Effetti dei gliosidi di cistanche sull'apprendimento cognitivo e sulla plasticità sinaptica nei ratti modello di privazione del sonno

ASTRATTO

Obiettivo:Per esplorare se i glicosidi della cistanche possono migliorare l'apprendimento e la funzione cognitiva dei ratti modello di privazione del sonno regolando la plasticità sinaptica.

Metodi: Cinquanta ratti Wistar maschi sono stati divisi casualmente in un gruppo di controllo vuoto (Control), un gruppo di controllo su piattaforma (PC), un gruppo modello (Model),glicosidi del gruppo cistanch (GC)e il gruppo estazolam (Est). Il modello di privazione del sonno dei ratti è stato preparato mediante un metodo di ambiente acquatico multipiattaforma modificato. Il labirinto acquatico di Morris e il test in campo aperto sono stati utilizzati per rilevare la funzione cognitiva spaziale e i cambiamenti emotivi dei ratti. La colorazione di Nissl è stata utilizzata per osservare i cambiamenti nella morfologia e nella quantità delle cellule nervose nelarea CAl dell'ippocampo dei ratti. Western blot e R'T - PCR sono stati utilizzati per rilevare i livelli di espressione della sinaptofisina (SY'N), sostanza densa della membrana postsinaptica 95 (PSD -95) efattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF). 

Risultati;I risultati del labirinto d'acqua di Morris hanno mostrato che, rispetto al gruppo di controllo, ilcapacità di apprendimento e cognitive dei rattinel gruppo Modello era significativamente diminuito (P<0. 05 ), and the learning and memory function of rats wastrattamento migliorato dei GC ( P <0. 05). The results of the open field test showed that compared with the Control group, the movement distance and standing times of the Model group were significantly increased ( P <0. 05 ), the resting time was significantly shortened( P <0.05 ), and the anxiety was increased, while after GCs treatment, the movement distance and standing times decreased ( P <0. 05 ), the resting time increased ( P <0. 05), and the anxiety was improved. The results of Western blot and R'T - PCR showed that the livelli di espressione proteica e genica del BDNF, SYN e PSD -95nel gruppo Mlodel erano significativamente diminuiti (P<0. 05 ), while after treatment with GCs, the expression levels ofBDNF, SYN and PSD -95 were significantly up-regulated ( P <0.05). Conclusion: Glycosides of cistanche may af. feet synaptic plasticity by regulating the expression of synaptic-related markers, thereby improving the learning and cognitive function of sleep deprivation model rats.

INTEGRATORI FORMULATI A BASE DI ERBE CISTANCHE PERMIGLIORARE L'APPRENDIMENTO E LA FUNZIONE COGNITIVA

PAROLE CHIAVEGlicosidi delle cisanche; Ippocampo; Privazione del sonno; Apprendimento e memoria; Ansia; Plasticità sinaptica

Disturbo del sonno (DS)è undisturbo funzionale del sonno anormalecausato da una serie di fattori complessi comeinsonnia, sognanza, Erisveglio facile. Negli ultimi anni,l’incidenza della SDè andato gradualmente aumentando. Studi correlati hanno riportato che la SD può causaremalattie cardiovascolari,disfunzione metabolica,malattie immunitarie, Esistema nervoso centralemalattie degenerative come il morbo di Alzheimer [1]. La SD può causare danni ossidativi ai neuroni dell’ippocampo, causare disfunzioni cognitive e produrre cambiamenti dell’umore come ansia e depressione [2]. La Cistanche deserticola è un prezioso materiale medicinale che in Cina può essere utilizzato sia come medicinale che come alimento. Ha l'effetto di tonificare i reni e ricostituire il qi, inumidire l'intestino favorendo i movimenti intestinali e rafforzare lo yang. L'estratto principale di Cistanche deserticola, i glicosidi della cistanche (GC), ha effetti antiossidanti, anti-apoptotici, epatoprotettivi e neuroprotettivi [3]. La nostra precedente ricerca ha scoperto che i GC possono migliorare l’apprendimento e la funzione cognitiva dei topi SAMP8 svolgendo un ruolo antiossidante e anti-apoptotico [4].

