Effetti di quattro estratti di erbe cinesi sulle cellule di carcinoma polmonare a piccole cellule farmaco-sensibili e multiresistenti

David SadavaJulie Ahn Mei Zhan Mei Lin PangJane DingSusan E. Kane

Scopo astratto:Abbiamo esaminato la farmacologia, la biologia cellulare e la biologia molecolare delle cellule di carcinoma polmonare a piccole cellule trattate con quattro estratti diErboristeria cinese. Molti malati di cancro assumono questi medicinali, ma i loro effetti a livello cellulare sono in gran parte sconosciuti. Eravamo particolarmente interessati agli effetti sulle cellule resistenti ai farmaci, poiché la resistenza è un problema clinico significativocancro ai polmonir. Metodi: Le cellule epiteliali polmonari sensibili ai farmaci (H69), multi-resistenti (H69VP) e normali (BEAS-2) sono state esposte a estratti di due piante utilizzate nella fitoterapia cinese percancro ai polmoni: Glycyrrhiza glabra (GLYC) e Olenandria diffusa (OLEN), e agli estratti di due combinazioni disponibili in commercio diErboristeria cinese, SPES (15 erbe) e PC-SPES (8 erbe). La citotossicità è stata misurata in termini di inibizione della crescita cellulare (IC50). La cinetica della frammentazione del DNA dopo l'esposizione agli estratti di erbe è stata misurata mediante etichettatura BudR seguita da ELISA. L'apoptosi è stata misurata mediante il test TUNEL seguito da citometria a flusso. L'espressione dei geni correlati all'apoptosi e al ciclo cellulare è stata misurata mediante trascrizione inversa dell'mRNA seguita dall'ibridazione del filtro con array di sonde e rilevamento mediante chemiluminescenza. Risultati: in ogni caso, i quattro estratti di erbe erano ugualmente citotossici per H69 e H69VP e meno citotossici per BEAS-2. Tutti e quattro gli estratti hanno indotto la frammentazione del DNA nelle cellule di carcinoma polmonare. La cinetica ha mostrato frammenti di DNA rilasciati nel mezzo (indicazione di necrosi) in colture esposte a GLYC, ma all'interno delle cellule (indicazione di apoptosi) in colture esposte a Olen, SPES e PC-SPES. L'analisi TUNEL ha confermato che l'esposizione agli ultimi tre estratti, ma non al GLYC, ha portato all'apoptosi. Rispetto alle cellule non trattate e trattate con GLYC, le cellule H69 e H69VP trattate con OLEN, SPES e PC-SPES hanno mostrato un'elevata espressione di un numero di geni coinvolti nella cascata apoptotica, simile alle cellule trattate con etoposide e vincristina.

Conclusione:IlErboristeria cinesegli estratti OLEN, SPES e PC-SPES sono citotossici sia per i farmaci resistenti che per quelli sensibilicancro ai polmonicellule, che mostrano una certa specificità delle cellule tumorali rispetto al loro effetto sulle cellule normali, e sono proapoptotiche come misurato dalle rotture del DNA e dall'espressione genica. La reazione delle cellule tumorali a questi estratti è stata simile alla loro reazione ai farmaci chemioterapici convenzionali.

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Parole chiave:Cancro ai polmoni, Resistenza ai farmaci,Erboristeria cinese,cistance

Contatto:joanna.jia@wecistanche.com

introduzione

A piccole cellulecancro ai polmoni(SCLC) rappresenta circa il 20 percento di tuttotumori polmonaried è aggressivo, con un tasso di sopravvivenza di 5-anni alla diagnosi inferiore al 10 percento [19]. I pazienti si presentano comunemente con malattia disseminata, quindi il trattamento prevede la chemioterapia, con combinazioni che coinvolgono comunemente cisplatino, etoposide, doxorubicina, 5-fluorouracile e taxolo [12]. Sfortunatamente, questo trattamento alla fine diventa inefficace perché la maggior parte dei tumori SCLC sviluppa resistenza multifarmaco [18]. Poiché ci sono molti meccanismi di resistenza [15], il superamento della resistenza è una sfida clinica importante.

