Valutazione dell'esposizione all'azoto ammoniacale nelle difese immunitarie presenti sulla milza e sul rene della testa di Wuchang (Megalobrama Amblycephala)
Nov 13, 2023
Astratto:L’ammoniaca è uno dei fattori ambientali più importanti negli ecosistemi acquatici. Tuttavia, esistono studi limitati sugli effetti dello stress da ammoniaca cronico o a lungo termine e sul suo potenziale meccanismo molecolare nei pesci. Questo studio mirava a studiare la risposta immunitaria e i meccanismi molecolari nella milza e nella testa del rene dei pesci in seguito all'esposizione cronica all'ammoniaca.Megalobrama amblycephala(9.98 ± {{0}}.48 g) è stato esposto a diverse concentrazioni di azoto ammoniacale totale (0–30 mg/L) per 30 giorni. L’esposizione all’ammoniaca ha causato aumenti significativi dei livelli di cortisolo e diminuzioni delle concentrazioni di lisozima e complemento 3/4 nel siero, indicando effetti inibitori dello stress da ammoniaca sulle risposte immunitarie innate. L'esposizione all'ammoniaca ha anche indotto aumenti concentrazione-dipendenti delle concentrazioni di ammoniaca nei tessuti, danni patologici e indici della milza e della testa del rene. Inoltre, il contenuto dell'immunoglobulina M (IgM), interleuchina 1 (IL-1 ) e fattore di necrosi tumorale (TNF- ) così come i livelli di mRNA dei recettori toll-like (TLR)/molecole di segnalazione indipendenti dal fattore di differenziazione mieloide 88 (MyD88) nella milza e nella testa del rene erano significativamente sottoregolati dopo l'esposizione all'ammoniaca. I nostri risultati hanno suggerito che l'esposizione cronica all'ammoniaca ha causato la soppressione delle risposte immunitarie innate e adattative attraverso la sottoregolazione della segnalazione indipendente da TLR/MyD88-. Gli effetti avversi dello stress cronico da ammoniaca erano più gravi nella milza che nella testa del rene.
Parole chiave: ammoniaca; fatica; recettori a pedaggio; milza; testa-rene; immunità
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1. Introduzione
Ammonia is one of the most important environmental factors in aquatic ecosystems that affect the growth and health of aquatic animals [1]. Ammonia nitrogen generally comes in one of two ionized forms—NH4 + and the un-ionized form, NH3, in the aquatic environment. NH3 is extremely toxic to fish by reason of its ability to diffuse across cell membranes easily [2–4]. Over the past decades, high levels of ammonia frequently occur in aquatic environments due to disorderly discharges of sewage effluent, agricultural run-off, and high-density aquaculture [5–7]. Although the recommended level of ammonia nitrogen in drinking water is up to 3 mg/L (NH4/L) [8], the real ammonia level can reach much higher (>20 mg/L) a volte, a causa di un trattamento delle acque reflue inefficace o inesistente o per altri motivi [9,10].
È stato dimostrato che gli effetti immunosoppressivi dell’ammoniaca nei pesci contribuiscono all’insorgenza di epidemie [11,12]. In alcuni studi su Takifugu rubripes, Scophthalmus maximus e Pelteobagrus fulvidraco, l'esposizione acuta all'ammoniaca potrebbe aumentare i livelli di espressione genetica del fattore di attivazione delle cellule B, della proteina da shock termico 70/90, del tnf- e dell'interleuchina- 1/1 /6/ 8/12 [13–15]. Wang et al. hanno anche riferito che le attività sieriche del lisozima erano diminuite significativamente nell'Acanthopagrus schlegelii dopo 24 ore di esposizione all'ammoniaca [16]. Allo stesso modo, sono stati osservati livelli ridotti di mRNA di complemento C3 e IgM nelle milze di Pelteobagrus vachellii e Rhynchocypris lagowski sotto esposizione acuta all'ammoniaca [17,18]. Sebbene sia stata prestata molta attenzione agli effetti dell’esposizione acuta all’ammoniaca sull’immunità dei pesci, esistono solo studi limitati sugli effetti dello stress cronico o a lungo termine da ammoniaca e sul suo potenziale meccanismo molecolare. Inoltre, alcuni ricercatori hanno segnalato effetti avversi dell'azoto ammoniacale sull'espressione dell'mRNA dei TLR attraverso l'analisi trascrizionale [16,19–22]. Di conseguenza, ipotizziamo che l’esposizione persistente all’ammoniaca potrebbe anche influenzare l’immunità dei pesci, in cui la via di segnalazione TLR potrebbe svolgere un ruolo importante.
