Valutazione e confronto di quattro test sierologici quantitativi SARS-CoV-2 in pazienti affetti da COVID-19 e individui sani immunizzati, pazienti affetti da cancro e pazienti sottoposti a terapia immunosoppressiva

ASTRATTO

Sfondo: I test immunologici semiquantitativi e quantitativi sono la metodologia più comunemente utilizzata per valutare l'immunità post-immunizzazione.

Obiettivi: Confrontare quattro test sierologici quantitativi per SARS-CoV-2 in pazienti affetti da COVID-19 e individui sani immunizzati, pazienti affetti da cancro e pazienti con terapia immunosoppressiva.

Progettazione dello studio: 210 campioni sierologici provenienti da coorti di infezione e vaccinazione COVID-19 sono stati utilizzati per creare un archivio di campioni sierologici. I metodi sierologici di quattro produttori, vale a dire Euroimmun, Roche, Abbott e DiaSorin, sono stati valutati per misurazioni anticorpali quantitative, semiquantitative e qualitative. Tutti e quattro i metodi misurano gli anticorpi IgG contro il dominio di legame del recettore del picco SARS-CoV-2 e riportano i risultati in unità di anticorpi leganti/mL (BAU/mL). È stato scelto un errore totale ammissibile (TEa) di ±25% come criterio per determinare se i due metodi sono clinicamente equivalenti dal punto di vista quantitativo. I risultati semiquantitativi (titoli) sono stati derivati ​​utilizzando la concentrazione numerica di anticorpi divisa per il valore soglia per ciascun metodo. Risultati: tutti i confronti quantitativi accoppiati hanno dimostrato prestazioni inaccettabili. Con ±25% come TEa, la migliore concordanza è stata di 74 (35,2% su 210 campioni) tra Euroimmun e DiaSorin, mentre la concordanza più bassa è stata di 11 (5,2% su 210 campioni) tra Euroimmun e Roche. I titoli anticorpali tra tutti e quattro i metodi erano significativamente diversi (p < 0,001). La differenza di titolo più alta rispetto allo stesso campione è tra Roche e DiaSorin con una differenza di 1392-volte. Nel confronto qualitativo, nessuno dei confronti accoppiati ha mostrato un confronto accettabile (p <0,001).

Conclusioni: Esiste una scarsa correlazione tra i quattro test valutati, quantitativamente, semiquantitativamente e qualitativamente. Per ottenere misurazioni comparabili è necessaria un'ulteriore armonizzazione dei test.

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1. Contesto

Sono trascorsi più di due anni dall'inizio della pandemia globale di infezione da SARS-CoV-2 e sono state somministrate oltre dodici miliardi di dosi di vaccini e oltre 600 milioni di persone sono state infettate da COVID-19 in tutto il mondo [1] . Health Canada (HC) e la Food and Drug Administration (FDA) statunitense hanno approvato diversi vaccini per l'autorizzazione all'uso di emergenza (EUA), come Moderna SpikeVax (mRNA-1273) e Pfizer-BioNTech Comirnaty (BNT162b2) [2, 3]. I coronavirus hanno quattro proteine ​​strutturali: la proteina spike (S), il nucleocapside (N), la proteina dell’involucro (E) e la proteina di membrana (M) [4]. La proteina S, che sporge dall’involucro del virus, è immunodominante ed è costituita da due subunità: la proteina S1, che contiene il dominio di legame del recettore (RBD), e la proteina S2, che media la fusione della membrana cellulare [5]. Sono disponibili piattaforme multiple di test sierologici contro diversi antigeni SARS-CoV-2, come la proteina spike (S) e la proteina nucleocapside (N).