Di fronte alle cure palliative, molti malati di cancro usano medicine alternative, comprese le terapie a base di erbe [6, 23]. Tra queste terapie, la medicina tradizionale cinese è probabilmente la più consolidata e codificata, risalente a diverse migliaia di anni fa. La base teorica di questo sistema medico riguarda le forze opposte di yin e yang, cicli generativi e distruttivi, e una forza vitale, o qi [2]. Specifici estratti di erbe e combinazioni sono stati ideati per trattare malattie specifiche, inclusi i tumori [11, 27]. Sebbene ci siano alcune prove empiriche che le erbe siano efficaci nel trattamento del cancro, i loro meccanismi d'azione a livello cellulare sono in gran parte sconosciuti. Ciò assume maggiore importanza se i pazienti stanno combinando il loro uso con la chemioterapia convenzionale. Inoltre, non sono stati riportati gli effetti degli estratti vegetali sulla resistenza ai farmaci.

Abbiamo studiato gli effetti di quattroErboristeria cinesesu tre linee cellulari: SCLC, SCLC multiresistente ed epitelio polmonare normale. Due dei quattro estratti provenivano da piante singole spesso prescritte per il cancro ai polmoni, Glycyrrhiza glabra (GLYC) e Olenandria diffusa (OLEN). Gli altri due provenivano da combinazioni di erbe disponibili in commercio chiamate SPES e PC-SPES. OLEN (nome cinese Bai Hua she cao) ha attività antitumorale, antimutagena e immunostimolante [1, 25, 29]. GLYC (nome cinese gan car) è antinfiammatorio, antitumorale e antimutageno [7, 11]. SPES, sviluppato da BotanicLabs (Brea, California), è sotto forma di capsule contenenti estratti liofilizzati di 15 erbe cinesi e ha dimostrato di ridurre il dolore nei pazienti con tumori avanzati [14]. Tra le erbe in SPES ci sono l'immunostimolanteCistanchedeserticola, l'agente antitumorale Rabdosia rubescens e l'agente antinfiammatorio Zanthoxylum iridium [1, 11]. PC-SPES, anch'esso preparato da BotanicLabs, contiene otto erbe, tra cui l'antiandrogeno Serenoa repens che inibisce l'iperplasia prostatica [21], l'inibitore della proteina chinasi C Scutellaria baicalensis [13], l'agente antitumorale Panax ginseng [30] e Glycyrrhiza glabra ( vedi sopra). Mentre mancano prove rigorose per l'efficacia clinica antitumorale di GLYC, OLEN e SPES, ci sono alcune prove per l'efficacia di PC-SPES. Sia nelle cellule di cancro alla prostata che nei modelli animali, PC-SPES è proapoptotico e citotossico [8, 9, 10, 28]. Studi clinici hanno indicato che è efficace nell'abbassare i livelli di antigene prostatico specifico e nell'arrestare la crescita del tumore nel carcinoma prostatico sia androgeno-dipendente che androgeno-indipendente [4, 5, 17, 20, 26].

Sebbene i pazienti oncologici utilizzino senza dubbio estratti di erbe, ci sono scarsi dati preclinici o clinici sugli effetti di questi estratti sull'SCLC. Il nostro obiettivo era iniziare questa analisi con un esame della farmacologia (citotossicità), della biologia cellulare (metodo di morte cellulare) e della biologia molecolare (espressione genica) in cellule SCLC farmaco-sensibili e resistenti.

Materiali e metodi

Estratti e prodotti chimici

GLYC e OLEN sono stati ottenuti come piante essiccate da Jen-On Medical Group (Monterey Park, California). Per la preparazione di un estratto, 0,5 g sono stati ridotti in polvere fine con un mortaio e un pestello e sospesi in 30 ml di acqua distillata. Nella medicina cinese, gli estratti vegetali vengono consumati come tisane dopo il riscaldamento. Pertanto, la sospensione è stata incubata con agitazione a 70 gradi per 18 ore. Dopo centrifugazione a 1500 g per 10 minuti, il surnatante è stato sterilizzato filtrando attraverso un filtro da 0,45-lm utilizzando una siringa. L'estratto risultante è stato regolato con acqua distillata a 17 mg/ml sulla base del materiale vegetale originale. Gli estratti sono stati conservati a 4 gradi per un massimo di 1 settimana fino all'uso.

SPES e PC-SPES sono stati ottenuti da BotanicLabs (Brea, California) come capsule. Il metodo di estrazione utilizzato è stato impiegato in studi precedenti su questi preparati [8, 9, 10]. Il contenuto di una capsula (320 mg) è stato sciolto in 1 ml di etanolo al 95% e la sospensione è stata incubata con agitazione a 37 gradi per 1 ora. Dopo centrifugazione a 3000 g per 10 minuti, il supernatante è stato sterilizzato per filtro come sopra. La concentrazione finale era di 300 mg/ml in base al materiale vegetale originale. Gli estratti sono stati conservati a -20 gradi per un massimo di 1 settimana fino all'uso.