La milza e la testa del rene sono i principali organi immunitari nei pesci teleostei, responsabili di intrappolare ed eliminare materiali particolati estranei e di mantenere un ambiente interno stabile [23,24]. Sono anche i principali siti in cui vengono prodotti gli anticorpi immunitari [25–27]. Inoltre, nei pesci, il sistema immunitario innato è costituito da cellule fisse e mobili, nonché da un’ampia gamma di molecole di difesa (come lisozima, complemento e citochine) [28,29]. L'orata Wuchang (Megalobrama amblycephala) è un pesce ciprinide originario del bacino cinese dello Yangtze, classificato all'11° posto nel mondo per produzione annua totale di questo pesce nel 2014 [30]. Essendo la principale specie di acquacoltura, M. amblycephala è una specie relativamente sensibile all'azoto ammoniacale e spesso soffre di stress indotto dall'azoto ammoniacale [31-33]. Alla luce di quanto sopra, è stato condotto un esperimento di esposizione cronica sull'orata di Wuchang per chiarire le caratteristiche delle risposte immunitarie dopo l'esposizione cronica all'ammoniaca e il meccanismo alla base di questi effetti attraverso il rilevamento di cambiamenti nei parametri immunitari sierici, nell'istologia e nelle molecole correlate al percorso TLR. nella milza e nella testa del rene. I nostri risultati sono utili anche per monitorare lo stato di salute e il benessere di M. amblycephala nei sistemi di acquacoltura intensiva.
2. Risultati
2.1. Contenuto di ammoniaca nella milza e nella testa del rene
La Figura 1 mostra il contenuto di ammoniaca nella milza e nella testa del rene di M. amblycephala dopo 30 giorni di esposizione a vari livelli di ammoniaca. È stato osservato un aumento significativo del livello di ammoniaca nella milza dei pesci esposti a 30 mg/L di azoto ammoniacale totale rispetto al gruppo di controllo (p < 0,05). Non è stata riscontrata alcuna differenza statistica nei livelli di ammoniaca nella testa del rene tra tutti i gruppi di trattamento con ammoniaca e il gruppo di controllo (p > 0,05).
Figura 1. Effetti dell'esposizione cronica all'ammoniaca sull'accumulo di ammoniaca nella milza e nella testa del rene di M. amblycephala. Ciascuna colonna rappresenta la media ± SE di sei duplicati. I valori di p < 0.05 sono rappresentati come "*" sopra la colonna, indicando rispettivamente differenze significative rispetto al controllo.
2.2. Livelli sierici di cortisolo, lisozima, C3 e C4
Come mostrato nella Figura 2, i livelli sierici di cortisolo sono aumentati significativamente in tutti i gruppi di trattamento con ammoniaca rispetto al gruppo di controllo (p < 0.05). Al contrario, le attività sieriche del lisozima erano significativamente diminuite nei pesci esposti a concentrazioni più elevate di ammoniaca (20 e 30 mg/L di azoto ammoniacale totale) (p < 0,05). I livelli del complemento C3 e C4 nel siero erano significativamente ridotti nei gruppi trattati con da 10 a 30 mg/L di azoto ammoniacale totale (p < 0,01).
Figura 2. Effetti dell'esposizione cronica all'ammoniaca sui livelli sierici di cortisolo, lisozima, C3 e C4(AD) in M. amblycephala. Ogni colonna rappresenta la media + SE di sei duplicati. I valori di p < 0.05 e 0.0l sono rappresentati come "" e "" sopra la colonna, indicando rispettivamente differenze significative rispetto al controllo.
