Identificazione del sitogluside come potenziale agente di riduzione della pigmentazione cutanea attraverso la farmacologia di rete

Contatto: ali.ma@wecistanche.com

Haoran Guo,1 Hongliang Zeng,2 Chuhan Fu,1 Jinhua Huang,1 Jianyun Lu,1 Yibo Hu,1Ying Zhou,1 Liping Luo,1 Yushan Zhang,1 Lan Zhang,1 Jing Chen,1 e Qinghai Zeng 1

Molte medicine tradizionali cinesi (MTC) consbiancamento della pelleproprietà sono state registrate nelle prescrizioni Ben-Cao-Gang-Mu e infolk, e una parte della letteratura conferma che i loro estratti hanno il potenziale per inibirepigmentazione. Tuttavia, nessuno studio sistematico ha identificato i meccanismi regolatori specifici dei potenziali principi attivi. Lo scopo di questo studio era quello di selezionare gli ingredienti nei MTC che inibiscono la pellepigmentazioneattraverso un sistema farmacologico di rete e per esplorare i meccanismi sottostanti. Abbiamo identificato 148 potenziali principi attivi da 14 MTC e, sulla base del "grado" medio dei parametri topologici, i primi cinque MTC (Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones e Paeoniae Radix Alba) che era più probabile che causasserosbiancamento della pelleattraverso processi antinfiammatori sono stati selezionati. Il sitogluside, l'ingrediente più comune tra i primi cinque MTC, inibisce la melanogenesi nelle cellule di melanoma umano (MNT1) e le cellule di melanoma murino (B16F0) e riduce la pellepigmentazionein zebrafish. Inoltre, la ricerca meccanicistica ha rivelato che il sitogluside è in grado di sottoregolaretirosinasi(TYR) inibendo le vie ERK e p38 e inibendo l'attività di TYR. Questi risultati dimostrano che la farmacologia di rete è uno strumento efficace per la scoperta di composti naturali con proprietà sbiancanti della pelle e la determinazione dei loro possibili meccanismi. Sitogluside è un nuovo ingrediente attivo sbiancante per la pelle con doppi effetti regolatori che inibisconoTIROespressione e attività.

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introduzione

La melanina non solo determina il colore della pelle, degli occhi e dei capelli umani, ma svolge anche un ruolo chiave nel mimetismo, nella mimica, nella comunicazione sociale e nella protezione dai raggi ultravioletti. Tuttavia, quando la melanina è prodotta in eccesso e distribuita in modo anomalo nell'epidermide, provoca una varietà di condizioni, come lentiggini e melasma, che possono influenzare negativamente la bellezza percepita e la fiducia sociale [1]. La melanina è il prodotto finale della L-tirosina dopo molteplici fasi di reazioni enzimatiche ed è sintetizzata nei melanosomi dei melanociti [2]. Nella pelle, i melanociti si trovano nello strato basale dell'epidermide e possono produrre e trasferire melanosomi maturi ai cheratinociti, causando così la pellepigmentazione [3]. TIROè il principale enzima limitante la produzione di melanina [4], e il fattore di trascrizione associato alla microftalmia (MITF) è il principale fattore di trascrizione che regola l'espressione trascrizionale di TYR [5].

Recentemente, gli studi hanno scoperto che le risposte infiammatorie svolgono un ruolo importante nella regolazione della melanogenesi [6]. Ad esempio, IL-18, prodotto da cellule di Langerhans, cellule dendritiche e cheratinociti nell'epidermide, può sovraregolare le espressioni di TRP{{2 }} (proteina 1 correlata alla tirosinasi) e TRP-2 (proteina 2 correlata alla tirosinasi) attivando le vie p38/MAPK (proteina chinasi attivata dal mitogeno) e PKA (proteina chinasi A), promuovendo così la melanogenesi[7, 8 ]. Il TNF riduce la produzione di melanina B16 principalmente attivando NF-κB [9]. È stato dimostrato che la PGe2 (prostaglandina e2), secreta da fibroblasti e cheratinociti, stimola la differenziazione delle cellule dendritiche e avvia l'attività TYR nei melanociti attraverso le vie di segnalazione cAMP (adenosina monofosfato ciclico) e Plc (fosfolipasi c) [10]. PIH (iperpigmentazione postinfiammatoria) è un tipo di melanizzazione cutanea reattiva [11]. Spesso portano a varie malattie della pelle, traumi o interventi di chirurgia esteticapigmentazionedella zona colpita, specialmente nelle persone di colore [12]. I pazienti con PIH di solito sopportano un immenso stress psicologico, che nei casi più gravi influisce negativamente sulla loro qualità di vita. Pertanto, alcuni medicinali che regolano l'infiammazione vengono utilizzati per trattare la PIH e altre malattie che causano l'iperpigmentazione. Ad esempio, è stato scoperto che il resveratrolo, che ha ridotto il danno infiammatorio nelle cellule HaCaT [13], inibisce la sintesi della melanina attraverso la regolazione del segnale extracellulare della chinasi1/2 e la segnalazione di fosfoinositide 3-chinasi/Akt [14].