Colture cellulari e misurazione della citotossicità

Le cellule SCLC NCI-H69 sono state coltivate a 37 gradi in un'atmosfera contenente il 5% di CO2 come sospensione in mezzo privo di siero AIM-V (Life Technologies, Grand Island, NY). Anche una linea cellulare multiresistente (H69VP) selezionata in etoposide [16] è stata coltivata in AIM-V e ha mostrato resistenza crociata a etoposide (9- volte), doxorubicina ({13}} volte) e vincristina (10-piega) (dati non mostrati). Queste cellule hanno molteplici meccanismi di resistenza ai farmaci, comprese le alterazioni della topoisomerasi II e l'espressione delle pompe di membrana, MDR1 e MRP. BEAS-2 cellule epiteliali polmonari normali [22] sono state coltivate in DMEM-F12 integrato con il 10% di siero bovino fetale.

Per i test di citotossicità, gli estratti sono stati aggiunti come indicato alle cellule in crescita logaritmica in 1-ml di colture contenenti 6000 cellule/ml. Dopo 4 giorni di esposizione continua, le cellule sono state contate in un contatore Coulter Z-1. I conteggi sono stati convalidati al microscopio mediante emocitometro dopo la colorazione con blu trypan. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato e ripetuti almeno tre volte. I valori di IC50, definiti come la concentrazione dell'estratto che aveva ridotto del 50% la conta cellulare al giorno 4, sono stati calcolati rispetto ai controlli con solvente. I valori medi sono stati calcolati e confrontati mediante ANOVA per le tre linee cellulari per quell'estratto.

Saggi di morte cellulare

Il meccanismo della citotossicità è stato studiato dalla cinetica della frammentazione del DNA cellulare (kit Boehringer-Mannheim, Indianapolis, Ind.). In breve, 5·105 cellule/ml sono state incubate per 16 ore a 37 gradi in un'atmosfera contenente il 5% di CO2 in un mezzo AIM-V contenente 10 lM di BudR. Le cellule sono state lavate e risospese a 105/ml in terreno privo di BudR e 200 ll di questa coltura sono stati incubati con estratto di erbe a 2·IC50 per il tempo indicato, dopodiché 100 ll del mezzo di coltura sono stati rimossi per la quantificazione del DNA frammenti di ELISA. Questa è una misura della necrosi cellulare. I frammenti di DNA all'interno delle cellule, generati dall'apoptosi, sono stati misurati dopo la lisi cellulare nell'albumina sierica bovina (BSA)/Tween 20 a 21 gradi per 30 minuti. Dopo la centrifugazione, il lisato è stato utilizzato per l'ELISA.

L'ELISA è stato eseguito in una piastra per microtitolazione a fondo tondo rivestita con anticorpi anti-DNA (monoclonale anti-DNA umano di topo, clone MCA-33) durante la notte a 4 gradi. Dopo il blocco con BSA, ai pozzetti rivestiti è stata aggiunta una soluzione di frammento di DNA marcata con 100 ll, seguita da incubazione per 90 minuti a 21 gradi. Il DNA è stato fissato e denaturato mediante irradiazione a microonde a 500 W per 5 minuti. È stato aggiunto anti-BudR di topo (BMG monoclonale di topo 6HB) coniugato con perossidasi e, dopo incubazione al buio per 120 min a 21 gradi, la reazione è stata interrotta con l'aggiunta di 500 ll di H2SO4 concentrato. Il colore risultante è stato quantificato mediante assorbanza a 450 nm. I campioni trattati con l'estratto sono stati confrontati con i controlli non trattati come sfondo.

L'apoptosi è stata confermata dall'analisi TUNEL. Le cellule a crescita logaritmica sono state esposte all'estratto di erbe a 1·IC50 per 3 h. Sono stati quindi lavati due volte in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente l'1% di BSA e risospesi in PBS/BSA a 5,105 cellule/ml. A 500 ll di cellule è stato aggiunto 100 ll 4% di paraformaldeide e le cellule sono state fissate a 21 gradi per 1 ora. Dopo il lavaggio in PBS, le cellule sono state risospese in 100 ll di tampone di permeabilizzazione a freddo (0,1 percento di Triton X-100, 0,1 percento di citrato di sodio) per 2 minuti a 4 gradi. Le cellule sono state lavate due volte in PBS e quindi risospese in una miscela TUNEL da 50 ll contenente desossiribonucleotide-idiltransferasi terminale (TdT) e fluoresceina-dUTP (kit Boehringer-Mannheim). Dopo incubazione al buio a 37 gradi per 1 ora, le cellule sono state controcolorate con ioduro di propidio e analizzate mediante citometria a flusso.

