L'assorbimento enterale del citrato ferrico dipende dalla ferroportina, proteina di trasporto del ferro

Astratto

Il citrato ferrico è approvato come prodotto sostitutivo del ferro nei pazienti con malattia renale cronica non dialitica e anemia da carenza di ferro. Il ferro fornito dal citrato ferrico viene assorbito per via enterale, ma i meccanismi specifici coinvolti non sono stati valutati, comprese le possibilità di assorbimento transcellulare mediato da ferroportina convenzionale e/o assorbimento paracellulare mediato da citrato. Qui, dimostriamo prima l'efficacia del citrato ferrico in modelli ad alta epcidina, inclusi i topi knockout Tmprss6 (caratterizzati da anemia da carenza di ferro refrattaria al ferro) con e senza malattia renale cronica indotta dalla dieta adenina. Successivamente, per valutare se l'assorbimento del citrato ferrico enterale dipende o meno dalla ferroportina, abbiamo valutato gli effetti del citrato ferrico in un modello murino knockout ferroportina specifico per enterociti e tamoxifene (Villin-Cre-ERT2, Fpn flox/flox). In questo modello, la delezione della ferroportina è risultata efficiente, poiché l'iniezione di tamoxifene ha indotto una diminuzione di 4000- volte nell'espressione dell'mRNA della ferroportina nel duodeno, con proteina ferroportina non rilevabile su un Western blot di enterociti duodenali, con conseguente grave fenotipo di anemia da carenza di ferro. Nei topi con carenza di ferroportina, tre settimane di integrazione alimentare di citrato ferrico all'1%, una dose che ha prevenuto la carenza di ferro nei topi di controllo, non ha migliorato lo stato del ferro né salvato il fenotipo dell'anemia da carenza di ferro. Abbiamo ripetuto l'esperimento condizionale di knockout della ferroportina nel contesto dell'uremia, utilizzando un modello di nefropatia da adenina, in cui tre settimane di integrazione alimentare di citrato ferrico all'1% non sono riuscite ancora una volta a migliorare lo stato del ferro o salvare il fenotipo dell'anemia da carenza di ferro. Pertanto, i nostri dati suggeriscono che l'assorbimento del citrato ferrico enterale dipende dal trasporto convenzionale del ferro degli enterociti da parte della ferroportina e che, in questi modelli, non si verifica un assorbimento paracellulare significativo.

Parole chiave

citrato ferrico; ferroportina; epcidina; ferro; anemia; malattia renale cronica.

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introduzione

Auryxia (citrato ferrico [FC]; Akebia Therapeutics, Inc., Cambridge, MA) è un nuovo composto approvato per l'uso clinico come legante del fosfato enterale nei pazienti adulti con malattia renale cronica (CKD) in dialisi. In studi randomizzati, controllati con placebo, condotti in pazienti con CKD non dialisi-dipendenti, FC ha ridotto significativamente le concentrazioni sieriche di fosfato.1,2 In studi randomizzati, con controllo attivo condotti su pazienti con CKD dialisi-dipendenti, FC ha prodotto riduzioni simili nelle concentrazioni sieriche di fosfato .3,4

Auryxia è anche approvato negli Stati Uniti per l'uso clinico come prodotto sostitutivo del ferro nei pazienti con CKD non dializzati con anemia da carenza di ferro. Nei 4 studi randomizzati controllati summenzionati, condotti sia in coorti con CKD non dialisi-dipendente che dialisi-dipendente, FC ha aumentato significativamente la saturazione della transferrina sierica (TSAT).1-4 Pertanto, FC può funzionare sia come efficace legante del fosfato enterico sia come fonte di ferro enterale.

Sorprendentemente, la FC corregge una carenza di ferro nel contesto della CKD e persino della malattia renale allo stadio terminale, in quanto si tratta di stati con livelli elevati di epcidina. noto esportatore cellulare di ferro.9 Nel contesto di livelli elevati di epcidina, l'attività della ferroportina, situata sulla superficie basale degli enterociti, è ridotta, inibendo così l'assorbimento alimentare e medicinale del ferro dal lume gastrointestinale 10.

