Progettazione, sintesi ed effetti antimelanogenici dei derivati ​​​​del (2-fenile-1,3-ditiolano-4-il)metanolo sostituito

Contatto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Do Hyun Kim1Su Jeong Kim1Sultan Ullah1Hwi Young Yun1Pusoon Chun2Hyung Ryong Moon1

Astratto:Gli autori hanno progettato e sintetizzato 17 derivati ​​​​del (2-fenile sostituito-1,3-ditiolano-4-il) metanolo (PDTM) per trovare un nuovo scaffold chimico, che mostra un'eccellentetirosinasi-inibitoreattività. Le loro attività inibitorie della tirosinasi sono state valutate rispetto alla tirosinasi dei funghi a 50 μM e si è scoperto che cinque dei derivati ​​​​PDTM (PDTM3, PDTM7–PDTM9 e PDTM13) inibiscono i funghitirosinasipiù dell'acido cogico o dell'arbutina, i controlli positivi. Di diciassette PDTM, PDTM3 (concentrazione inibitoria semimassima 13,94±1,76 μM), con una frazione di 2,{7}}diidrossifenil, ha mostrato i maggiori effetti inibitori (concentrazione inibitoria semimassima dell'acido cogico 18.86± 2,14 μM). È interessante notare che i composti PDTM senza gruppo ossidrile, PDTM7-PDTM9, avevano anche attività inibitorie più forti dell'acido cogico. Studi in silico sulle interazioni tra la tirosinasi e i cinque PDTM hanno suggerito che le loro affinità di legame fossero strettamente correlate alle loro attività inibitorie della tirosinasi. Esperimenti cellulari eseguiti utilizzando cellule di melanoma della pelle di topo B16F10 hanno mostrato che PDTM3 inibiva efficacementemelanogenesie cellularetirosinasiattività. Uno studio sulla vitalità cellulare condotto utilizzando cellule B16F10 ha indicato che l'effetto antimelanogeno di PDTM3 non era attribuibile alla sua citotossicità. Studi cinetici hanno mostrato che PDTM3 ha inibito in modo competitivo la tirosinasi, indicando il legame con il sito attivo della tirosinasi. Abbiamo scoperto che PDTM3 con un nuovo scaffold chimico potrebbe essere un candidato promettente per agenti sbiancanti per la pelle e che l'1,{9}}anello ditiolano potrebbe essere utilizzato come scaffold chimico per una potente inibizione della tirosinasi.Parole chiave:inibitore della tirosinasi, melanogenesi, 1,3-ditiolano, PDTM

Cistanche è un inibitore della tirosinasi.

introduzione

Negli ultimi decenni,inibitori della tirosinasisono stati di notevole interesse, a causa del ruolo chiave svolto dalla tirosinasi inmelanogenesi. La melanina viene prodotta utilizzando una combinazione di reazioni chimiche e catalizzate enzimaticamente. La via biosintetica responsabile della produzione di melanina è stata inizialmente chiarita da Raper1 e Mason2 e recentemente modificata da Cooksey et al3 e Schallreuter et al.4 La melanogenesi è iniziata dall'enzima tirosinasi, che catalizza i primi due passaggi ossidativi della via biosintetica della melanina: le ossidazioni di l-tirosina in l-dopa seguito da l-dopa in l-dopachinone (Figura 1). Questi due passaggi sono anche i passaggi che determinano la velocità nella biosintesi della melanina perché il pH fisiologico può continuare spontaneamente i passaggi successivi.5 Il dopachinone prodotto nel secondo passaggio viene convertito in cisteinildopa dal glutatione o dalla cisteina e, infine, in feomelanina, che è responsabile del giallo a colori rossi della pelle dei mammiferi, o al dopacromo per autoossidazione e infine all'eumelanina, che è responsabile dei colori marrone/nero della pelle dei mammiferi (Figura 1). La melanina protegge la pelle umana dalle dannose radiazioni ultraviolette e determina anche l'aspetto fenotipico. D'altra parte, un eccessivo accumulo di melanina nella pelle può causare malattie associate all'iperpigmentazione e problemi estetici, come lentiggini, melasma e lentiggini senili.