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I test immunologici, ad esempio il test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA), sono la metodologia più comunemente utilizzata per valutare l'immunità dopo l'immunizzazione [6]. Per la maggior parte degli altri vaccini, viene spesso scelto un valore limite universale basato su test immunologici semiquantitativi o quantitativi per rappresentare protezione e immunità [6]. Come dimostrato dal vaccino contro la rosolia, il valore soglia dovrebbe essere continuamente monitorato e adeguato con l’aiuto di ampi studi epidemiologici [7] e può differire da paese a paese [8]. Pertanto, è fondamentale che i risultati delle varie piattaforme analitiche siano comparabili e possano definire adeguatamente l’immunità dopo l’immunizzazione e l’infezione. Il Comitato Nazionale degli Scienziati di Laboratorio Clinico (NCCLS) pubblica periodicamente linee guida affinché i laboratori clinici riportino correttamente i risultati dei test rispetto all’immunità dopo aver raggiunto un elevato livello di concordanza tra le varie piattaforme analitiche [7,9]. Negli individui sani, è noto che le risposte umorali potrebbero aumentare in modo significativo con ulteriori dosi di richiamo della vaccinazione SARS-CoV-2 [10]. Inoltre, la risposta umorale è scarsa dopo l’immunizzazione negli individui immunocompromessi [11]. Di conseguenza, i metodi sierologici approvati per l’uso clinico devono fornire risultati accurati con un ampio intervallo dinamico degli anticorpi, dal livello basso a quello alto.

Tabella 1 Caratteristiche della popolazione in studio.

2. Obiettivi

Confrontare quattro test sierologici quantitativi per SARS-CoV-2 in pazienti con COVID-19 e individui sani immunizzati, pazienti affetti da cancro e pazienti con terapia immunosoppressiva, utilizzando campioni raccolti dalla prima alla quarta dose di vaccinazione. Abbiamo valutato i quattro test sierologici etichettati per uso clinico in un intervallo dinamico (misurabile) esteso.

3. Progettazione dello studio

3.1. Reclutamento, campione e raccolta dati

Sono stati ottenuti l'approvazione del comitato etico istituzionale e il consenso dei partecipanti. Da maggio 2021 a luglio 2022, abbiamo arruolato individui sani, malati di cancro e pazienti in terapia immunosoppressiva dopo aver ricevuto da una a quattro dosi di vaccinazione COVID-19 a Kingston, Ontario, Canada. Sono stati ottenuti anche campioni di siero di pazienti COVID-19 ospedalizzati ricoverati presso il Kingston Health Sciences Center tra febbraio 2021 e aprile 2022. C'erano 210 campioni in totale, inclusi 82 ​​campioni positivi al COVID-19- e 128 campioni di individui immunizzati. Quest'ultimo comprende 42 campioni provenienti da individui sani, 44 da pazienti affetti da cancro e 42 da pazienti con terapia immunosoppressiva (23 da pazienti con trapianto renale e 19 da pazienti in terapia immunosoppressiva). La terapia immunosoppressiva per i pazienti sottoposti a trapianto renale consisteva in una tripla terapia con un inibitore della calcineurina (tacrolimus o ciclosporina), con un agente antiproliferativo (micofenolato, azatioprina, sirolimus o everolimus) e corticosteroidi. I partecipanti immunizzati hanno ricevuto BNT162b2, AZD1222, mRNA-1273 o una miscela di vaccini di più produttori. Su 128 campioni di sangue di partecipanti immunizzati, 35, 70, 22 e 1 sono stati ottenuti rispettivamente dopo la prima, la seconda, la terza e la quarta dose di immunizzazione. Nessun partecipante ha ricevuto il vaccino bivalente. Nei pazienti affetti da COVID-19 ospedalizzati, l'infezione è stata confermata dall'analisi della reazione a catena della polimerasi (PCR)/mutazione genetica eseguita presso il Kingston Health Sciences Center seguendo il protocollo standard. Sia i risultati positivi che quelli negativi della PCR sono stati segnalati al database della sanità pubblica dell'Ontario.