Non sono chiari i meccanismi con cui la FC supera il blocco enterale del ferro indotto da alti livelli di epcidina e bassi livelli di ferroportina. Un'ipotesi è che la frazione citrato nella FC chela gli ioni calcio, portando alla rottura delle giunzioni strette intercellulari degli enterociti, consentendo l'assorbimento del ferro paracellulare che è indipendente dalla via epcidina-ferroportina. Un punto interessante da notare è che è stato osservato che i composti del citrato facilitano l'assorbimento enterale paracellulare dell'alluminio,11,12 aumentando la possibilità che l'assorbimento del ferro sia potenziato dallo stesso meccanismo. Per valutare se l'assorbimento del ferro enterale associato alla FC avvenga attraverso una via transcellulare, ferroportina-dipendente, rispetto a una via paracellulare, ferroportina-indipendente, abbiamo valutato l'assorbimento enterale della FC in modelli murini, con o senza CKD, con bassa o assente attività della ferroportina degli enterociti.

Supplemento cistanche

METODI

1. Esperimenti sui topi

Gli esperimenti sono stati condotti dalle linee guida della Division of Laboratory Animal Medicine dell'Università della California, Los Angeles (UCLA) e i protocolli di studio sono stati approvati dall'Office of Animal Research Oversight dell'UCLA. I topi sono stati alloggiati all'UCLA, in gabbie standard con lettiera di trucioli di legno che veniva cambiata due volte alla settimana. Le stanze di stabulazione degli animali erano a temperatura e umidità controllate, con un ciclo di luce di 12-ore. Abbiamo valutato per la prima volta gli effetti della FC nei topi knockout transmembrana della serina proteasi 6 (Tmprss6), un modello caratterizzato da alti livelli di epcidina, bassa attività di ferroportina e risultante anemia da carenza di ferro refrattaria al ferro,13 sia senza che con l'aggiunta di dieta adenina -indotta da CKD, che aumenta ulteriormente i livelli di epcidina.14 Per inibire completamente l'attività della ferroportina enterale, abbiamo successivamente valutato gli effetti della FC in un modello knockout di ferroportina (FPN) inducibile da tamoxifene (Villin-Cre-ERT2, Fpnflox/flox). Infine, abbiamo valutato gli effetti della FC in un modello Villin-Cre-ERT2, Fpnflox/flox con CKD indotta dalla dieta con adenina.

2. Topi knockout Tmprss6

I topi knockout per Tmprss6 su un background genetico C57BL/6 sono stati gentilmente forniti dal Dr. Jodie Babitt (Massachusetts General Hospital). Per prima cosa abbiamo valutato gli effetti della FC nei topi knockout Tmprss6 e nei compagni di cucciolata wild-type (WT) senza CKD. I topi di età compresa tra 4 e 7 settimane sono stati alimentati con 50 ppm di diete di ferro senza adenina (Envigo, Hackensack, NJ), con o senza 0,1% di FC (Akebia Therapeutics, Inc.), per 3 settimane , e poi sono stati soppressi. Successivamente abbiamo valutato gli effetti della FC nei topi knockout Tmprss6 e nei compagni di cucciolata WT con CKD. Topi di età compresa tra 8 e 12 settimane sono stati alimentati con diete a 50 ppm di ferro con 0,2% di adenina (Envigo) per indurre CKD,15-17 per 6 settimane. Nelle ultime 3 settimane delle diete, 0,1 percento FC (Akebia Therapeutics, Inc.) è stato aggiunto per un gruppo e non aggiunto per un altro. Questa dose di FC nei topi corrisponde a una tipica dose di FC nell'uomo adulto; in un essere umano adulto, 2 compresse di Auryxia assunte tre volte al giorno (6000 mg FC) contengono una dose giornaliera cumulativa di ferro ferrico di 1260 mg, una quantità equivalente a circa un terzo del ferro corporeo totale. Nei topi, circa un terzo del ferro corporeo totale è equivalente a ~0,8 mg di ferro ferrico al giorno, o ~4 mg di FC al giorno che, dato il consumo giornaliero di cibo murino di ~4 g, corrisponde a cibo contenente lo 0,1% di FC. In questi esperimenti, ogni gruppo conteneva circa metà maschi e metà femmine. Dopo il sacrificio, abbiamo raccolto sangue intero, siero, fegato e enterociti duodenali. Per isolare gli enterociti duodenali, la sezione prossimale del duodeno (~ 2 cm) è stata tagliata longitudinalmente e trasferita in una soluzione ghiacciata di acido etilendiammina tetraacetico. La soluzione è stata vorticata per facilitare il distacco delle cellule e le cellule disperse sono state raccolte mediante filtrazione.

