Effetto dell'estratto di cistanches deserticola sulla lesione dei conigli RTEC da H2O2

Astratto: Cellule epiteliali tubulari renali di coniglio sono state coltivate in vitro per studiare l'effetto dell'H2O2 sulla proliferazione cellulare e l'estratto di Cistanche deserticola sulle cellule epiteliali tubulari danneggiate dall'H2O2 ． La morfologia cellulare è stata utilizzata per osservare l'effetto di H2O2 sulla proliferazione delle cellule epiteliali tubulari renali di coniglio mediante il metodo MTT e l'effetto protettivo di 2,20 e 200 mg·L － 1 C． l'estratto acquoso di deserticola e l'estratto alcolico sono stati studiati dal rilascio di LDH. I risultati hanno mostrato che il numero di cambiamenti morfologici delle cellule è stato gradualmente aumentato. Il numero di cellule attaccate è stato gradualmente ridotto． Il tasso di inibizione della proliferazione cellulare e il rilascio di LDH sono aumentati insieme all'aumento della concentrazione di H2O2 ． Alte dosi di C． l'estratto di deserticola potrebbe ridurre significativamente l'effetto inibitorio della proliferazione di ＲTEC da parte di H2O2 ( P ＜ 0． 01) ． L'estrazione acquosa e l'estratto alcolico di C． deserticola potrebbe ridurre significativamente il rilascio di LDH ( P ＜ 0． 01) ． L'H2O2 ha avuto alcuni effetti sulla reazione di proliferazione dei ＲTEC di coniglio, mentre il C． l'estratto di deserticola ha un effetto protettivo sulla lesione ＲTEC da H2O2 ．

Parole chiave: Cistanches deserticola; cellula epiteliale tubulare renale; Premessa sul danno cellulare

Cistanche deserticola, noto anche come ginseng del deserto è un fusto mesofillo secco, squamoso di Cistanche deserticola YC Ma o Cistanche tubulosa (Schenk) Wish nella famiglia delle Orobaceae. Ha gli effetti di tonificare lo yang dei reni, di beneficiare l'essenza e il sangue, di inumidire l'intestino e di alleviare la stitichezza. Tradizionalmente utilizzato per la carenza di rene yang, carenza di essenza e sangue, impotenza e infertilità, dolore alla vita e al ginocchio, debolezza di muscoli e ossa, secchezza intestinale e costipazione, è la medicina yang tonificante del rene più usata nella storia. 

Cistanche deserticola

L'H2O2, come una forma di specie reattive dell'ossigeno, ha un forte effetto nell'indurre la perossidazione lipidica e può reagire con quasi tutti i componenti cellulari, causando la perossidazione lipidica a catena e portando all'apoptosi e alla disfunzione cellulare [2,3]. L'esperimento indaga principalmente l'effetto dell'estratto di Cistanche deserticola sull'inibizione della proliferazione H2O2-indotta e sul danno delle cellule epiteliali tubulari renali di coniglio ed esplora preliminarmente il suo effetto protettivo sulle cellule epiteliali tubulari renali.

1 Materiali e Metodi

1.1 Farmaco sperimentale

Cistanche deserticola ma è stata acquistata da Sichuan Chuannan Pharmaceutical Co., Ltd. (numero di lotto 151201).

Cistanche vivente nel deserto

1.2 Animali

Coniglio bianco della Nuova Zelanda, maschio, 20 giorni, acquistato dalla base sperimentale del Guizhou Livestock Research Institute, con numero di licenza animale SCXK (Guizhou) 2012-001.

1.3 Reagenti

DMEM/F-12 (1:1), Gbico Corporation; Siero bovino fetale, Zhejiang Tianhang Biotechnology Co., Ltd; Dimetilsolfossido (DMSO), Pechino Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd; H2O2, Sichuan Jinshan Pharmaceutical Co., Ltd; Tripsina, Amresco Company; Blu di tiazolo (MTT), Genview; Kit per test di citotossicità non radioattiva, Promega Corporation; Etanolo anidro, Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.

1.4 Strumenti

Incubatore a CO2, Tipo 3111, Thermo Fisher Scientific; Marcatore enzimatico, tipo 1510, Thermo Fisher Scientific; Banco da lavoro ultra pulito, SW-CJ-1FD, Suzhou Purification Equipment Co., Ltd; Microscopio a fluorescenza invertito, Ningbo Shunyu; Evaporatore rotante, RE-52AA, Shanghai Yarong Biochemical Instrument Factory; Liofilizzatore, LGJ-12, Beijing Songyuan Huaxing Technology Development Co., Ltd.