Studi correlati hanno dimostrato che la disfunzione cognitiva causata dalla SD è strettamente correlata alla plasticità sinaptica [5]. Tuttavia, ci sono pochi rapporti sul meccanismo attraverso il quale i GC regolano la plasticità sinaptica e migliorano l’apprendimento, il deterioramento della memoria e il declino cognitivo nei ratti indotti dalla privazione del sonno. Pertanto, questo studio mira a esplorare se i GC influenzano la plasticità sinaptica regolando l'espressione di marcatori correlati alle sinapsi, migliorando così l'apprendimento e la funzione cognitiva dei ratti con modelli di privazione del sonno e fornire nuove idee e piani di trattamento per i GC per trattare l'apprendimento e le funzioni cognitive. compromissione causata da disturbi del sonno.

1 Materiali e metodi

1.1 Animali da esperimento

Ratti Wistar maschi di età compresa tra 6 e 8 settimane, di peso compreso tra 280 e 300 g, sono stati acquistati da Pechino Sibeifu, con una licenza di produzione animale [SCXK (Beijing) 2019-0010]. Tutti gli animali sono stati tenuti nel Centro esperimenti sugli animali del Baotou Medical College alle seguenti condizioni: temperatura (24 ± 1) gradi, umidità dal 50% al 55%, 12 ore di luce e 12 ore di buio e nessuna restrizione su cibo e acqua. Questo esperimento è stato approvato dal comitato etico della scuola [Baoyi Lunshen 2022 No. (63)].

1.2 Principali reagenti e strumenti

I glicosidi totali di Cistanche deserticola sono stati acquistati da Chengdu Xiyu Cistanche Biotechnology Co., Ltd. (numero di lotto: KSM20220609011); Le compresse di Estazolam sono state acquistate dal CSPC Pharmaceutical Group Ouyi Pharmaceutical (numero di lotto: 044220343); tampone di caricamento proteico (P1015), tampone di lisi RIPA (R0010), soluzione chemiluminescente (PE0010), ecc. sono stati tutti acquistati da Pechino Solebao; la sostanza della densità postsinaptica nell'anticorpo 95 (PSD-95) (AB192757) e l'anticorpo sinaptofisina (SYN) (ab32127) sono stati acquistati da Abcam, USA Company; il fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF) (48503-2) e l'actina (52901) sono stati acquistati dalla SAB Company, USA; l'anticorpo secondario IgG anti-coniglio di capra (SA00001-20) è stato acquistato dalla Proteintech Company, USA; la melatonina di ratto (MT) e il kit di ricerca scientifica ELISA (MM-0657R1) sono stati acquistati da Jiangsu Enzyme Immunoassay Industry Co., Ltd. Paraffin slicer (Leica, Germania); microscopio ottico (Leica, Germania);

Labirinto d'acqua Morris, scatola di prova in campo aperto (Shanghai Xinruan); apparecchio per elettroforesi verticale (Beijing Liuyi Company); agitatore per decolorazione (Beijing Liuyi Company); sistema di analisi di imaging delle proteine ​​(Shanghai Tanon Technology); strumento PCR quantitativo a fluorescenza (Xi'an Tianlong Technology Co., Ltd.).

1.3 Metodi sperimentali

1.3.1 Raggruppamento degli animali e somministrazione dei farmaci

50 ratti Wistar maschi sono stati divisi casualmente in gruppo di controllo vuoto (gruppo di controllo), gruppo di controllo della piattaforma (controllo della piattaforma, gruppo PC), gruppo modello (gruppo modello), gruppo glicosidi totali di Cistanche deserticola (gruppo GC) , 50 mg/kg) e il gruppo estazolina (gruppo Est, 0,54 mg/kg), con 10 ratti in ciascun gruppo. Al gruppo di controllo e al gruppo PC è stata somministrata soluzione salina allo 0,9% tramite sonda gastrica. Tutti i gruppi sono stati sottoposti a sonda gastrica ogni giorno alle 7 del mattino dopo l'inizio della modellazione e la sonda gastrica è durata 21 giorni.