tirosinasiè ampiamente distribuito in batteri, funghi, insetti, piante e animali, compreso l'uomo, ed è responsabile dei colori della pelle e dei capelli umani e dell'imbrunimento indesiderato di frutta e verdura.6 Imbrunimento enzimatico indesiderato e malattie associate all'iperpigmentazione della pelle hanno incoraggiato gli scienziati a cercare nuovi potenti inibitori della tirosinasi da utilizzare come agenti sbiancanti e anti-marrone della pelle. Moltiinibitori della tirosinasisono stati scoperti fino ad oggi,7-9 ma relativamente pochi sono stati approvati come materiali sbiancanti per la pelle, a causa di problemi di sicurezza o effetti sbiancanti deboli.

Nei nostri studi precedenti, sulla base delle strutture della l-tirosina e della l-dopa, substrati naturali della tirosinasi, abbiamo progettato due potenziali inibitori della tirosinasi con un anello tiazolidinico (MHY384 e MHY794; Figura 1) e li abbiamo sintetizzati mediante condensazione di un appropriato benzaldeide e l-cisteina o cisteamina cloridrato. Questi due composti sono stati identificati per essere potenti competitiviinibitori della tirosinasie per ridurre efficacemente la melanogenesi nei topi glabri HRM2.10,11 Oltre a inibire direttamente l'attività della tirosinasi, MHY384 ha inibito l'espressione della tirosinasi sopprimendo l'adenosina monofosfato ciclico-PKA10 e la guanosina monofosfato ciclica indotta da NO-PKG12,13 e anche MHY794 ha soppressotirosinasiespressione indotta da NO-mediatamelanogenesisegnalazione.11 Questi risultati positivi e il fatto che il bivalente –S– sia un isostere classico del bivalente –NH– ci ha incoraggiato a sintetizzare derivati ​​con un anello ditiolano come surrogato dell'anello tiazolidinico comunemente esistente in MHY384 e MHY794, al fine di trovare nuovi inibitori della tirosinasi.

Nel presente studio, come parte dei nostri sforzi in corso per trovare un nuovo e forte scaffold chimico per l'inibizione della tirosinasi e sviluppare nuoviinibitori della tirosinasi, abbiamo sintetizzato una classe di derivati ​​strutturalmente nuovi (2-fenile sostituito-1,3-ditiolano-4-il)metanolo (PDTM) (Figura 1) e ne abbiamo studiato gli effetti antimelanogenici utilizzando tirosinasi dei funghi e saggi cellulari. In questo studio, l'acido cogico e l'arbutina sono stati usati come controllo positivo per l'attività inibitoria della tirosinasi, perché l'acido cogico è uno dei controlli positivi più comunemente usati per la valutazione dell'inibizione della tirosinasi e l'arbutina è clinicamente utilizzata come agente sbiancante.

Materiali e metodi

Materiali

Salvo diversa indicazione, tutti i reagenti disponibili in commercio: l-tirosina (codice T3754), l-dopa (codice PHR1271), acido cogico (codice K3125), MTT (3-(4,5-dimetil{{ 8}}tiazolil)-2,5-difenile-2H-tetrazolio bromuro) (codice M2128), PMSF (fenilmetilsolfonilfluoruro) (codice P7626), Tritone X-100 ( 4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenilpolietilenglicole) (codice T8787), fosfato monobasico di potassio (codice P9666), fosfato monobasico di potassio (codice PHR1330), 2,3- dimercapto-1-propanolo (codice 64046), 1,{29}}diossano (codice 296309), acido solforico (codice 339741) e benzaldeidi – sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA). Il siero fetale bovino, il Dulbecco's Modified Eagle's Medium, la soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), la penicillina, la streptomicina e la tripsina sono stati acquistati da Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). Fungotirosinasi(codice T3824) e l'ormone stimolante i melanociti (-MSH; codice M4135) sono stati acquistati anche da Sigma-Aldrich. Gli spettri di risonanza magnetica nucleare (NMR) 1H e 13C sono stati registrati sugli strumenti Varian Unity Inova 400 e Varian Unity AS 500 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). I dati della spettrometria di massa a bassa risoluzione (MS) e MS ad alta risoluzione sono stati ottenuti rispettivamente su un Expression CMS (Advion, Ithaca, NY, USA) e uno spettrometro di massa per cromatografia liquida a tempo di volo con quadrupolo di massa accurato 6530 (Agilent). . La sintesi di PDTM1–PDTM17 è stata realizzata nel nostro laboratorio.