1.5 Metodo

1. 5.1 Preparazione dell'estratto di Cistanche deserticola

Prendete le erbe officinali essiccate di Cistanche deserticola e tritatele a pezzetti. Pesare accuratamente 100 g di ciascuna polvere e aggiungere 10 volte la quantità di acqua distillata e il 75 percento di etanolo per riscaldare e riflusso per l'estrazione 3 volte. La prima volta è di 3 ore e la seconda volta è di 1 5 ore, la terza volta per 1 ora, unisci 3 filtrati, riduci la pressione e concentrati sull'estratto, calcola la resa dell'estratto come 22 30 percento, estratto di etanolo 21 70 percento, alcool residuo volatile, un meccanismo di liofilizzazione per ottenere estratti di acqua e alcool da Cistanche deserticola, sigillato, essiccato e conservato in un luogo buio per un uso futuro.

1. 5. 2 Coltura cellulare

Costruire un modello di cellula epiteliale tubulare renale utilizzando il metodo descritto da Zhao Dan et al. [4], isolare e coltivare cellule epiteliali tubulari renali primarie da 20-conigli di un giorno e attendere che le cellule crescano fino a oltre il 90% della piastra di coltura, quindi digerirle con tripsina. Usando un mezzo di coltura completo DMEM/F-12 contenente l'1% di siero bovino fetale ad una velocità di 12 × 104 cellule sono state inoculate su una piastra a 96 pozzetti e coltivate a 37 gradi e 5% di CO2.

1. 5. 3 Realizzazione di un modello di danno cellulare epiteliale tubolare renale di coniglio indotto da 3 H2O2

Fai riferimento a 1 5. 2 Inoculare le cellule e, dopo 48 ore di coltura cellulare stabile, utilizzare H2O2 per i danni. Impostare un gruppo sperimentale e un gruppo di controllo vuoto, con 4 ripetizioni in ciascun gruppo, ripetute tre volte. Gruppo sperimentale: sostituire il terreno di coltura completo con diverse concentrazioni di H2O2, con concentrazioni di H2O2 rispettivamente di 550, 500, 450, 400 e 350 μ Mol · L-1, gruppo di controllo vuoto: sostituire il terreno di coltura completo, continuare a coltivare per 24 ore in condizioni di 37 gradi e 5% di CO2, eseguire l'esame microscopico e raccogliere immagini. Il metodo MTT [5] è stato utilizzato per misurare la proliferazione delle cellule dopo l'azione di H2O2 e il valore di assorbanza (valore OD) è stato misurato a 490 nm. Utilizzo di un kit di rilevamento della citotossicità non radioattiva per determinare i cambiamenti nel rilascio di LDH cellulare dopo il trattamento con H2O2, rilascio di LDH (percentuale)=quantità di LDH surnatante/(quantità di LDH surnatante più quantità di LDH lisato) × 100 percento. Colorazione di fluorescenza AO/EB [6]: prelevare rispettivamente 100 μ G/mL di soluzione AO ​​e 100 μ 100 g/mL di soluzione EB per ogni μ L. Mescolare bene e aggiungere 10 μ L a ciascun pozzetto. Posizionarlo immediatamente su un contrasto di fase invertito microscopio a fluorescenza per l'osservazione, mantenere invariato il campo visivo di osservazione entro 5 minuti e raccogliere immagini sotto luce blu a 450 ± 10 nm e luce verde a 532 ± 10 nm, rispettivamente. Utilizzare un sistema di raccolta della fluorescenza per la sintesi della fluorescenza per ottenere immagini di colorazione della fluorescenza.

1. 5. 4 Effetto della polvere di estratto di 4 Cistanche sul danno indotto da H2O2- alle cellule epiteliali tubolari renali di coniglio

Polvere di cistanche

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Secondo 1 5. 2 Inoculare le cellule e, dopo 24 ore di coltura cellulare stabile, aggiungere in ciascun pozzetto 200 ul di terreno di coltura completo contenente l'estratto di Cistanche deserticola per pre-proteggere le cellule per 24 ore. Impostare un gruppo sperimentale, un gruppo modello e un gruppo di controllo vuoto, con tre ripetizioni per gruppo. Gruppo sperimentale e gruppo modello: sostituire con 400 μ Terreno di coltura completo con mol · L-1 H2O2; Gruppo di controllo in bianco: terreno di coltura completo. Continua a coltivare per 24 ore. La proliferazione cellulare è stata misurata utilizzando il metodo MTT e i cambiamenti nel rilascio di LDH cellulare sono stati misurati utilizzando un kit di analisi della citotossicità non radioattiva.

