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Durante una condizione diabetica, il trasporto del glucosio agli organi è limitato e, di conseguenza, i livelli di glucosio aumentano [29]. Pertanto, la condizione iperglicemica è uno dei marcatori importanti per il rilevamento del diabete. I nostri studi mostrano che il livello di glucosio plasmatico era aumentato nei gruppi diabetici e l’AUC del gruppo DM era significativamente più alta rispetto agli altri gruppi (Figura 8). Insieme al glucosio plasmatico, il contenuto di colesterolo totale e trigliceridi era significativamente aumentato nel gruppo DM (Tabella 2). L’aterosclerosi è facilitata da un aumento del livello di colesterolo e trigliceridi [30]. Tuttavia, il livello di colesterolo e trigliceridi era diminuito nei gruppi trattati con CTE e RSG. Il contenuto di trigliceridi del gruppo DME4 ha raggiunto valori quasi simili a quelli del gruppo di controllo.

L'insulina è un ormone prodotto dalle cellule del pancreas e funzionalizzato per controllare i livelli di zucchero nel sangue nell'organismo mentre la leptina è un ormone prodotto dagli adipociti in grado di regolare l'assunzione di cibo e l'utilizzo di energia. Gli studi hanno indicato che la leptina è coinvolta nella fisiopatologia dell’obesità e che esiste un’interazione positiva tra leptina e insulina [31]. I nostri studi mostrano che i livelli plasmatici di inulina e leptina erano più alti nel gruppo DM e che il livello di insulina diminuiva con un aumento della concentrazione di CTE. Il gruppo RSG non mostra alcuna differenza significativa rispetto al gruppo DM. La resistenza all'insulina e la funzione cellulare sono state valutate mediante il metodo HOMA-IR. Il valore HOMA-IR è aumentato nel gruppo DM ed era significativamente diverso da quello degli altri gruppi (Tabella 3).

Il DM influenza la funzione riproduttiva attraverso l'alternanza ormonale nell'asse HPG e gli studi hanno rivelato che anche l'espressione dell'insulina nei testicoli è influenzata dal diabete. È caratterizzata da vacuolizzazione delle cellule del Sertoli, aumento della frammentazione del DNA, alterazione della spermatogenesi e aumento della deplezione delle cellule germinali. Lo stress ossidativo contribuisce anche ad anomalie nella funzione riproduttiva [32]. Il processo di formazione dello sperma nell'organo riproduttivo maschile (testicoli) è chiamato spermatogenesi. Il testicolo è composto da tubuli strettamente avvolti chiamati tubuli seminiferi. Le cellule del Sertoli si trovano nelle pareti del tubulo seminifero e forniscono nutrimento allo sperma immaturo. L'indagine dei parametri spermatici ha indicato che il numero degli spermatozoi e la motilità sono diminuiti e le anomalie sono aumentate nel gruppo DM (Tabella 5). Un effetto opposto è stato osservato nei gruppi trattati con CTE e RSG. Sia le cellule di Leydig che le cellule di Sertoli nel gruppo DM hanno mostrato una significativa atrofia ed è stata osservata la cavità nel lume. Anche lo spessore del tubulo seminifero è diminuito nel gruppo DM. È stato osservato un risultato migliore nei gruppi trattati con CTE e RSG (Figura 9). Oltre a ciò, i livelli di LH e testosterone sono diminuiti nel gruppo DM e i livelli sono aumentati nei gruppi trattati con CTE (Tabella 4). Negli uomini, bassi livelli sierici di testosterone e una minore frequenza del polso LH erano spesso associati all’obesità e al diabete mellito di tipo 2 [33].