3. Topi knockout ferroportina specifici per enterociti non-CKD

I topi knockout ferroportina (FPN) specifici per enterociti e inducibili da tamoxifene sono stati generati incrociando topi Villin-Cre-ERT2 con topi Fpnflox/flox, entrambi con background genetico C57BL/6. I topi Villin-Cre-ERT2 sono stati gentilmente forniti dal Dr. Peter Tontonoz (UCLA). Per caratterizzare questo modello, abbiamo valutato topi Fpnflox/flox, con o senza VillinCre-ERT2, con o senza induzione di tamoxifene (0.075 mg/g di peso corporeo, iniettati ip una volta al giorno per 4 consecutivi giorni; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Per valutare gli effetti della FC in questo modello, abbiamo utilizzato topi Villin-Cre-ERT2, Fpnflox/flox di età compresa tra 6 e 8 settimane che sono stati iniettati ip con veicolo di olio di girasole (gruppo non indotto) o tamoxifene (0,075 mg/g di peso corporeo; gruppo indotto) una volta al giorno per 4 giorni consecutivi. I topi sono stati mantenuti con diete a 50 ppm di ferro (Envigo) e poi sono stati soppressi 7 settimane dopo l'iniezione. Ad alcuni dei topi indotti dal tamoxifene è stato aggiunto l'1% di FC alla loro dieta per le 3 settimane immediatamente prima del sacrificio. In questi esperimenti, è stato scelto l'1% di FC, una dose sovrafisiologica, per non perdere un effetto secondario a un dosaggio insufficiente di FC. Per dimostrare l'efficacia di questa dose, abbiamo eseguito un esperimento di controllo positivo separato in cui abbiamo valutato se 3 settimane di integrazione alimentare con FC all'1% possono salvare il fenotipo dell'anemia da carenza di ferro nei topi Villin-Cre-ERT2, Fpnflox/flox non indotti alimentati con un dieta a basso contenuto di ferro (4 ppm) (Envigo). Negli esperimenti di knockout della ferroportina specifici per gli enterociti non-CKD, ciascun gruppo conteneva sia maschi che femmine. Dopo il sacrificio, abbiamo raccolto sangue intero, siero, fegato, enterociti duodenali e tutto il duodeno per la colorazione del ferro. Gli enterociti duodenali sono stati isolati come descritto sopra. Per la colorazione del ferro duodenale, i campioni duodenali prossimali sono stati fissati in formalina, quindi incorporati in blocchi di paraffina da cui sono stati creati i vetrini. Le sezioni deparaffinate sono state colorate con il colorante blu di Prussia Perls per ferro non eme e controcolorate con rosso nucleare veloce. Il grado di colorazione del ferro degli enterociti duodenali è stato valutato su una scala semiquantitativa da un revisore in cieco (SN).