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Procedura generale per la sintesi di PDTM1–PDTM17

Ad una soluzione agitata di 2,3-dimercapto-1-propanolo (100 mg, 0,80 mmol) in 1,4-diossano (1 ml) sono stati ha aggiunto successivamente una soluzione di acido solforico (0,1 equivalenza) in 1,{12}}diossano (1 mL) e un'appropriata benzaldeide (1,1 equivalenza). Dopo essere stata agitata a temperatura ambiente per 10 minuti, la miscela di reazione è stata agitata a 70 gradi per 40 minuti fino a 1 ora. La miscela è stata quindi ripartita tra acetato di etile e acqua, e lo strato organico è stato essiccato su MgSO4 anidro, filtrato ed evaporato. Il residuo ottenuto è stato purificato mediante cromatografia su colonna di gel di silice per ottenere prodotti PDTM puri: PDTM1–PDTM17.14 Caratterizzazione strutturale (1H e 13C NMR e dati di massa di tutti i PDTM e 1-D e 2-D NMR spettri di alcuni PDTM) di composti sintetizzati sono forniti in Materiali supplementari.

Inibizione del fungotirosinasida PDTM1–PDTM17

Gli effetti inibitori degli analoghi del PDTM sulla tirosinasi dei funghi sono stati esplorati con modifiche minori, come descritto in precedenza nel nostro lavoro.15 Ciascun composto (10 μL, concentrazione finale 50 μM) è stato miscelato con una soluzione di substrato (170 μL), preparata da 14,7 mM di fosfato di potassio tampone (pH 6,5) e 293 µM di soluzione di l-tirosina (1:1, v/v), in ciascun pozzetto di una 96-piastra a pozzetti. A ciascun pozzetto è stata aggiunta una soluzione di tirosinasi di funghi (20 μL, 1,000 U/mL) e incubata per 30 minuti a 37 gradi. Il contenuto di dopacromo formato nei pozzetti è stato determinato misurando le densità ottiche a 475 nm utilizzando un lettore di micropiastre VersaMax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). L'acido kojico e l'arbutina sono stati usati come controlli positivi. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato. Tassi di inibizione ditirosinasisono stati così calcolati:

Inibizione ( percentuale )=× 100 [ ( 1 − AB/ )] (1)

dove A indica la densità ottica del composto in esame e B rappresenta la densità ottica del controllo.

La concentrazione inibitoria semimassima (IC50) è la concentrazione di un composto che inibisce una risposta standard del 50%. IC50 è derivato dall'asse x su una curva concentrazione inibitore rispetto a formazione del prodotto ed è determinato dall'allineamento della curva dose-risposta sull'asse y dipendente. Nel presente studio, sono stati eseguiti esperimenti di inibizione dose-dipendente in triplicato per determinare l'IC50 dei composti. In base alla percentuale di inibizione di cinque dosi (concentrazione finale 10, 20, 30, 40 e 50 µM) in ciascun esperimento, sono state determinate le curve log-lineari e le relative equazioni. I singoli valori di IC50 sono stati quindi calcolati come concentrazione quando l'asse y corrispondeva al 50 percento di inibizione. Vengono mostrati i risultati dei tre esperimenti.