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3.2. Misurazione degli anticorpi quantitativa, semiquantitativa e qualitativa

Sono stati valutati quattro metodi sierologici, tra cui Euroimmun Anti-SARS-CoV-2 QuantiVac ELISA (IgG) (codice prodotto: EI 2606- 9601-10 G), Abbott Architect AdviseDx SARS-CoV-2 IgG II ( codice prodotto: 6S60), Roche Elecsys Anti-SARS-CoV-2 S (codice prodotto: 09289267190) e DiaSorin LIAISON SARS-CoV-2 TrimericS IgG (codice prodotto: 311510). L'analisi di 210 campioni è stata eseguita in tre laboratori clinici accademici da tecnici di laboratorio medico. I test sono stati eseguiti su strumenti di ciascun produttore di test sierologici, vale a dire EUROIMMUN Analyser 1, Abbott ARCHITECT, Roche Cobas e602 e DiaSorin LIAISON. Tutti i risultati sono stati riportati in unità di anticorpi leganti/mL (BAU/mL). Tutti e quattro i metodi misurano gli anticorpi IgG contro il dominio di legame del recettore del picco SARS-CoV-2 (S1). Il titolo anticorpale IgG semiquantitativo contro il dominio di legame del recettore del picco SARS-CoV-2 (S1) è stato derivato dalla misurazione quantitativa degli anticorpi. Il titolo è stato determinato dividendo i livelli quantitativi di anticorpi per i corrispondenti valori di cut-off di ciascun produttore. I titoli anticorpali sono stati arrotondati a un numero intero e quelli superiori a 1 sono stati inclusi nel confronto. I livelli quantitativi di anticorpi per il dominio SARS-CoV-2 S1 sono stati confrontati con il corrispondente valore di cut-off positivo per determinare il risultato del test qualitativo, positivo o negativo. Il test EUROIMMUN ha un intervallo limite (maggiore o uguale a 25,6 to<35.2 BAU/mL); antibody results within the borderline range were excluded from the quantitative comparison. 

3.3. Presentazione dei dati e analisi statistica

La presentazione dei dati e il confronto quantitativo dei metodi sono stati eseguiti utilizzando EP Evaluator 12 (Data Innovations LLC, Stati Uniti). Sulla base dei requisiti normativi comuni per i test immunologici, è stato scelto un errore totale ammissibile (TEa) di ±25% come criterio per determinare se i due metodi sono clinicamente equivalenti. L'analisi dei confronti semiquantitativi e quantitativi è stata eseguita utilizzando SPSS Statistics (IBM SPSS Statistics, Stati Uniti). È stato determinato che tutti i gruppi non erano distribuiti normalmente (p< 0.001, Shapiro-Wilk normality test). The results were reported as medians and interquartile range (IQR). Friedman's and Pearson's Chi-Square tests were used to determine statistical significance between groups.

Tabella 2 Caratteristiche principali dei quattro test immunologici valutati.

Fig. 1. Confronti a coppie di test sierologici quantitativi.

4. Risultati

4.1. Caratteristiche del gruppo di studio

I dati demografici e i livelli quantitativi di anticorpi dei partecipanti allo studio sono riepilogati nella Tabella 1. I dati per la coorte vaccinale sono ulteriormente suddivisi in individui sani, pazienti affetti da cancro e pazienti con terapia immunosoppressiva (IST). Viene mostrato l'intervallo dinamico dei livelli quantitativi di anticorpi IgG contro SARS-CoV-2.

Fig. 2. Confronto a coppie della concordanza dei test sierologici semiquantitativi.

4.2. Caratteristiche dei metodi di test sierologici

Le caratteristiche principali dei quattro metodi di analisi sierologica per le IgG contro la proteina SARS-CoV-2 S1 sono riepilogate nella Tabella 2. I quattro metodi sono tutti approvati per l'uso da HC per uso clinico e dalla FDA per EUA. Tre produttori stabiliscono un unico valore limite che rappresenta la sieroconversione, mentre Euroimmun fornisce un intervallo limite (maggiore o uguale a 25,6-25,6)<35.2 BAU/mL). 