1.3. 2. Preparazione del modello animale di privazione del sonno

Il modello di privazione del sonno è stato stabilito utilizzando il metodo dell’ambiente acquatico multipiattaforma modificato [6]. L'attrezzatura sperimentale era un serbatoio rettangolare per l'acqua in resina di polietilene di 130 cm × 50 cm × 45 cm. Nel serbatoio dell'acqua è stata posizionata una piccola piattaforma con un diametro di 5 cm e un'altezza di 20 cm. La piattaforma del gruppo PC aveva un diametro di 10 cm e un'altezza di 20 cm. Il serbatoio dell'acqua è stato riempito con acqua fino a una profondità di circa 18 cm e la temperatura dell'acqua è stata mantenuta a (20 ± 1) gradi. Una settimana prima dell’inizio dell’esperimento, i ratti sono stati posti ogni giorno per 60 minuti nella scatola di privazione del sonno per familiarizzare con l’ambiente. Dopo aver stabilito il modello, ad eccezione del gruppo di controllo, i ratti di ciascun gruppo sono stati posti sulla piccola piattaforma in orario dalle 8:00 alle 20:00 ogni giorno per la privazione del sonno per 21 giorni consecutivi.

Tutti i ratti avevano libero accesso al cibo e all’acqua e si muovevano liberamente sulla piattaforma. Il ciclo di luce e buio era di 12 ore ogni giorno.

1. 3. 3 Esperimento del labirinto acquatico di Morris

Il labirinto acquatico di Morris è stato diviso in 4 aree, riempite d'acqua, e la piattaforma è stata posizionata nel 4° quadrante. La superficie dell'acqua era a circa 2 cm sopra la piattaforma. All'acqua è stata aggiunta melanina commestibile per uso alimentare e la temperatura dell'acqua è stata mantenuta a (25 ± 1) gradi. (1) Esperimento di navigazione di posizionamento: è stato selezionato il centro di ciascuna area e i ratti sono stati posizionati delicatamente nell'acqua. Gli è stato permesso di esplorare liberamente. È stato registrato il tempo impiegato dai ratti per trovare la piattaforma target entro 60 secondi. I ratti che non trovavano la piattaforma venivano guidati verso la piattaforma e rimanevano per 20 secondi. La formazione è continuata per 5 giorni. (2) Test di esplorazione spaziale: il 6° giorno, la piattaforma è stata rimossa e i ratti sono stati posti nell'acqua dal centro del 2° quadrante contro il muro. Sono stati registrati il ​​numero di volte in cui i ratti hanno superato la piattaforma entro 120 s e il tempo in cui sono rimasti nel 4° quadrante.

1. 3. 4 Esperimento in campo aperto

È stata utilizzata una scatola sperimentale di 100 cm × 100 cm × 50 cm e il fondo della scatola è stato diviso in 9 griglie. Ciascun gruppo di ratti è stato preventivamente collocato nella sala sperimentale in campo aperto per adattarsi all'ambiente interno per 60 minuti. All'inizio dell'esperimento, i ratti di prova sono stati posti a turno negli angoli fissi della scatola sperimentale in campo aperto e il numero di tempi di permanenza in piedi, la distanza di movimento e il tempo statico dei ratti entro 5 minuti sono stati registrati utilizzando un software di analisi comportamentale. L'ambiente doveva essere silenzioso durante l'esperimento e il dispositivo sperimentale veniva pulito rispettivamente con acqua e alcol tra due esperimenti per evitare che l'odore del primo ratto influenzasse il giudizio comportamentale del ratto successivo.