1.6 Elaborazione statistica

I risultati dei dati sono espressi in x ± s utilizzando il software statistico SPSS 19 0 utilizzato per l'analisi statistica. L'analisi a fattore singolo della varianza è stata utilizzata per i confronti tra gruppi e il metodo LSD è stato utilizzato per confronti multipli tra gruppi, con P<0 05 indicating statistical significance.

2 Risultati e analisi

2.1 Cambiamenti morfologici delle cellule epiteliali tubulari renali di coniglio indotte da H2O2

Dopo che le cellule epiteliali tubulari renali di coniglio sono state trattate con diverse concentrazioni di H2O2 per 24 ore, la morfologia delle cellule epiteliali tubulari renali di coniglio è stata osservata al microscopio, come mostrato nella Figura 1. Con l'aumento della concentrazione di H2O2, il numero di cellule con i cambiamenti morfologici gradualmente aumentati, il numero di cellule aderenti alla cellula parietale è gradualmente diminuito, alcune cellule si sono allungate, la lucentezza cellulare è diminuita e la dimensione è diminuita. La concentrazione di H2O2 ha raggiunto i 550 μ Mol · L-1, gli assoni scompaiono, le membrane cellulari si rompono, le cellule si restringono, le lacune cellulari aumentano e compaiono delle lacune tra macchie di cellule.

Fig. 1 Effetto della concentrazione di H2O2 sulla morfologia del coniglioRTEC ( 100 × )

2.2 L'effetto di 2.2 H2O2 sulla proliferazione delle cellule epiteliali tubulari renali di coniglio

Utilizzare rispettivamente 350, 400, 450, 500 e 550 μ Mol · L-1 H2O2 di cellule epiteliali tubulari renali di coniglio trattate per 24 ore e l'assorbanza è stata misurata utilizzando il metodo MTT. I risultati hanno mostrato che diverse concentrazioni di H2O2 hanno avuto un effetto inibitorio sulla proliferazione delle cellule epiteliali tubulari renali di coniglio, con un valore IC50 di 439 07 μ mol·L － 1, 500 μ L'effetto inibitorio di H2O2 con mol · L -1 sulla proliferazione cellulare può raggiungere oltre il 50 percento dopo 24 ore, quindi questa concentrazione è stata selezionata per la ricerca successiva.

2.3 L'effetto di 2.3 H2O2 sul rilascio di LDH nelle cellule epiteliali tubulari renali di coniglio

Dopo 24 ore di trattamento con H2O2 su cellule epiteliali tubulari renali di coniglio, sono stati misurati i valori di OD delle reazioni LDH nel supernatante cellulare e nel lisato cellulare utilizzando metodi di rilevamento della citotossicità non radioattiva ed è stato calcolato il rilascio di LDH dalle cellule. I risultati sono mostrati nella Tabella 1. Diverse concentrazioni di H2O2 possono causare un aumento del rilascio di LDH dalle cellule epiteliali tubulari renali di coniglio, e maggiore è la concentrazione di H2O2, maggiore è il rilascio di LDH in modo dipendente dalla concentrazione. L'H2O2 a una concentrazione di 400 mmol · L-1 fa sì che il rilascio cellulare di LDH superi il gruppo vuoto di oltre il 50 percento , con conseguenti gravi danni cellulari.

Scheda. 1 Effetti di H2O2 sul rilascio di LDH da RTEC di coniglio

Nota: Rispetto al gruppo di controllo in bianco, * P<0 05; ＊＊ P ＜ 0. 01

2.4 Risultati della colorazione di fluorescenza AO/EB di cellule epiteliali tubulari renali di coniglio trattate con 2.4 H2O2

Dopo che le cellule epiteliali tubulari renali di coniglio sono state trattate con H2O2 per 24 ore, le cellule sono state colorate con fluorescenza AO/EB, come mostrato nella Figura 2. È stato giudicato preliminarmente che il meccanismo dell'H2O2 sulle cellule epiteliali tubulari renali di coniglio era principalmente quello di causare necrosi. Diverse concentrazioni di H2O2 possono causare vari gradi di necrosi nelle cellule epiteliali tubulari renali di coniglio, con concentrazioni di H2O2 inferiori a 400 μ A mol · L-1, la cromatina nucleare si restringe in un cerchio di colore verde, che viene principalmente giudicato come apoptosi precoce. Con l'aumento della concentrazione di H2O2, è superiore a 450 μ A mol · L-1, le cellule hanno mostrato una forma di perla non rotonda rosso-arancio e il numero di cellule necrotiche è aumentato in modo dipendente dalla concentrazione.