Sbiancamentoagenti, come l'idrochinone (HQ) e la vitamina C, sono tradizionalmente usati per trattare la pigmentazione [15]. HQ è un idrossifenolo con un potente effetto inibitorio sulla melanogenesi. Tuttavia, a causa di vari effetti collaterali come dermatite da contatto irritante o allergica, scolorimento delle unghie e ridotta guarigione delle ferite, l'uso di HQ è limitato[16, 17]. La vitamina C inibisceTIROinteragendo con gli ioni rame nei siti attivi TYR, diminuendo così la melanogenesi. Tuttavia, la vitamina C è instabile nei prodotti finiti. Inoltre, se la concentrazione di vitamina C è superiore al 20 percento, può causare irritazione alla pelle [18]. Pertanto, gli ingredienti naturali provenienti da un'ampia gamma di fonti che sono sicuri, efficaci, altamente stabili e facili da conservare sono molto richiesti.

Recentemente, più ingredienti MTC sono risultati efficaci nell'inibire la pellepigmentazione, come l'apigenina e la paeoniflorina [19–21]. I MTC con attività sbiancante descritti nel Ben-Cao-Gang-Mu sono ampiamente usati come ricette segrete in Cina e oggigiorno è confermato che hanno l'effetto di inibire la pigmentazione. Ad esempio, l'estratto di Hedysarum multijugum Maxim (il rizoma di Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge) provoca lo sbiancamento cutaneo inibendo la via ERK [22]. L'estratto secco di Typhonii Rhizoma (il rizoma di Sauromatum gigan-teum (Engl.) Cusimano e Hett.) può inibire efficacemente latirosinasiattività in vitro [23]. E la medicina basata sull'evidenza ha anche confermato che l'estratto di SapindiMukorossi Semen (il frutto di Sapindus mukorossi Gaertn.), che inibisce l'attività della tirosinasi, ha il potenziale per essere utilizzato come farmaco e additivo cosmetico [24]. Anche alcune prescrizioni popolari tradizionali, sebbene non compilate in un compendio, sono ampiamente utilizzate. San-Bai-Tang (SBT) è un tipicoesempio. Sì et al. dimostrato che SBT potrebbe diminuire la produzione di melanina inibendo la via di segnalazione p38/MAPK e l'attività TYR [25]. È stato dimostrato che anche altri MTC descritti in alcune prescrizioni hannosbiancamento della pelleeffetti. L'estratto di Coicis Semen (il seme di Coix AquaticaRoxb.) inibisce la produzione di melanina sottoregolando MITF, TYR, TRP-1 e TRP-2 [26]. Inoltre, un saggio di cella diTIROha mostrato che Ampelopsis japonica (il rizoma di Ampelopsis japonica (Thunb.) Makino) ha inibito l'attività del fungo TYR di oltre il 50 percento [27]. Le MTC sbiancanti registrate in queste antiche prescrizioni si sono rivelate efficaci dalle moderne tecniche sperimentali, ma la maggior parte di esse sono verificate sotto forma di estratti e i principi attivi che funzionano non sono chiari. Ciò ha suscitato il nostro interesse per i principi attivi delle MTC con effetti sbiancanti registrati nelle antiche prescrizioni.

Inoltre, le MTC o le prescrizioni hanno ingredienti complessi, diverse modalità di azione e principi attivi sconosciuti. Inoltre, l'incoerenza di fattori come la qualità delle materie prime, i metodi di lavorazione, le tecniche di preparazione, la compatibilità degli ingredienti utilizzati nella composizione e le forme di dosaggio ha un impatto maggiore sull'efficacia dei MTC [19, 28]. Pertanto, l'utilizzo di alcuni TCM consbiancamento della pellegli effetti sono limitati. È quindi urgente identificare i principi attivi con potenziali effetti sbiancanti sulla pelle, attraverso uno screening sistematico per garantire la sicurezza, l'efficacia e la stabilità di questi ingredienti.