1. 3. 5 Saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA)

Rilevazione dei livelli sierici di MT nei ratti I ratti sono stati anestetizzati mediante iniezione intraperitoneale e 5 ml di sangue sono stati raccolti dall'aorta addominale. Dopo aver atteso 30 minuti a temperatura ambiente, il sangue è stato centrifugato per ottenere il siero. A ciascun pozzetto sono stati aggiunti 40 μL di diluente del campione, quindi sono stati aggiunti 10 μL del campione da testare. Dopo aver sigillato con una pellicola sigillante, la piastra è stata incubata a 37 gradi per 30 minuti. Lavata 5 volte, sono stati aggiunti 50 μL di soluzione di marcatura enzimatica e la piastra è stata sigillata con una pellicola sigillante e incubata a 37 gradi per 30 minuti. Lavato 5 volte, quindi sono state aggiunte in successione la soluzione di sviluppo del colore e la soluzione di terminazione della reazione. Il valore OD di ciascun pozzetto è stato misurato mediante un etichettatore enzimatico ad una lunghezza d'onda di 450 nm.

1. 3. 6 Colorazione di Nissl

Tre ratti sono stati selezionati da ciascun gruppo e il tessuto cerebrale è stato rimosso mediante decapitazione e fissato con una soluzione di poliossietilene al 4%. Il tessuto è stato disidratato, immerso in una soluzione di cera, incorporato e tagliato con metodi convenzionali. Le fette sono state mantenute con uno spessore di 5 μm, risciacquate con PBS, colorate con 0,1% blu di toluidina per 0,5 h, differenziate con alcol al 95%, disidratate con alcol al 100%, trasparentizzate con xilene e sigillato con gomma neutra. I cambiamenti nella morfologia e nel numero di neuroni nella regione CA1 dell'ippocampo di ratto sono stati osservati al microscopio e sono state raccolte le immagini.

1. 3. 7 Esperimento Western blot

Sono stati selezionati quattro ratti da ciascun gruppo e l'ippocampo è stato isolato mediante decapitazione. Il tessuto dell'ippocampo è stato miscelato con il tampone di lisi RIP A in un ambiente con bagno di ghiaccio e il tessuto è stato centrifugato per ottenere il surnatante. La concentrazione proteica è stata rilevata con il metodo BCA. 20 ug di proteine ​​sono stati aggiunti con tampone di caricamento proteico per l'elettroforesi. Una volta completata l'elettroforesi proteica, la membrana è stata trasferita a un flusso costante di 300 mA, bloccata con latte scremato in polvere al 5%, l'anticorpo primario è stato incubato a 4 gradi durante la notte e l'anticorpo secondario è stato incubato a temperatura ambiente per 2 ore. Dopo che è stata utilizzata la soluzione di sviluppo del colore, le bande proteiche sono state analizzate statisticamente utilizzando un sistema di analisi di imaging in chemiluminescenza.

1. 3. 8 Esperimento RT-PCR

Tre ratti sono stati selezionati da ciascun gruppo per preparare l'omogenato del tessuto ippocampale. L'RNA totale nel fluido tissutale è stato estratto con il metodo Trizol e la concentrazione è stata misurata. Per la trascrizione inversa è stato utilizzato un kit di sintesi del cDNA fastking ed è stata eseguita una reazione di amplificazione quantitativa della fluorescenza utilizzando un kit quantitativo della fluorescenza per rilevare il livello di espressione relativo dell'mRNA proteico correlato alla sinaptica. I risultati sono stati analizzati utilizzando 2-ΔΔCt. Le sequenze di primer sono mostrate nella Tabella 1.

Tabella 1 Sequenze di primer RT-PCR

1.4 Metodi statistici

I risultati dei dati conformi alla distribuzione normale sono stati espressi come media ± deviazione standard (x ± s) e l'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il software GraphPad Prism 9.5. L'analisi della varianza unidirezionale è stata utilizzata per il confronto tra più campioni e P < 0.05 ha indicato che la differenza era statisticamente significativa.