4. Topi knockout ferroportina specifici per enterociti CKD

Per ripetere l'esperimento di cui sopra nel contesto della CKD, i topi maschi Villin-Cre-ERT2, Fpnflox/flox di 6 settimane di età sono stati avviati con 0,2% di diete di adenina (Envigo) per indurre la CKD. Date le differenze di genere nel modello di CKD dei roditori indotto dalla dieta con adenina (le femmine sono più resistenti agli effetti dell'adenina alimentare),18 sono stati utilizzati solo topi maschi. All'età di 8 settimane, i topi sono stati iniettati ip, come descritto sopra, con veicolo di olio di girasole o tamoxifene. All'età di 12 settimane, dopo 6 settimane di dieta con adenina, i topi sono passati a diete standard, non adenina, 50 ppm di ferro con o senza aggiunta dell'1% di FC. I topi sono stati sacrificati all'età di 15 settimane, 7 settimane dopo l'iniezione e dopo 3 settimane di trattamento con o senza FC. Il sangue intero, per la misurazione dell'emoglobina e dei globuli rossi, è stato raccolto quando i topi avevano un'età di 8 settimane (al momento dell'iniezione), 12 settimane (all'inizio di diete con o senza FC) e 15 settimane (al sacrificio). Il siero, per la misurazione dell'azoto ureico e del ferro, è stato raccolto quando i topi avevano un'età compresa tra 12 e 15 settimane. Gli enterociti epatici e duodenali sono stati raccolti, come descritto sopra, al sacrificio.

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5. Analisi del sangue

La conta ematica completa è stata misurata dal processore automatizzato Hemavet 950 (Drew Scientific, Oxford, CT). Sono stati utilizzati metodi colorimetrici per saggiare l'azoto ureico sierico (BioAssay Systems, Hayward, CA) e il ferro sierico (Genzyme, Cambridge, MA). Per misurare i livelli sierici di epcidina, come precedentemente descritto, sono stati utilizzati test ELISA (enzyme-linked immunosorbent test) interni.19 Per misurare l'eritropoietina sierica è stato utilizzato un kit ELISA disponibile in commercio (R&D Systems, Minneapolis, MN).

6. Concentrazioni quantitative di ferro epatico

I fegati raccolti sono stati congelati a scatto in azoto liquido e conservati a -80 gradi. Piccoli pezzi di fegato (~ 100 mg) sono stati pesati e omogeneizzati. È stata aggiunta una soluzione di precipitazione proteica (HCl 0,53 N e acido tricloroacetico al 5,3% in acqua bidistillata) e i campioni sono stati bolliti e centrifugati. Le concentrazioni di ferro nei supernatanti sono state misurate mediante un test colorimetrico (Genzyme), quindi normalizzate ai pesi dei campioni originali per produrre concentrazioni di ferro nei tessuti.

7. Reazione quantitativa a catena della polimerasi in tempo reale (PCR)

Gli enterociti duodenali sono stati omogeneizzati in Trizol (Invitrogen, Waltham, MA) e l'RNA è stato isolato secondo il protocollo del produttore. Abbiamo eseguito la trascrizione inversa quantitativa (RT)-PCR utilizzando il kit iScript RT-PCR (Bio-Rad, Hercules, CA) e primer specifici per il mouse Fpn (forward: 5'-ATGGGAACTGTGGCCTTTCAC-3'; reverse: 5' -TCCAGGCATGAATACGGAGA-3'). Abbiamo utilizzato le seguenti condizioni PCR: denaturazione iniziale a 95 gradi per 2 minuti, seguita da 40 cicli di denaturazione a 94 gradi per 30 secondi, ricottura a 58 gradi per 30 secondi, estensione a 72 gradi per 1 minuto ed estensione finale a 72 gradi grado per 10 minuti. L'espressione genica è stata normalizzata a quella dell'ipoxantina-guanina fosforibosiltransferasi (Hprt) (avanti: 5'-CTGGTTAAGCAGTACAGCCCCAA-3'; retro: 5'-CAGGAGGTCCTTTTCACCAGC-3') e ciascun campione di RNA è stato analizzato in duplicato . L'espressione genica della piega relativa è stata calcolata utilizzando il metodo delta-delta Ct.