Analisi della natura dell'inibizione della tirosinasi dei funghi

Per chiarire la natura dell'effetto inibitorio di PDTM3 sulla tirosinasi dei funghi, sono stati condotti studi cinetici. PDTM3 (10 μL [0, 5, 10 o 25 μM di concentrazione finale]) è stato aggiunto a 170 μL di soluzione di l-tirosina (0,5, 1, 2 o 4 mM di concentrazione finale) e poi mescolato con i funghitirosinasisoluzione (20 μL, 1,000 U/mL) in ciascun pozzetto di una 96-piastra a pozzetti. Dopo che la miscela è stata incubata per 30 minuti a 37 gradi, il contenuto di dopacromo prodotto nei pozzetti è stato determinato misurando le densità ottiche a 475 nm utilizzando un lettore di micropiastre. Tutti gli esperimenti sono stati condotti in triplicato. Per la determinazione della natura dell'inibizione è stato utilizzato un diagramma di Lineweaver-Burk.

estratto di cistanche beneficio

Simulazione di docking di PDTM3 o acido cogico con tirosinasi

La simulazione di docking in silico del ligando proteico è stata eseguita con AutoDock Vina utilizzando una tecnica di ricerca sistematica e la struttura 3-D di Agaricus bisporustirosinasi(Protein Data Bank ID 2Y9X).16,17 Nella struttura cristallina della tirosinasi, il sito di legame della l-tirosina è stato utilizzato come tasca di aggancio. I risultati della simulazione sono stati ottenuti dall'aggancio tra tirosinasi e composti sintetici (PDTM3, PDTM7, PDTM8, PDTM9 e PDTM13) o acido cogico. Prima di eseguire la simulazione di docking con i composti, le 2-strutture D dei composti sono state trasformate in 3-strutture D, sono state determinate le cariche dei composti e sono stati inseriti atomi di idrogeno utilizzando ChemOffice. LigandScout 3.1.2 è stato utilizzato per la previsione di possibili interazioni tra ligandi e tirosinasi e l'identificazione di farmacofori. Le immagini di simulazione di aggancio di 17 PDTM sono fornite nei materiali supplementari.

Determinazione del livello di melanogenesi nelle cellule B16F10

I saggi del contenuto di melanina con modifiche minori sono stati utilizzati nelle cellule B16F10 per gli effetti inibitori di PDTM3 sumelanogenesi.19 Le cellule seminate a una densità di 5×104 cellule/pozzetto in una 24-piastra a pozzetti sono state lasciate aderire a 37 gradi in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO2 durante la notte. Il giorno seguente, le cellule sono state esposte a -MSH (1 μM) e PDTM3 (0, 5, 10 o 25 μM) o acido cogico (25 μM) e la piastra è stata incubata per 24 ore nelle stesse condizioni. Dopo essere state lavate due volte con PBS, le cellule sono state staccate mediante incubazione a 60 gradi in 200 μL di NaOH 1 N per 1 ora. I lisati sono stati spostati su una 96-piastra a pozzetti e le densità ottiche sono state misurate a 405 nm da un lettore di test di immunoassorbimento enzimatico per il calcolo delle inibizioni percentuali medie di acido cogico e PDTM3. Tutti gli esperimenti sono stati condotti in triplicato.

Saggio di attività della tirosinasi nelle cellule B16F10

Stimando il tasso di ossidazione della l-dopa,tirosinasile attività sono state valutate con modifiche minori, come descritto nel lavoro precedente.20 Le cellule seminate a una densità di 5×104 cellule/pozzetto in una 24-piastra a pozzetti sono state autorizzate a aderire a 37 gradi in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO2 per 24 ore. Le cellule sono state esposte a -MSH (1 μM) e PDTM3 (0, 5, 10 o 25 μM) o acido cogico (25 μM) e la piastra è stata incubata nelle stesse condizioni per 24 ore. Dopo essere state risciacquate due volte con PBS, le cellule sono state lisate con 100 μL di tampone di lisi contenente 0,1 mM PMSF (5 μL), 50 mM PBS (90 μL, pH 6,8) e 1% Triton X-100 (5 μL) e congelato a -80 gradi per 30 minuti. I lisati sono stati scongelati e centrifugati a 12,{31}} g per 30 minuti a 4 gradi e i supernatanti (80 μL) sono stati combinati con l-dopa 10 mM (20 μL) in una 96- piastra a pozzetti, che è stata quindi incubato per 30 minuti a 37 gradi. Le densità ottiche sono state calcolate a 500 nm e le attività inibitorie della tirosinasi sono state determinate in questo modo:

Inibizione ( percentuale )=× 100 ([A−B] − [C−D] /[ A−B ] ) (2)

dove B e A sono rispettivamente le densità ottiche del bianco prima e dopo l'incubazione e D e C sono le densità ottiche del composto in esame prima e dopo l'incubazione.