2.3. Indici degli organi immunitari
Sia gli indici della milza che quelli della testa del rene sono aumentati con l'aumento delle concentrazioni di azoto ammoniacale totale dopo l'esposizione (Figura 3). Rispetto al gruppo di controllo, l'indice della milza era significativamente elevato nei pesci trattati con azoto ammoniacale totale più elevato (20 e 30 mg/L) (p < 0,05). Non è stata rilevata alcuna differenza significativa nell'indice testa-rene tra tutti i gruppi di trattamento con ammoniaca e il gruppo di controllo (p > 0,05).
Figura 3. Effetti dell'esposizione cronica all'ammoniaca sugli indici della milza (A) e della testa-rene (B) in Mamblycephala. I valori sono espressi da Min a Max (n=18). I valori dip < 0.05 e 0,01 sono rappresentati come"" e "u" sopra la colonna, indicando rispettivamente differenze significative rispetto al controllo.
2.4. Valutazione patologica
La milza dell'orata Wuchang nel gruppo di controllo ha mostrato un aspetto normale con abbondanti eritrociti e leucociti (Figura 4A). Dopo l'esposizione all'ammoniaca per 30 giorni, sono stati notati lievi aumenti del numero di eritrociti insieme alla presenza di centri melano-macrofagici nella milza dei pesci esposti a 5 mg/L di azoto ammoniacale totale (Figura 4B, Tabella 1). Cambiamenti simili ma più gravi sono stati osservati nei pesci trattati con da 10 a 30 mg/L di azoto ammoniacale totale, come aumenti del numero e delle dimensioni dei centri melanoma-macrofagici nonché un marcato aumento del numero degli eritrociti (Figura 4C,D). Inoltre, è stata rilevata vacuolizzazione del citoplasma anche nella milza dei pesci esposti a 30 mg/l di azoto ammoniacale totale (Figura 4E, Tabella 1).
Per quanto riguarda la testa del rene, la Figura 5A mostra una struttura normale del tessuto della testa del rene nei pesci di controllo dopo l'esposizione. Nessun segno patologico evidente è stato notato nella testa del rene dei pesci esposti a una quantità inferiore di azoto ammoniacale totale (5 mg/L) (Figura 5B, Tabella 1). Lievi aumenti nel numero di centri di melanoma-macrofagi sono stati osservati nei pesci esposti a 10 e 20 mg/L di azoto ammoniacale totale (Figura 5C,D, Tabella 1). Le dimensioni e il numero dei centri di melanoma-macrofagi sono stati aumentati nel gruppo con azoto ammoniacale totale di 30 mg/L (Figura 5E, Tabella 1).
2.5. Analisi dei parametri immunitari dei tessuti
I livelli dei parametri immunitari innati (TNF-, IL-1) e dei parametri immunitari acquisiti (IgM) nella milza e nella testa del rene sono diminuiti insieme all'aumento dei livelli di esposizione all'ammoniaca (Figura 6, Tabella supplementare S1). Nella milza, il contenuto e i livelli di mRNA di TNF e IgM erano significativamente diminuiti in tutti i gruppi di trattamento con ammoniaca rispetto ai controlli (p < 0.{{10}}5). Nel frattempo, il contenuto di IL-1 splenico e i livelli di espressione dell'mRNA erano significativamente sottoregolati nei pesci esposti a più di 20 mg/L di azoto ammoniacale totale (p < 0,05). Al contrario, solo il contenuto e il livello di mRNA di IL-1 nonché il livello di espressione di tnf- nella testa del rene erano marcatamente ridotti nei gruppi di trattamento con ammoniaca rispetto ai controlli (p < 0,05). Non sono state riscontrate differenze significative nei livelli di proteine IgM e di espressione genica, nonché nella concentrazione di TNF nella testa del rene tra i gruppi trattati con ammoniaca e il gruppo di controllo (p > 0,05).