Analisi dell'espressione genica

Colture (6 ml) di cellule a crescita logaritmica (5·1{11}}5 cellule/ml) sono state incubate in un mezzo contenente estratto di erbe a 1·IC50 a 37 gradi in un'atmosfera contenente il 5% di CO2 per 3 ore. Dopo il lavaggio due volte in PBS, i pellet cellulari sono stati congelati a -70 gradi durante la notte. L'RNA è stato isolato dal protocollo RNeasy Mini (Qiagen, Valencia, California). In generale, questo metodo ha prodotto 0,5 LG RNA. Questa quantità di RNA è stata trascritta inversa in cDNA ed etichettata con biotina-dUTP e ibridata con sonde denaturate su geni correlati all'apoptosi e al ciclo cellulare sui filtri. L'ibridazione è stata rilevata legando la fosfatasi alcalina-streptavidina al cDNA utilizzando un substrato chemiluminescente, CDP-Star (SuperArray, Bethesda, Md.), seguito dall'esposizione a pellicola a raggi X, generalmente per 1-2 minuti.

Gli obiettivi del gene di controllo su ciascun filtro includevano b-actina e GAP-DH come controlli positivi e pUC18 come controllo negativo. I seguenti geni correlati al ciclo cellulare e all'apoptosi erano bersagli di ibridazione: bad, bcl-2, BCL-w, BCL-x, caspases 1–10, c-myc, E2F, fas, fas ligand, gadd45, iNOS , mdm2, NFkB, p21Waf1, p53, pig7, pig8, Rb, DR5, trail, Casper, CRADD, DAXX, IAP-1, IAP-2, NIK, TNFR2, TRAF2, TRAF3, TRAF5 e DR5. L'intensitàdi ibridazione è stata valutata visivamente in punti duplicati in tandem sul filtro in relazione ai controlli positivi.

Risultati

I nostri esperimenti iniziali hanno testato la citotossicità di estratti di erbe cinesi su cellule SCLC sensibili e resistenti ai farmaci, nonché su cellule epiteliali polmonari normali. Come mostrato nella Tabella 1, i quattro estratti di erbe erano citotossici a basse concentrazioni. Questi risultati sono simili a quelli trovati per SPES e PC-SPES in altre linee cellulari tumorali [8]. In ogni caso, i valori di IC50 per le cellule multiresistenti (H69VP) non erano diversi da quelli per le cellule farmaco-sensibili (H69). Inoltre, i valori di IC50 per le cellule epiteliali polmonari normali erano significativamente superiori a quelli per le linee cellulari tumorali.

Abbiamo quindi studiato il meccanismo della citotossicità utilizzando la cinetica della frammentazione del DNA come indicazione di apoptosi (frammenti formati lentamente all'interno delle cellule) o necrosi (frammenti formati e rilasciati rapidamente dalle cellule danneggiate). Le cellule sono state incubate in un estratto di erbe per un periodo compreso tra 30 minuti e 8 ore, quindi i frammenti di DNA sono stati stimati mediante ELISA sia nel mezzo di coltura che nei lisati cellulari. La figura 1 mostra i dati rappresentativi per le cellule H69 esposte ai quattro estratti per 90 min. Con tre degli estratti (SPES, PC-SPES, OLEN), la maggior parte dei frammenti di DNA proveniva dall'interno delle cellule (lisati), indicando l'apoptosi. Tuttavia, con GLYC, i frammenti sono stati rilasciati nel mezzo dalle cellule danneggiate, indicando necrosi. Risultati simili sono stati ottenuti con cellule H69VP (dati non mostrati).

Questi esperimenti di citotossicità sono stati seguiti da test TUNEL delle rotture del DNA in situ. Rispetto ai controlli non trattati (1–3 percento di cellule apoptotiche in quattro esperimenti), le cellule SCLC trattate con SPES (58–85 percento), PC-SPES (63–77 percento) e OLEN (49–81 percento) hanno mostrato positività TUNEL, mentre le cellule trattate con GLYC non lo facevano (1–2 percento) (Fig. 2). Risultati simili sono stati ottenuti con cellule H69VP (dati non mostrati).