analisi statistica

L'analisi unidirezionale della varianza seguita dal test di Dunnett è stata utilizzata per determinare se le medie del gruppo differissero significativamente da quelle dei controlli. Il test t spaiato di Welch è stato utilizzato per determinare se gli effetti del PDTM3 e dell'acido cogico erano significativamente diversi. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando GraphPad (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Tutti i risultati sono indicati come media ± errore standard di tre esperimenti indipendenti. I valori P a due code di 0.05 sono stati considerati statisticamente significativi.

risultati e discussione

La preparazione di PDTM1–PDTM17PDTM1–PDTM17 è stata sintetizzata come mostrato nello Schema 1. Riscaldando 2,{6}}dimercapto-1-propanolo e numerose benzaldeidi opportunamente sostituite (1–17) in 1,4-diossano in la presenza di acido solforico ha fornito i prodotti PDTM desiderati come solidi o olio appiccicoso. Le strutture dei prodotti finali sono state confermate da 1H e 13C NMR, spettroscopia di correlazione, spettroscopia di correlazione eteronucleare a singolo quantico, spettroscopia di correlazione eteronucleare a legami multipli e MS a bassa e alta risoluzione. La presenza del singoletto corrispondente al protone –SCH(Ph)S– a δ=6.09–5.56 ppm negli spettri NMR 1H ha confermato la formazione di un anello ditiolano tra benzaldeidi e 2,3-mercapto -1-propanolo. Nei dati spettroscopici 1H NMR di PDTM, il picco 2-H è apparso più a valle rispetto ai picchi dei protoni attaccati agli atomi di carbonio sp3 e i picchi 4-H esometilene e 5-H2 sono stati osservati di più upfield in ordine denominato. Nei dati spettroscopici NMR 13C, a parte i picchi dell'anello fenilico, il picco di carbonio dell'esometilene (~64 ppm) era più a valle, seguito in ordine da 4-C (~58 ppm), 2-C (~55,3 ppm) e 5-C (~41 ppm). Quattro prodotti – PDTM6, PDTM12, PDTM13 e PDTM15 – sono stati ottenuti ciascuno come un unico racemato, mentre gli altri sono stati ottenuti come una miscela di due racemi ([2R,4R]/[2S,4S] e [2R,4S]/ [2S,4R], 1:1–1:1.5), i cui rapporti sono stati calcolati utilizzando dati spettroscopici 1H NMR. Il fenomeno nella formazione del prodotto non può essere spiegato semplicemente da effetti sterici, elettronici e/o stereoelettronici. Ilinibizione della tirosinasiil test è stato eseguito senza la separazione dei racemati.

Effetti inibitori di PDTM1–PDTM17 sulla tirosinasi dei funghi

I potenziali dei 17 prodotti sintetizzati, PDTM1–PDTM17, di inibire l'attività della tirosinasi dei funghi sono stati esaminati utilizzando acido cogico22 e arbutina23 come controlli positivi. Le inibizioni sono state determinate utilizzando 293 µM di l-tirosina come substrato e composti sintetici a una concentrazione di 50 µM.tirosinasile inibizioni dell'acido cogico e dell'arbutina sono state determinate rispettivamente a 50 e 500 µM.

Tre composti: PDTM11 (3,4,5-trimetossifenile), PDTM15 (4-idrossi-3-metilfenile) e PDTM17 (3,5-di-t-butile{{ 12}}idrossimetil) – ha inibito la tirosinasi nella stessa misura dell'acido cogico e l'ha inibita più dell'arbutina (Tabella 1). Cinque derivati ​​del PDTM: PDTM3 (2,4-diidrossifenile), PDTM7 (4-metossifenile), PDTM8 (3,4-dimetossifenile), PDTM9 (2,4-dimetossifenile), e PDTM13 (3-bromo-4-idrossifenil) – hanno inibito la tirosinasi in modo più potente dell'acido cogico. Sono stati esaminati i valori IC50 di questi composti: 13,94±1,76 µM (PDTM3), 16,47±2,36 µM (PDTM7), 16,97±2,99 µM (PDTM8), 27,85±1,47 µM (PDTM9) e 15,57±3,31 µM (PDTM13). I bassi valori di IC50 di PDTM3, PDTM7, PDTM8 e PDTM13 indicavano che la potenza era più forte di quella dell'acido cogico (18.86±2,14 µM) e dell'arbutina (381,26±3,22 µM), che sono stati usati come controlli positivi . È interessante notare che questo risultato concorda con la nostra precedente scoperta che molti analoghi con una porzione 2,{68}}diidrossifenile possiedonotirosinasi-inibitoreattività rispetto all'acido cogico.10,13,24–32