8. Macchiante occidentale

Per il rilevamento della proteina ferritina su Western blot, l'anticorpo primario utilizzato era FTH1 di coniglio anti-topo (D1D4; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), a una concentrazione di 1:10,000, e l'anticorpo secondario utilizzato era IgG (Cell Signaling Technology) di capra anti-coniglio, a una concentrazione di 1:5000. Per il rilevamento della ferroportina su Western blot, l'anticorpo primario utilizzato era FPN anti-topo di ratto (1C7; Amgen, Thousand Oaks, CA), a una concentrazione di 1:3300, e l'anticorpo secondario utilizzato era IgG anti-ratto di coniglio (ab102213; Abcam, Cambridge, MA), ad una concentrazione di 1:5000. Per il controllo del caricamento della proteina di actina, è stato utilizzato l'anticorpo anti-actina di topo (A3854; Sigma-Aldrich), a una concentrazione di 1:50.000. È stato rilevato un segnale chemiluminescente utilizzando il sistema ChemiDoc XRS plus con il software Image Lab (Bio-Rad).

9. Analisi statistica

La creazione della figura e l'analisi statistica sono state eseguite utilizzando Graph-Pad Prism 9.2.0 (San Diego, CA). I dati sui topi sono presentati come medie ± DS e i test t sono stati utilizzati per confrontare le medie di gruppo. Per i dati non distribuiti normalmente, la trasformazione logaritmica è stata applicata prima dell'analisi statistica. I valori P < 0.05 sono stati considerati statisticamente significativi.

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DISCUSSIONE

Negli studi clinici, FC ha dimostrato di correggere la carenza di ferro nei pazienti con CKD e malattia renale allo stadio terminale, che sono stati con livelli elevati di epcidina.5-8 Nel contesto di elevate concentrazioni di epcidina circolante, l'attività della ferroportina enterale è ridotta, generando un blocco mucosale mediato dall'epcidina all'assorbimento enterale del ferro.9 I meccanismi con cui FC può superare questo blocco di assorbimento enterale sono sconosciuti. Un'ipotesi è che la porzione di citrato allenti le giunzioni strette intercellulari, facilitando l'assorbimento del ferro enterale paracellulare, ferroportina-indipendente. Abbiamo testato questa ipotesi valutando l'efficacia della FC in modelli ad alto contenuto di epcidina/basso contenuto di ferroportina, con e senza CKD, in cui la via transcellulare di assorbimento del ferro è quasi ablata o completamente bloccata.

Nel nostro primo modello, topi knockout per Tmprss6 senza CKD, in cui i livelli di epcidina sono leggermente elevati, FC ha migliorato lo stato del ferro e aumentato le concentrazioni di emoglobina. Allo stesso modo, nei nostri modelli knockout WT e Tmprss6 con CKD, in cui i livelli di epcidina sono marcatamente elevati, la FC ha aumentato la conta dei globuli rossi e l'emoglobina. Questi dati dimostrano l'efficacia della FC negli stati con alti livelli di epcidina e sono coerenti con quanto osservato negli studi clinici sulla FC; tuttavia, questi modelli non suggeriscono quali siano i meccanismi attraverso i quali la FC supera il blocco dell'epcidina della mucosa.

In questi modelli, in cui la ferroportina rimane intatta, la FC può essere assorbita attraverso una via paracellulare, bypassando l'asse epcidina-ferroportina, o può essere assorbita attraverso una via transcellulare, utilizzando la ferroportina. Per valutare la dipendenza della FC dalla ferroportina enterale, abbiamo utilizzato un modello murino knockout di ferroportina specifico per gli enterociti. Questo modello è altamente efficace nell'esaurimento quasi completo della proteina ferroportina degli enterociti, con conseguente drastica riduzione dell'assorbimento di ferro enterale e grave anemia da carenza di ferro, un fenotipo che può essere salvato dalla somministrazione parenterale di ferro.26 In questo modello, qualsiasi bypass sostanziale della ferroportina canonica percorso dipendente sarebbe facilmente rilevabile.