Negli ultimi anni, l'applicazione della biologia dei sistemi nel campo della MTC ha fatto grandi progressi. La farmacologia di rete della MTC è una nuova disciplina interdisciplinare che combina la farmacologia delle MTC con la scienza delle reti, la biologia dei sistemi, la scienza computazionale e la bioinformatica [29]. Comprende appieno la complessità tra farmaci, malattie e sistemi biologici dal punto di vista della rete "proteina complessa/malattia genica" [30]. La farmacologia di rete è uno strumento efficace e sistematico per studiare l'azione farmacologica, il meccanismo, la sicurezza e altri aspetti della fitoterapia, in particolare le MTC, e fornisce preziose informazioni per l'attuale scoperta di farmaci [31, 32].

ingredienti sbiancanti per la pelle

2. Materiali e metodi

2.1. Processo farmacologico di rete

2.1.1. Creazione di database per ingredienti chimici

Un diagramma di flusso del programma sperimentale studiato è illustrato nella Figura 1. I TCM con effetti anti-pigmentazione, descritti nel Ben-Cao-Gang-Mu e nelle prescrizioni popolari, sono stati utilizzati per l'analisi farmacologica di rete. Typhonii Rhizoma, Ricini Semen, Hedysarum multijugum Maxim., Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones e Sapindi MukorossiSemen, descritti nel Ben-Cao-Gang-Mu, hannosbiancamentoe giallo proprietà di abbassamento e può rimuovere macchie e nei facciali. Poria cocos (Schw.) Wolf (lo sclerozio di Smilax china L.), Paeoniae Radix Alba e Atractylodes macrocephala Koidz (il rizoma di Atractylodes macrocephalaKoidz.) che sono costituenti della SBT sono noti per migliorare la struttura della pelle e ridurre il cloasma epigmentazione. Altre erbe tradizionalmente registrate, come Bletilla striata (Thunb. Murray) Rchb.F. (il rizoma di Bletilla striata(Thunb.) Rchb.F.), Ampelopsis japonica, A. dahurica (Fisch.)Benth. Et Hook (il rizoma di Angelica dahurica (Hoffm.)Benth. e Hook.f. ex Franch. e Sav.), Atractylodes lancea(Thunb.) Dc. (in questo studio sono stati inclusi anche il rizoma di Atractylodes lancea (Thunb.)DC.), Fructus Ligustri Lucidi e Coicis Semen. A causa del gran numero di MTC inclusi in questo studio, più screening di database di medicina cinese causeranno confusione nell'elaborazione dei dati. Utilizziamo solo il database di farmacologia dei sistemi di medicina tradizionale cinese (TCMSP), un database più comunemente utilizzato, per lo screening di follow-up. Gli ingredienti chimici di questi TCM sono stati ricercati in TCMSP (aggiornato ad aprile 24,2020) [33]. La somiglianza ai farmaci (DL) e la biodisponibilità orale (OB) sono parametri di screening comunemente utilizzati. I farmaci topici o sistemici sono trattamenti comuni per le malattie della pigmentazione della pelle; pertanto, abbiamo utilizzato solo DL come criterio di screening. Sono stati selezionati complessi eccellenti con DL > 0:18 per aumentare il tasso di successo dei candidati alla droga.

2.1.2. Intersezione tra geni bersaglio di MTC e geni associati alla pigmentazione.

Il set genetico associato apigmentazioneè stato selezionato sulla base del database GeneCards (aggiornato il 24 aprile 2020), dal quale sono stati selezionati i target con punteggio di malattia genetica > 1. Alla fine, sono stati identificati 6180 target relativi alla pigmentazione. L'intersezione tra i geni bersaglio delle MTC ei geni associati alla pigmentazione è stata illustrata utilizzando un diagramma di Venn [34].

2.1.3. Costruzione di un Active Compound-Target-PathwayNetwork.

I principi attivi e i geni bersaglio regolati sono stati selezionati secondo i risultati del diagramma di Venn. La rete è stata costruita utilizzando il software Cytoscape [35] ed è stata utilizzata per indicare la relazione tra i composti attivi di MTC e i geni bersaglio dipigmentazione.Ogni gene bersaglio regolato da un ingrediente attivo in aTCM era considerato un "grado". I parametri topologici di "grado" medi di ciascun TCM sono stati utilizzati per valutare l'importanza dei TCM selezionati. I composti sono stati classificati e i primi cinque MTC sono stati selezionati per le analisi chiave. Inoltre, sono state analizzate informazioni dettagliate sui potenziali principi attivi segnalati per regolare la pigmentazione.