I restanti derivati ​​PDTM non avevano (PDTM1 e PDTM2) o basso effetto inibitorio (PDTM4, PDTM5, PDTM6, PDTM10, PDTM12, PDTM14 e PDTM16) rispetto all'acido cogico. Secondo i nostri dati accumulati sulla relazione struttura-attività, gli analoghi con almeno un gruppo idrossile erano più capaci di inibire la tirosinasi. In qualche modo sorprendentemente, quattro derivati ​​PDTM senza gruppo idrossile hanno inibito l'attività della tirosinasi tanto o più efficacemente dell'acido cogico. Questi erano PDTM7 (4-metossifenile), PDTM8 (3,4-dimetossifenile), PDTM9 (2,4-dimetossifenile) e PDTM11 (3,4,5-trimetossifenile) . Composti (PDTM1-2, PDTM4-5 e PDTM12) con solo un 4-gruppo idrossile sull'anello fenilico o un gruppo alcossi o idrossile in posizione 3 con un 4-idrossile il gruppo aveva un'attività bassa o nulla, mentre i composti (PDTM13–PDTM17) con un gruppo alchilico o bromo in posizione 3 con un 4-gruppo idrossile hanno mostrato un'attività inibitoria della tirosinasi moderata-alta. Questi risultati della relazione struttura-attività supportano l'ipotesi che ilinibitorio della tirosinasil'attività dei composti con un 4-gruppo ossidrile è fortemente influenzata dal tipo di 3-sostituente.

cistanchebeneficio: antietà

Modalità di inibizione della tirosinasi dei funghi da parte di PDTM3

Poiché PDTM3 ha inibito il fungotirosinasiper la maggior parte, per determinare la natura del suo effetto inibitorio è stato utilizzato un grafico Lineweaver-Burk. Come illustrato nella Figura 2, è stato ottenuto un grafico a doppio reciproco e tutte le linee con pendenze diverse hanno intersecato l'asse y nello stesso punto. Pertanto, i valori di Km (costante di Michaelis) sono aumentati gradualmente con la concentrazione di PDTM3. I valori dettagliati dei parametri cinetici sono riportati nella Tabella 2. D'altra parte, la velocità di reazione massima (Vmax) non è stata influenzata dalla concentrazione di PDTM3. Questi risultati dimostrano che PDTM3 ha inibito la tirosinasi in modo dose-dipendente e competitivo.

Simulazioni di docking in silico dell'associazione della tirosinasi con PDTM3, PDTM7–PDTM9, PDTM13 e acido cogico

AutoDock Vina è stato utilizzato per determinare se gli analoghi sintetizzati del PDTM inibissero direttamente la tirosinasi legandosi al suo sito attivo. Acido kojico e cinque analoghi del PDTM (PDTM3, PDTM7–PDTM9 e PDTM13), che sono stati trovati per avere potenti funghitirosinasi-inibitoreattività, sono stati utilizzati come ligandi per la simulazione di docking. Ciascuno di questi analoghi PDTM potrebbe avere quattro stereoisomeri e le energie di legame degli stereoisomeri sono indicate nella Figura 3A. È stato riscontrato che tutti e cinque gli analoghi del PDTM hanno un'affinità simile o superiore per il sito attivo della tirosinasi rispetto all'acido cogico (-5.4 kcal/mol) e il PDTM3 ha dimostrato l'affinità maggiore. Questo risultato ha indicato che i forti effetti inibitori di questi cinque derivati ​​PDTM erano attribuibili alla loro affinità di legame con la tirosinasi e hanno mostrato una stretta relazione tra l'affinità di legame, determinata dalla simulazione di docking, e l'inibizione della tirosinasi.