4.3. Confronto della misurazione quantitativa degli anticorpi

La Fig. 1 mostra i confronti dei quattro metodi sierologici tra 210 campioni, che includevano sia campioni immunizzati che positivi al COVID-19-. Tutti i confronti appaiati hanno dimostrato un accordo inaccettabile, utilizzando come criterio un TEa di ±25%. La concordanza migliore è stata di 74 (35,2% su 210 campioni) tra Euroimmun e DiaSorin, mentre la concordanza più bassa è stata di 11 (5,2% su 210 campioni) tra Euroimmun e Roche. La Fig. 1 mostra anche il modello di regressione lineare (statistica di regressione di Deming) per ciascun confronto, con la pendenza compresa tra 1,3 e 7,6. Ulteriori analisi basate su campioni immunizzati e positivi al COVID-19-hanno dimostrato separatamente risultati simili, forniti nei dati supplementari.

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4.4. Confronto della misurazione semiquantitativa degli anticorpi 

La Fig. 2 rappresenta i titoli anticorpali per i quattro metodi sierologici confrontati a coppie, utilizzando 210 campioni. Il titolo anticorpale di ciascun campione è stato calcolato dividendo la concentrazione anticorpale numerica per il valore soglia per ciascun metodo. I titoli anticorpali tra tutti e quattro i metodi erano significativamente diversi (p < 0,001, test di Friedman). La differenza di titolo più elevata rispetto allo stesso campione è stata tra Roche e DiaSorin con una differenza di 1392-volte. Ulteriori analisi basate su campioni immunizzati e positivi al COVID-19- hanno dimostrato separatamente risultati simili, forniti nei dati supplementari.

4.5. Confronto della misurazione qualitativa degli anticorpi

Il confronto qualitativo dei quattro metodi di test sierologici è riassunto nella Tabella 3. Dei 173 campioni in cui era presente un perfetto accordo tra tutti e quattro i metodi sierologici, 148 risultati sono stati positivi e 25 negativi. C'erano 31 campioni in cui era presente disaccordo tra almeno uno dei quattro metodi di test. Questi campioni di disaccordo sono stati ulteriormente classificati in base a quale test ha fornito il risultato distinto. Nessuno dei confronti appaiati basati su risultati qualitativi ha mostrato accordo (p < 0.001, test ChiSquare di Pearson).

Tabella 3 Concordanza sui test sierologici qualitativi sugli anticorpi.

5. Discussione

Sulla base delle conoscenze provenienti da altri programmi di vaccinazione, esistono più marcatori surrogati per determinare l’immunità. Questi includono i livelli di anticorpi determinati mediante test immunologico, test di neutralizzazione virale e batterica, test dell’interferone e test di emoagglutinazione [6]. Il monitoraggio della risposta immunitaria cellulo-mediata ad un antigene virale in laboratorio è una procedura ad alta intensità di lavoro. Viene eseguito solo in laboratori specializzati, ad esempio in laboratori avanzati di citometria a flusso, e non viene utilizzato di routine per scopi clinici. Al contrario, la rilevazione degli anticorpi circolanti può essere eseguita in modo relativamente semplice utilizzando test sierologici ad alto rendimento. Pertanto, il test immunologico semiquantitativo (misurazione del titolo anticorpale) e quantitativo (misurazione della concentrazione anticorpale) è la metodologia più comunemente utilizzata per valutare l’immunità dopo l’immunizzazione [6].

I test sierologici sono essenziali per valutare l’efficacia della vaccinazione contro la SARS CoV-2 [12,13]. Dall'inizio della pandemia COVID-19 e soprattutto dopo che la vaccinazione SARS-CoV-2 è diventata disponibile a livello globale, è stata pubblicata un'ampia letteratura di ricerca per valutare le risposte immunitarie umorali utilizzando vari test immunologici [12,13]. I risultati dei vari metodi analitici dovrebbero essere comparabili per poter comprendere correttamente le conclusioni delle varie pubblicazioni. Inoltre, per valutare in modo affidabile l'efficacia dell'immunizzazione contro la SARS-CoV-2 per scopi clinici, è fondamentale sviluppare test immunologici robusti e condurre un ampio confronto e standardizzazione dei metodi. Dopo che è richiesto un elevato livello di accordo tra i vari metodi, si potrebbe scegliere un limite basato su test semiquantitativi o quantitativi per SARS-CoV-2 per rappresentare protezione e immunità.