2.1.4. Enciclopedia dei geni e del genoma di Kyoto (KEGG) Analisi dell'arricchimento dei geni bersaglio regolati da MTC potenzialmente efficaci.

I geni bersaglio regolati dai primi cinque MTC sono stati selezionati per determinare i percorsi target KEGG ed esplorare i possibili meccanismi di ingredienti potenzialmente efficaci in questi MTC contropigmentazione.DAVID risorse bioinformatiche 6.8 è stato utilizzato per analizzare l'arricchimento dei percorsi target KEGG. Sono stati caricati i simboli genici dei potenziali bersagli dei principi attivi efficaci. Gli identificatori genici ottenuti sono stati quindi scaricati e inseriti in KOBAS3. È stato selezionato il gene che ha modificatop valori inferiori a 0.05.

2.1.5. Simulazione di aggancio molecolare.

Le strutture 2D di sitogluside, arbutina, nicotinamide, HQ, acido cogico e acido ascorbico sono state ottenute dal database PubChem. Le strutture meccaniche delle piccole molecole sono state ottimizzate utilizzando ChemBio3D Ultra 14.0. La struttura cristallina 3D del fungoTIRO(ID PDB: 2Y9X, coordinate di aggancio: X =-8:87, Y=-30:74 e Z=-41:52) è stato ottenuto dalla banca dati delle proteine ​​( PDB) banca dati [36]. Le strutture cristalline 3D di sei recettori di membrana (recettore u degli oppioidi, ID PDB: 4DKI; recettore della melanocortina 1, ID PDB: 2L1J; recettore dell'endotelina B, ID PDB: 5GLI; recettore adrenergico, ID PDB: 4GBR; recettore della prostaglandina, ID PDB: 6D26 ; recettore del fattore di cellule staminali, ID PDB: 2EC8) sono stati ottenuti dal database PDB. Le strutture proteiche sono state preparate utilizzando gli strumenti AutoDock rimuovendo le molecole d'acqua, aggiungendo idrogeni e creando legami di ordine zero con metalli e legami disolfuro. Infine, sono state eseguite simulazioni di docking molecolare utilizzando AutoDock Vina 1.1.2 [37] e i risultati sono stati analizzati utilizzando PyMoL 1.7.2.1.

2.2. Convalida sperimentale

2.2.1. Sostanze chimiche e anticorpi.

Sitogluside (purezza maggiore o uguale al 98 percento) è stato acquistato da ChemFaces (#CFN98, 713, Chem Faces). Il dimetilsolfossido (DMSO) è stato acquistato da Sigma-Aldrich. La paraformaldeide neutra (4%) è stata acquistata da Biosharp (Hefei, Cina). L'acido kojico, il kit di colorazione Fontana-Masson, il desossicolato di sodio e l'L DOPA sono stati acquistati da Solarbio (Pechino, Cina). Il mezzo Eagle's modificato (DMEM) di Dulbecco è stato acquistato da Gibco (# C11995500BT, Gibco). Il siero fetale bovino (FBS) e il kit per il conteggio cellulare-8 (CCK8) sono stati acquistati da BI (Kibbutz Beit-Haemek, Israele). PMA (12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate, l'attivatore ERK/MAPK) è stato acquistato da APExBIO (#N2060, APExBIO). L'anisomicina (l'attivatore p38/MAPK) è stata acquistata da MedChem Express (HY-18982, MedChemExpress). Anticorpi primari contro la proteina correlata a ras Rab-27A (RAB27A) (#69295,CST), chinasi extracellulare regolata dal segnale (ERK) (#4695,CST), p-ERK (#4370, CST), c- Jun N-terminale chinasi JNK(#9252, CST), p-JNK (#4668, CST), p38 (#8690, CST), p38 (#4511, CST), proteina legante gli elementi di risposta cAMPCREB ( #9107, CST) e p-CREB (#9198, CST) sono stati acquistati da Cell Signaling Technology. Anticorpi primari contro TRP1 (ab235447, Abcam), TRP2 (NBP1-56058, Novusbio), MITF (STJ94134, St. John's Laboratory),TIRO(BS1484, Bioworld) e GAPDH (#AP0066, Bioworld) sono stati acquistati rispettivamente da Abcam, Novusbio, St. John's Laboratory e Bioworld.