Abbiamo analizzato la trascrizione genica in risposta a estratti di erbe utilizzando GeneArrays. Questi array hanno geni disposti in tandem correlati al ciclo cellulare e all'apoptosi. Abbiamo eseguito questi esperimenti due volte con risultati simili. La figura 3 mostra diagrammi arrayautora rappresentativi di cellule H69 esposte a etoposide o SPES. I nostri risultati per le cellule H69 sono riassunti nella Tabella 2. Mentre i controlli non trattati avevano un'espressione rilevabile solo di alcuni dei geni studiati, le cellule trattate con farmaci chemioterapici convenzionali (etoposide e vincristina) hanno mostrato forti segnali per un certo numero di geni coinvolti nel ciclo cellulare regolazione e apoptosi. Le cellule trattate con OLEN, SPES e PC-SPES hanno mostrato un pattern simile a quello ottenuto con i due farmaci. In generale, le cellule trattate con GLYC non sembravano mostrare questo pattern di trascrizione, e invece mostravano una forte espressione del gene antiapoptosi, BCL-2.

Discussione

Abbiamo intrapreso questi studi per due motivi. In primo luogo, esiste un'antica tradizione della fitoterapia cinese che si basa sulle proprie teorie e filosofia [2], e abbiamo voluto iniziare a comprendere in termini medici occidentali gli effetti dei rimedi erboristici. Queste erbe vengono utilizzate come miscele e, sebbene siano stati compiuti alcuni progressi nella scomposizione in singoli costituenti chimici[11], i nostri studi si sono concentrati su di esse poiché vengono utilizzate nella pratica tradizionale. La nostra seconda motivazione era che molti malati di cancro usano queste erbe insieme ai trattamenti convenzionali [6, 23] e la comprensione degli effetti cellulari delle erbe potrebbe fornire informazioni importanti per il processo decisionale clinico.

I dati di citotossicità (Tabella 1) hanno mostrato che i quattro estratti di erbe erano effettivamente citotossici per le cellule tumorali, più in base al dosaggio che per le normali cellule epiteliali polmonari, indicando una certa specificità del tumore e possibilmente un indice terapeutico favorevole. Le somiglianze in IC50 tra cellule farmaco-sensibili e multiresistenti indicano che questi estratti non sono influenzati dai meccanismi di resistenza ai farmaci visualizzati nelle cellule H69VP, inclusa la sovraespressione di due trasportatori di farmaci, MDR1 e MRP.

La cinetica della frammentazione del DNA ha mostrato che gli estratti SPES, PC-SPES e OLEN erano proapoptotici, mentre GLYC era pron erotico (Fig. 1). Ciò è stato confermato dalla colorazione TUNEL in situ (Fig. 2). La maggior parte dei farmaci chemioterapici convenzionali sono proapoptotici [3] e un gruppo di geni apoptotici e regolatori del ciclo cellulare è sovraregolato nelle cellule in risposta ai farmaci [24]. Abbiamo scoperto che il modello di espressione di alcuni dei geni espressi in risposta alle tre app pro agli estratti di erbe era simile a quello osservato in queste cellule dopo l'esposizione a farmaci chemioterapici convenzionali (Fig. 3, Tabella 2). La risposta al solo GLYC sembrava essere diversa, almeno nel momento analizzato in questi esperimenti. È interessante notare che GLYC fa parte di PC SPES, che era proapoptotico, mentre GLYC da solo non lo era. Forse altri componenti di PC-SPES sono responsabili della sua attività proapoptotica. Sebbene questi risultati non mostrino come gli estratti di erbe abbiano danneggiato le cellule, suggeriscono che le cellule H69 rispondano al danno a livello molecolare (trascrizione) e cellulare (apoptosi) in un modo simile alla loro risposta alla chemioterapia.

I nostri studi indicano la potenziale utilità di questi estratti di erbe cinesi nel trattamento dell'SCLC, in particolare delle malattie resistenti ai farmaci.

RingraziamentiRingraziamo L. Brown per la preziosa assistenza con i colleghi citometria e R. Lingeman per l'assistenza con i protocolli di biologia molecolare. Le cellule BEAS{0}} sono state generosamente fornite dal Dr. I. Laird-Offringa, University of Southern California, Norris Cancer Center. SPES e PC-SPES sono stati un regalo del Dr. S. Chen, New York Medical College. Questa ricerca è stata supportata dalla Pritzker Family Foundation e dalla WM KeckFoundation.

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