Nel nostro modello non CKD, in assenza di ferroportina degli enterociti, una dose di FC che era stata efficace nei topi WT non ha migliorato lo stato del ferro o salvato il fenotipo dell'anemia da carenza di ferro. Piccoli aumenti della conta dei globuli rossi e dell'emoglobina non erano statisticamente significativi, suggerendo che l'assorbimento enterale della FC dipende prevalentemente dalla ferroportina e argomentando contro un ampio assorbimento paracellulare. Nel contesto della malattia renale cronica, i fattori associati all'uremia potrebbero potenzialmente aumentare la permeabilità intestinale,24 eventualmente allentando le giunzioni strette intercellulari e facilitando un certo grado di assorbimento paracellulare delle FC. Tuttavia, nel nostro modello CKD, FC ha migliorato significativamente lo stato del ferro in presenza di ferroportina degli enterociti, ma non in sua assenza. Questi dati suggeriscono che anche nel contesto della CKD, l'assorbimento enterale di FC è prevalentemente mediato dal trasporto della ferroportina e non da possibili vie paracellulari. Nei topi CKD non indotti, il trattamento con FC ha aumentato la proteina ferroportina del duodeno, nonostante l'espressione dell'mRNA della ferroportina nel duodeno inferiore, in linea con un meccanismo stabilito mediante il quale l'accumulo di ferro intracellulare innesca la de-repressione mediata dall'IRP della traduzione della ferroportina,21-23 facilitando così l'assorbimento cellulare del ferro e consegna alla circolazione.

Abbiamo eseguito 2 esperimenti CKD. Le concentrazioni medie terminali di azoto ureico sierico ed emoglobina erano simili tra il gruppo di controllo della dieta WT CKD del primo esperimento e il gruppo CKD non indotto e non trattato del secondo esperimento. Tuttavia, nel primo esperimento CKD, i topi WT trattati con FC avevano un aumento significativo dell'emoglobina, ma nel secondo esperimento CKD, i topi non indotti trattati con FC non avevano un aumento significativo dell'emoglobina. La ragione per cui la FC non ha aumentato significativamente l'emoglobina nei topi non indotti, nonostante il netto miglioramento dello stato del ferro, non è chiara; tuttavia, i possibili fattori che contribuiscono includono l'eziologia multifattoriale dell'anemia CKD, le piccole dimensioni del campione di topi non indotti e la flebotomia ripetuta in questo esperimento. Un'ulteriore limitazione dello studio è che abbiamo utilizzato modelli murini la cui traducibilità per l'uomo non è certa. Inoltre, sebbene solida, l'evidenza della mancanza di un significativo assorbimento paracellulare di FC è indiretta.

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In sintesi, nei nostri modelli ad alto livello di epcidina, abbiamo osservato effetti benefici della FC sui parametri del ferro e degli eritrociti, suggerendo un efficace assorbimento del ferro enterale nonostante alti livelli di epcidina. Per valutare se la FC può bypassare il blocco dell'epcidina della mucosa attraverso il potenziale assorbimento paracellulare facilitato dal citrato, abbiamo valutato un modello di knockout della ferroportina specifico per gli enterociti, in presenza o in assenza di funzionalità renale compromessa. In questi modelli, FC non ha salvato il fenotipo dell'anemia da carenza di ferro, dimostrando che l'assorbimento enterale di FC è prevalentemente dipendente dalla ferroportina e suggerendo che le vie paracellulari probabilmente non costituiscono le principali vie di assorbimento fisiologico di FC.

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Mark R. Hanudel1, Brian Czaya2, Shirley Wong2, Maxime Rappaport1, Shweta Namjoshi1, Kristine Chua2, Grace Jung2, Victoria Gabayan2, Bo Qiao2, Elizabeta Nemeth2, Tomas Ganz2

1. Dipartimento di Pediatria, David Geffen School of Medicine dell'UCLA, Los Angeles, California, USA

2. Dipartimento di Medicina, David Geffen School of Medicine dell'UCLA, Los Angeles, California, USA