2.5 Effetto di 2.5 Cistanche deserticola sulla proliferazione indotta da H2O2- delle cellule epiteliali tubulari renali di coniglio

Studio sperimentale su Cistanche deserticola

Il tasso di sopravvivenza delle cellule epiteliali tubulari renali di coniglio a diverse concentrazioni (2, 20, 200 mg! L-1) di estratti di acqua e alcol da Cistanche deserticola non ha mostrato differenze significative rispetto alle cellule coltivate in condizioni normali senza intervento. Come mostrato nella Figura 3, rispetto al gruppo modello, i gruppi ad alta concentrazione di estratti alcolici e acquosi di Cistanche deserticola hanno ridotto significativamente l'effetto inibitorio dell'H2O2 sulla proliferazione delle cellule epiteliali tubulari renali di coniglio (P<0 01).

Fig. 2 Colorazione AO/EB di coniglioRTEC trattate con diverse concentrazioni di H2O2 ( 100 × )

Nota: Rispetto al gruppo di modelli, * P<0 05,＊＊P ＜ 0. 01

Fig. 3 Effetto di C． deserticola sull'inibizione di H2O2 － coniglio indottoRProliferazione delle TEC

2.6 Effetto di 2.6 Cistanche deserticola sul danno indotto da H2O2 a cellule epiteliali tubulari renali di coniglio

I risultati dell'impatto sul rilascio di LDH nelle cellule sono mostrati nella Figura 4. I gruppi di concentrazione alta, media e bassa dell'estratto di etanolo e dell'estratto acquoso di Cistanche deserticola hanno determinato un rilascio di LDH significativamente inferiore nelle cellule epiteliali tubulari renali di coniglio dopo H2O2 trattamento rispetto al gruppo modello (P<0 01), the results are concentration-dependent, with higher concentrations leading to lower cell LDH release.

Nota: Rispetto al gruppo di modelli, * P<0 05,＊＊P ＜ 0. 01

Fig. 4 Effetto di C． deserticola su H2O2 － ha indotto il rilascio di LDH dal coniglioRTEC

3 Discussione

Cistanche deserticola, noto come "ginseng del deserto", ha un altissimo valore medicinale ed è una famosa medicina tonica cinese. Lo "Shennong Materia Medica Classic" [7] descrive la medicina di alto livello come: "Shangyao... nutre principalmente la vita per rispondere ai cieli, non tossico, e dovrebbe essere preso frequentemente senza nuocere alle persone..." Cistanche deserticola è elencato come una medicina di prima scelta, con un sapore dolce e una temperatura mite. La "Lista dei medici famosi" [8] sottolinea che la Cistanche deserticola è "acida, salata e non tossica". Successivamente, le registrazioni della natura, del gusto e del meridiano di Cistanche deserticola in varie dinastie di erboristeria cinese sono coerenti. La sua natura è leggermente calda e il suo sapore è dolce, acido e salato, che appartiene ai meridiani dei reni e dell'intestino crasso. Tradizionalmente utilizzato per la carenza di yang renale, dolori alla vita e alle ginocchia e debolezza muscolare e ossea, i suoi effetti e meccanismi farmacologici sono sempre stati al centro della ricerca. Moderni studi farmacologici hanno dimostrato che Cistanche deserticola può resistere all'invecchiamento, migliorare le capacità di apprendimento e memoria e regolare le funzioni immunitarie. È ampiamente utilizzato nelle prescrizioni cliniche della medicina tradizionale cinese, dei medicinali brevettati tradizionali cinesi e dei preparati semplici e dei prodotti per la cura della salute.

Supplemento Cistanche vicino a me

Lo stress ossidativo è l'incentivo chiave di alcune malattie importanti, che è dovuto allo squilibrio tra la formazione e l'eliminazione di specie reattive dell'ossigeno nel corpo, con conseguente un certo grado di danno ossidativo agli istiociti. Pertanto, una ricerca approfondita sul meccanismo della risposta allo stress può trovare un modo ragionevole per prevenire, migliorare o addirittura eliminare efficacemente le malattie da irritabilità. Lo stress ossidativo può portare a varie perossidazioni cellulari e proteiche nel corpo [9] e l'H2O2 è scelto come una delle sostanze esogene per i danni nella ricerca. Ha un forte effetto sull'induzione della perossidazione lipidica, causando reazioni di perossidazione lipidica a catena e portando all'apoptosi e alla disfunzione cellulare. Al momento, la ricerca sulla nefrotossicità di questa sostanza esogena e il suo effetto antagonista si basa principalmente sulla creazione di modelli animali, e ci sono relativamente pochi rapporti di letteratura sulla creazione di modelli in vitro per la ricerca correlata. Rispetto ai modelli animali di nefrotossicità, il modello cellulare nefrotossico in vitro presenta vantaggi come un chiaro obiettivo dell'azione, un breve ciclo di trattamento e un basso dosaggio.