Le kisspeptine codificate dal gene KiSS1 sono note come potenti stimolatori dell'asse HPG e qualsiasi mutazione nel gene kisspeptina porterà a bassi livelli di steroidi sessuali e gonadotropine. Gli studi dimostrano che nei ratti diabetici indotti da STZ, i livelli di mRNA di Kiss1 erano diminuiti [33]. L'inizio e il mantenimento dell'infertilità dei mammiferi sono collegati al recettore 54 accoppiato alla proteina G (GPR54). La mutazione in GPR 54 è caratterizzata dall'assenza di maturazione sessuale e da bassi livelli di ormoni gonadotropici (LH e FSH). Le citochine proinfiammatorie come IL-6 e il TNF-regolano l'espressione del soppressore della segnalazione delle citochine 3 (SOCS3) implicato nella resistenza all'insulina mediata dall'infiammazione nel fegato e negli adipociti [34]. SIRT 1 è un gene associato alla regolazione di diverse malattie dell'invecchiamento. Questo gene è espresso in modo prominente nelle cellule del pancreas e regola la secrezione di insulina e previene l'apoptosi. Studi attuali hanno indicato che l'espressione di KiSS1, GPR54 e SIRT1 è diminuita nel gruppo DM, ma l'espressione è aumentata nei gruppi trattati con CTE (Figura 10). Un aumento delle espressioni SOCS-3 nel gruppo DM indica la condizione infiammatoria. Il primo legame molecolare identificato tra obesità e infiammazione è stato il TNF-. Pertanto, un aumento del livello di TNF- è un indicatore di infiammazione. La diminuzione del livello di citochine proinfiammatorie come TNF e IL-6 è stata osservata nei gruppi trattati con CTE (Figure 12 e 13).

Lo squilibrio tra ROS e antiossidanti porta alla condizione diabetica. La superossido dismutasi (SOD), la catalasi (CAT) e la glutatione perossidasi (GPX) sono noti come i principali antiossidanti responsabili del mantenimento del livello ottimale di ROS [35]. Dai risultati si è riscontrato che l’attività degli antiossidanti era significativamente più bassa nel gruppo DM. I gruppi trattati con CT hanno mostrato miglioramenti nella produzione di antiossidanti. Il gruppo trattato con RSG non ha mostrato alcun miglioramento significativo nell'attività antiossidante (Tabelle 6 e 7).

L'ossido nitrico (NO) è noto come un importante ROS che contribuisce all'infiammazione. I nostri studi sottolineano che il livello di NO era diminuito nei gruppi trattati con CTE (Figura 11). I risultati hanno mostrato che il contenuto di anione superossido nello sperma dei ratti diabetici è aumentato in modo significativo e non si è verificato alcun miglioramento significativo dopo la somministrazione di RSG. La produzione di superossido è stata ridotta nei gruppi CTE.

La determinazione dell'MDA è molto utile per valutare la perossidazione lipidica. La perossidazione lipidica è il processo di ossidazione dei lipidi che infine provoca danni cellulari. L'MDA è prodotto come risultato della perossidazione lipidica degli acidi grassi polinsaturi. Gli studi dimostrano che il livello di MDA è correlato all’età e al livello di glucosio nel sangue a digiuno [36]. Lo studio attuale ha indicato che la CTE migliora la perossidazione lipidica nel plasma, nei testicoli e nello sperma (Tabella 8).

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5. Conclusioni

Lo stress ossidativo durante le condizioni diabetiche disturba il sistema riproduttivo maschile attraverso la compromissione dello sperma e la disfunzione gonadica. La Cistanche tubulosa è una pianta del deserto ampiamente accettata nella medicina cinese per i suoi effetti farmacologici.Echinacoside (ECH)è il principale costituente della CTE responsabile delle sue attività antiossidanti e antinfiammatorie. I nostri risultati in vitro hanno indicato che l’ECH ha ripristinato la via di sintesi del testosterone e ha abbassato il livello di espressione delle proteine ​​NF-κB e RAGE. L'ECH ha inibito efficacemente la produzione di anione superossido e H2O2 nelle cellule di Leydig. Gli studi in vivo hanno rivelato che l'ECH riduce i livelli di colesterolo, trigliceridi, TNF- e IL-6. Oltre a ciò, l’espressione dell’mRNA nell’ipotalamo dei ratti diabetici è risultata significativamente migliorata. È inoltre da notare che l’ECH ha ridotto la perossidazione lipidica e migliorato la resistenza all’insulina nei ratti maschi diabetici. L’attività antiossidante è aumentata sia nel plasma che nei testicoli. Pertanto, i nostri studi hanno suggerito che l’ECH forniva una protezione efficace contro la disfunzione riproduttiva nei ratti maschi diabetici indotti da STZ.