Figura 6. Livelli relativi di mRNA dei geni della via di segnalazione TLR nonché contenuto di TNF-, IL- 1 e IgM nella milza e nella testa del rene di M. amblycephala. Valori espressi come media ± SE di sei duplicati. igm: immunoglobulina M, il-1: interleuchina 1, tnf-: fattore di necrosi tumorale, jnk1: chinasi terminale c-Jun N 1, erk1: proteina chinasi 1 regolata extracellulare, p38: proteina chinasi p38 attivata dal mitogeno, nf-κb1 /2: legame del gene del fattore nucleare κ 1/2, pi3 k: fosfatidilinositolo 3-chinasi, akt: proteina chinasi B, myd88: fattore di differenziazione mieloide 88, traf6: fattore associato al recettore del fattore di necrosi tumorale 6, tlr1 /2/3/4/5: recettori simili a pedaggio 1/2/3/4/5. I valori di p < 0.05 e 0,01 sono rappresentati come "*" e "**" sopra la colonna, indicando rispettivamente differenze significative rispetto al controllo
Per chiarire il meccanismo molecolare della tossicità cronica dell'ammoniaca sul sistema immunitario, sono stati determinati i cambiamenti trascrizionali dei geni chiave coinvolti nella via di segnalazione TLR insieme ai livelli di TNF-, IL-1 e IgM. Nella milza, i livelli di mRNA dei geni dei recettori toll-like (tlr2, tlr4), del gene traf6 associato alla via di segnalazione indipendente MyD88-, del gene nf-κb2 associato alla via di segnalazione NF-κB e del gene erk1 associato alla via di segnalazione MAPK erano significativamente ridotti -regolato nei gruppi trattati con ammoniaca rispetto al controllo (p < 0.05), mentre non sono stati riscontrati cambiamenti notevoli nell'espressione di tlr1, tlr3, tlr5, pi3 k, akt, myd88 , nf-κb1, jnk1 e p38 a (p > 0.05). Allo stesso modo, i livelli di trascrizione di tlr1, tlr2, tlr5, akt, traf6, nf-κb1, erk1 e jnk1 erano significativamente rossi, senza differenze significative nell'espressione di tlr3, tlr4, myd88, pi3 k, nf-κb2 e p38 nella testa del rene tra i gruppi di trattamento con ammoniaca e il gruppo di controllo (p > 0,05).
2.6. Analisi di correlazione
Come mostrato nella Figura 7 e nella Tabella Supplementare S2, la concentrazione di esposizione all'ammoniaca era significativamente correlata negativamente con il contenuto di TNF-, IL-1 e IgM nonché con i livelli trascrizionali di tnf-, il-1, igm, tlr2, traf6, nf-кb2 e jnk1 nella milza. Nel frattempo, il contenuto e i livelli di trascrizione del TNF- splenico, dell'IL-1 e dell'IgM hanno mostrato correlazioni positive significative tra loro (p < 0.05). La concentrazione di IgM spleniche ha mostrato una correlazione positiva significativa con tlr2 e nf-кb2, mentre il TNF- e IL-1 hanno mostrato correlazioni positive significative con tlr2, traf6 e nf-кb2 (p < 0.{{ 53}}5). Tuttavia, nel rene della testa, i livelli di esposizione all'ammoniaca erano correlati solo in modo notevolmente negativo con il contenuto di IL-1 e con l'espressione dei geni tnf- , il-1 , tlr1/2/4/5, traf6, akt, nf-кb1, jnk1 e erk1 (p <0,05). IL-1 del rene capo era correlato positivamente con IgM, igm, il-1 , tlr4, myd88, traf6, akt, nf-кb1, erk1 e jnk1, mentre IgM e TNF- mostravano una correlazione positiva con p38a e tlr2, rispettivamente (p <0,05).
Figura 7. Coefficienti di correlazione di Spearman ® tra la concentrazione di esposizione all'ammoniaca e i parametri immunitari coinvolti nella via di segnalazione TLR nella milza e nella testa del rene di M. amblycephala in seguito all'esposizione cronica all'ammoniaca. I valori di p < 0.05 e 0,01 sono rappresentati come "*" e "**" sopra la colonna, indicando differenze significative rispetto al controllo, risp.
2.7. Indici IBR
I valori IBR sono stati calcolati dai dati standardizzati di 22 biomarcatori nella milza e nella testa del rene dell'orata di Wuchang sotto diversi livelli di ammoniaca ambientale dopo un'esposizione di 30- giorni (Tabella 2, Figura 8). All’aumentare delle concentrazioni di esposizione all’ammoniaca, i valori IBR tendevano ad aumentare sia nella milza che nella testa del rene. I valori di IBR erano più alti nella milza
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