Cistanche di erbe cinesi

Studiare il modello cellulare nefrotossico in vitro indotto da sostanze esogene attraverso cambiamenti nella morfologia cellulare, effetti inibitori di sostanze esogene sulla proliferazione cellulare e cambiamenti nel rilascio di LDH cellulare. Diverse concentrazioni di H2O2 hanno un impatto significativo sui cambiamenti morfologici delle cellule. All'aumentare della concentrazione di sostanze esogene, si riscontra che aumenta il numero di deformazioni cellulari. Il test MTT è un metodo comunemente usato per rilevare il numero di cellule viventi. In esperimenti in cui diverse concentrazioni di Cistanche deserticola proteggono le cellule epiteliali tubulari renali di coniglio dai danni di H2O2, diverse concentrazioni di Cistanche deserticola hanno ridotto significativamente il tasso inibitorio di H2O2 sulle cellule epiteliali tubulari renali di coniglio ed è dipendente dalla concentrazione. Quando la membrana cellulare è danneggiata, l'LDH intracellulare verrà rilasciato nel mezzo di coltura. Il contenuto di LDH nel mezzo di coltura cellulare è un indicatore importante per rilevare la morte cellulare. Questo studio ha rilevato che il livello di LDH nel mezzo di coltura cellulare del gruppo modello con danno indotto da H2O2- alle cellule epiteliali tubulari renali di coniglio è aumentato in modo significativo, mentre il livello di LDH nel gruppo sperimentale trattato con diverse concentrazioni di Cistanche deserticola significativamente diminuisce in modo concentrazione-dipendente.I risultati della ricerca suggeriscono che stabilire un modello di danno indotto da H2O2- alle cellule epiteliali tubulari renali di coniglio ed esplorare preliminarmente l'effetto protettivo dell'estratto di Cistanche deserticola sulle cellule epiteliali tubulari renali, non solo pone le basi per la ricerca sul danno cellulare causato dallo stress ossidativo ma fornisce anche dati di base per lo sviluppo e l'utilizzo di Cistanche deserticola.

riferimento:

［1］ cap. P(2015) Vol Ⅰ［S］． 2015: 135.

［2］ Kim JH, Choi W, Lee JH, et al. L'astaxantina inibisce la morte cellulare apoptotica mediata da H2O2－ nelle cellule progenitrici neurali del topo attraverso la modulazione delle vie di segnalazione p38 e MEK［J］． Microbiol Biotechnol,2009,19( 11) : 1355 － 1363.

［3］ Siu PM, Wang Y, Sempre SE. Segnalazione apoptotica indotta da H2 O2 － stress ossidativo mediato in miotubi C2 Cl2 differenziati［J］． Life Sci,2009,84( 13) : 468 － 481. ［4］ Zhao Dan, Zhang Xue, Guan Jing, etc Uno studio sugli effetti di diverse erbe medicinali cinesi sulla proliferazione delle cellule epiteliali tubolari renali primarie nei conigli ［ J ］. Journal of Mountain Agricultural Biology, 2017, 36 (4): 76-79

［5］ Chen Lizhen, Feng Tingting, Huang Junfei, et al Studio sull'effetto dell'ipriflavone sull'attività degli osteoclasti e sulla proliferazione e differenziazione degli osteoblasti ［ J ］. Journal of Mountain Agricultural Biology, 2015, 34 (3): 042-047

［6］ Chen Meng, Li Huatao, Li Xiang, et al Rilevazione dell'apoptosi indotta da paclitaxel in cellule tumorali mammarie canine in vitro utilizzando il metodo di doppia colorazione AO/EB [J]. Guangdong Livestock and Veterinary Science and Technology, 2011, 36 (1): 39-42

［7］ Gu GG,Yang P J. Shen Nong Ben Cao Jing［M］． Pechino: Xueyuan Press, 2013: 73.

［8］ Tao HJ,Shang Z J. Ming Yi Bie Lu［M］． Pechino: casa editrice medica popolare, 1986: 51.

［9］ Cash TP,Pan Y,Simon M C. ＲSpecie attive dell'ossigeno e rilevamento dell'ossigeno cellulare［J］． Libero Ｒadic Biol Med,2007,43( 9) : 1219 － 1225．