Il nostro studio ha dimostrato scarse concordanze tra quattro metodi sierologici approvati per uso clinico da Health Canada e FDA, prodotti da Euroimmun, Abbott, Roche e DiaSorin. Poiché il TEa non è ancora noto per le risposte sierologiche SARS-CoV-2, abbiamo scelto arbitrariamente ±25%, che è comunemente usato per altri test immunologici. Utilizzando questo criterio, sono stati osservati scarsi accordi in tutti i confronti tra due metodi qualsiasi. Sebbene il confronto tra Euroimmun e DiaSorin sia superiore a qualsiasi altro confronto, solo il 35,2% dei 210 campioni è stato ritenuto accettabile. In modo semiquantitativo, dopo aver convertito i risultati quantitativi in ​​titoli dividendo i livelli anticorpali quantitativi per i corrispondenti valori cut-off di ciascun produttore, i titoli di due metodi qualsiasi differivano significativamente (p < 0.001). La differenza di titolo più elevata è stata tra Roche e DiaSorin, con una differenza di 1392-volte. Chiaramente, i metodi sierologici attualmente disponibili differiscono significativamente sia quantitativamente che semiquantitativamente e non possono fornire le prestazioni richieste per l’uso clinico di routine. Inoltre, quando abbiamo applicato i valori limite di sieroconversione nei risultati e determinato i tassi positivi in ​​tutti e quattro i metodi in 210 campioni, sono state riscontrate differenze statistiche significative (p < 0,001) in tutti e due i metodi confrontati.

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Nel novembre 2020, l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) ha stabilito uno standard internazionale e un materiale di riferimento per l'immunoglobulina anti-SARSCoV-2 (codice NIBSC 20/136) [14]. Lo scopo di questo materiale di riferimento è armonizzare la valutazione della risposta immunitaria umorale dopo infezione naturale o vaccinazione. Tutti i quarti metodi in fase di valutazione sono riconducibili a questo materiale di riferimento e i loro risultati potrebbero essere riportati in BAU/mL, un'unità raccomandata dall'OMS. Euroimmun, nel proprio documento di istruzioni, ha fornito la correlazione di questo materiale di riferimento con R2=0.99. Non è chiaro il motivo per cui nel nostro studio è stato osservato uno scarso accordo. Nel luglio 2022, l'OMS ha fornito il secondo standard internazionale per le immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 e un pannello di riferimento per gli anticorpi contro le varianti preoccupanti della SARS-CoV-2 [15]. Probabilmente, l'applicazione di questo nuovo materiale di riferimento potrebbe migliorare la concordanza delle misurazioni degli anticorpi, in particolare per i campioni positivi al COVID-19-. In conclusione, abbiamo riscontrato una scarsa correlazione tra tutti i test valutati, quantitativamente, semiquantitativamente e qualitativamente. Per ottenere misurazioni comparabili è necessaria un'ulteriore armonizzazione dei test.

Riferimenti

[1] Statistiche e ricerca sulle vaccinazioni contro il coronavirus (COVID-19). https://ourworldindata.org/covid-vaccinations, (accesso il 3 agosto 2022).

[2] Health Canada, Vaccini COVID-19 approvati (accesso il 3 agosto 2022). https://www.canada.ca/en/health-canada/services/drugs-health-products/covid19-industry/drugs-vaccines-treatments/vaccines.html.

[3] Food and Drug Administration statunitense, "COVID-19 Vaccines" (accesso effettuato il 3 agosto 2022). https://www.fda.gov/emergency-preparedness-and-response/coronavirus-disease-2019-covid-19/covid-19-vaccines.