LigandScout 3.1.2 è stato utilizzato per identificaretirosinasiresidui di amminoacidi che interagiscono con gli analoghi del PDTM. Come mostrato nelle Figure 3B e C, il 4-gruppo idrossile sull'anello fenilico di PDTM3 ha interagito con His85 della tirosinasi attraverso il legame idrogeno e l'anello fenilico ha interagito con Val283 e Ala286 attraverso interazioni idrofobiche e con His263 attraverso π–π interazione di impilamento. Il legame idrogeno tra il gruppo idrossile alcolico e i residui di amminoacidi della tirosinasi è stato rilevato solo per PDTM7 e PDTM8. Tuttavia, il gruppo idrossile alcolico di entrambi gli analoghi del PDTM ha interagito con diversi residui di amminoacidi, ad esempio PDTM7 ha interagito con His244 e Asn260, mentre PDTM8 ha interagito con Gly281. Inoltre, Val283 della tirosinasi è stato coinvolto nelle interazioni idrofobiche con tutti e cinque gli analoghi.

Saggi di contenuto di melanina

Le cellule B16F10 sono state utilizzate per valutare le attività depigmentanti degli analoghi del PDTM. PDTM3 è stato scelto per gli esperimenti cellulari, grazie al suo potente fungotirosinasi-inibitoreeffetto e la sua mancanza di tossicità per le cellule B16F10. PDTM3 è stato valutato per il suo effetto inibitorio contro -MSH-stimolatomelanogenesinelle cellule B16F10 determinando i livelli di melanina nelle cellule. I livelli di melanina sono stati significativamente ridotti dopo che le cellule sono state trattate con PDTM3 e -MSH rispetto alle cellule trattate con solo -MSH. Nell'intervallo di concentrazione 0–25 μM, PDTM3 ha mostrato un effetto antimelanogenico significativo e dose-dipendente. Inoltre, a una concentrazione di soli 10 μM, PDTM3 ha mostrato una maggiore potenza inibitoria rispetto all'acido cogico a 25 μM, come illustrato nella Figura 5. Questi risultati hanno indicato che l'effetto antimelanogeno di PDTM3 nelle cellule B16F10 non era correlato alla citotossicità.

Saggio di attività della tirosinasi nelle cellule B16F10

L'effetto inibitorio di PDTM3 sull'attività della tirosinasi cellulare è stato esaminato in cellule B16F10 prestimolate con -MSH. PDTM3 inibito in modo dose-dipendentetirosinasiattività nell'intervallo di concentrazione 0-25 μM (Figura 6). Inoltre, questi risultati corrispondevano bene ai risultati del contenuto di melanina, il che suggeriva che l'effetto antimelanogenico del PDTM3 fosse attribuibile all'inibizione della tirosinasi.

Conclusione

In questo lavoro, una varietà di analoghi PDTM sono stati sintetizzati e valutati per i loro effetti sumelanogenesie attività della tirosinasi nelle cellule B16F10. Otto analoghi hanno mostrato un'inibizione tanto o più potente contro la tirosinasi dei funghi rispetto all'acido cogico e PDTM3 ha avuto la maggiore attività inibitoria. Nelle cellule B16F10, PDTM3 ha inibito significativamente la biosintesi della melanina in modo dose-dipendente etirosinasiattività nell'intervallo di concentrazione 0–25 μM senza effetti citotossici. A una concentrazione di 10 μM, PDTM3 ha ridotto la biosintesi della melanina e l'attività della tirosinasi significativamente più dell'acido cogico a 25 μM. In considerazione della nostra osservazione che molti analoghi del PDTM hanno mostrato potenti attività inibitorie della tirosinasi, suggeriamo che il 1,3-ditiolano sia considerato uno scaffold appropriato pertirosinasi-inibitoreattività. Ora, stiamo cercando le condizioni di separazione di ciascuna miscela PDTM di due racemi e le condizioni di separazione e l'effetto antimelanogenico di ogni singolo racemo saranno riportati a tempo debito.

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