[4] J. Cui, F. Li, Z.-L. Shi, Origine ed evoluzione dei coronavirus patogeni, Nat. Rev. Microbiol. 17(3) (2019) 181–192.

[5] H. Bisht, A. Roberts, L. Vogel, A. Bukreyev, PL Collins, BR Murphy, K. Subbarao, B. Moss, La proteina picco del coronavirus della sindrome respiratoria acuta grave espressa dal virus vaccinico attenuato immunizza protettivamente i topi, Proc . Natl. Accade. Sci. Stati Uniti 101 (17) (2004) 6641–6646.

[6] SA Plotkin, Correlati di protezione indotta dalla vaccinazione, Clin. Immunolo vaccino. 17 (7) (2010) 1055–1065.

[7] Comitato nazionale degli scienziati di laboratorio clinici (NCCLS). Rilevazione e quantificazione degli anticorpi IgG della rosolia nel laboratorio clinico; Linee guida approvate. 1997 Wayne, Pennsylvania.

[8] Z. Gao, JG Wood, MA Burgess, RI Menzies, PB McIntyre, CR MacIntyre, Modelli di strategie per il controllo della rosolia e della sindrome della rosolia congenita: un'esperienza di 40- anni dall'Australia, Vaccine 31 (4) (2013) 691–697.

[9] Comitato nazionale degli scienziati di laboratorio clinici (NCCLS). Criteri di valutazione e prestazione per prodotti di test a componenti multipli destinati al rilevamento e alla quantificazione degli anticorpi IgG della rosolia, I/LA6-T, linee guida provvisorie. 1985 Wayne, Pennsylvania.

[10] K. Macrae, CY Gong, P. Sheth, J. Martinez-Cajas, Y. Gong, Analisi quantitativa delle risposte sierologiche SARS-CoV-2 dopo tre dosi di immunizzazione e prima della svolta COVID{{4 }} infezioni, Vaccines 10 (10) (2022) pp, https://doi.org/ 10.3390/vaccines10101590.

[11] A. Robinson, A. Mazurek, M. Xu, Y. Gong, Analisi quantitativa dello stato degli anticorpi SARS-CoV-2 tra pazienti affetti da cancro e individui sani con intervalli di dosaggio vaccinali prolungati in Canada, Curr. Oncol. 29(1) (2022) 68–76, https://doi.org/10.3390/curroncol29010006.

[12] PM Folegatti, et al., Sicurezza e immunogenicità del vaccino ChAdOx1 nCoV-19 contro la SARS-CoV-2: un rapporto preliminare di uno studio controllato randomizzato di fase 1/2, in singolo cieco , Lancet 396 (10249) (2020) 467–478.

[13] LA Jackson, EJ Anderson, NG Rouphael, PC Roberts, M. Makhene, RN Coler, MP McCullough, JD Chappell, MR Denison, LJ Stevens, AJ Pruijssers, A. McDermott, B. Flach, NA Doria-Rose, KS Corbett, KM Morabito, S. O'Dell, SD Schmidt, PA Swanson, M. Padilla, JR Mascola, KM Neuzil, H. Bennett, W. Sun, E. Peters, M. Makowski, J. Albert, K. Cross, W. Buchanan, R. Pikaart Tautges, JE Ledgerwood, BS Graham, JH Beigel, Un vaccino mRNA contro il SARS-CoV-2 - rapporto preliminare, N. Engl. J.Med. 383 (20) (2020) 1920-1931.

[14] Mattiuzzo. et al. Istituzione dello standard internazionale e del gruppo di riferimento dell'OMS per gli anticorpi anti-SARS-CoV-2.2020.(https://www.who.int/publications/m/item/WHO-BS-2020. 2403).

[15] WHO/BS/2022.2427: Istituzione del 2° standard internazionale dell'OMS per le immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 e del pannello di riferimento per gli anticorpi contro le varianti preoccupanti della SARS CoV-2. https://www.who.int/publications/m/item/who-bs- 2022.2427 (visitato il 30 novembre 2022).