2.2.2. Coltura cellulare e trattamento.

MNT1 e B16F0, che sono ricchi di melanosomi, sono ampiamente utilizzati per studiare la melanogenesi [38]. Di conseguenza, queste due linee cellulari sono state scelte per esperimenti successivi. Le cellule MNT1 e B16F0 sono state coltivate in 20% o 10% di siero bovino fetale (BiologicalIndustries, Israele) e 1% di penicillina-streptomicina (Gibco) in DMEM. Tutte le cellule sono state coltivate in un'incubatrice umida a 37 gradi e 5% di CO2. Il sitogluside è stato sciolto in DMSO e la concentrazione finale di DMSO è stata<0.1%. pma="" and="" anisomycin="" were="" separately="" dissolved="" in="" dmso,="" and="" the="" final="" concentration="" of="" dmso="" was=""><>

2.2.3. Coltivazione e trattamento del pesce zebra.

Il mezzo di coltura embrione di pesce zebra è stato acquistato da EzeRinka Biotech (Nanchino, Cina). Il protocollo sperimentale è stato approvato dal Comitato Etico del Terzo ospedale Xiangya della Central South University (n. 2021-S137). Il primo giorno dopo la schiusa, il pesce zebra è stato allevato in una 12-piastra a pozzetti (10 perwell), protetto dalla luce e coltivato a 37 gradi. Il pesce zebra è stato trattato con diverse concentrazioni di sitogluside e sono state scattate fotografie utilizzando un microscopio invertito a intervalli di 24 ore per registrare i cambiamenti di melanina nelle code del pesce zebra. Dopo che sono state scattate le immagini, sono state lette e registrate soluzioni di sitogluside a diverse concentrazioni in modo continuo per una settimana.

2.2.4. Vitalità cellulare.

La vitalità cellulare è stata valutata utilizzando un CCK8.MNT1 e le cellule B16F0 sono state piastrate in 96-piastre di pozzetti a un'addensità di 2000 cellule/pozzetto o 500 cellule/pozzetto. Le cellule sono state trattate con diverse concentrazioni di sitogluside (25, 50,100, 200, 400, 600 e 800 μM). Dopo 24 ore o 48 ore, a ciascun pozzetto sono stati aggiunti 10 μL di reagente CCK8 e le cellule sono state incubate a 37 gradi per 1 ora. Quando il colore del mezzo è diventato arancione, la coltura è stata terminata ed è stato utilizzato un lettore di micropiastre (PerkinElmer EnVision Xcite, Regno Unito) per misurare l'assorbanza a 490 nm.

2.2.5. Colorazione melanina Fontana-Masson.

Le cellule sono state coltivate in una 6-piastra a pozzetti e trattate con diverse concentrazioni di sitogluside per 2 giorni e l'acido cogico come controllo positivo è stato aggiunto a 200 μM. Le cellule sono state quindi poste in paraformaldeide al 4% per 15 minuti. Dopo il risciacquo con acqua, le cellule sono state incubate con una soluzione di ammoniaca e argento Fontana per 24 ore in una camera buia, risciacquate con acqua e quindi poste in iposolfito per altri 5 minuti. Un microscopio invertito è stato utilizzato per osservare la melanina.

2.2.6. Esperimento di recupero delle funzioni.

La PMA, come attivatore riconosciuto di ERK/MAPK [39, 40], è stata testata per la citotossicità attraverso l'esperimento CCK8 a diverse concentrazioni (6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 e 800 ng/mL) per 24 ore. E dopo che le cellule MNT1 e B16F0 sono state trattate con diverse concentrazioni (25, 50 e 100 ng/mL) di PMA per 2 ore, il livello di fosforilazione di ERK è stato rilevato dall'esperimento di westernblotting. Alla concentrazione selezionata, le cellule sono state trattate con 0, 1, 2, 4, 6 e 8 ore per rilevare il tempo effettivo di attivazione. Dopo che le cellule sono state trattate con sitogluside (200 μM) e PMA (25 ng/mL) per 48 ore (ritirate ogni 8 ore), i livelli proteici diTIROep-ERK sono stati rilevati. La colorazione della melanina Fontana-Masson ha rilevato il contenuto di melanina. L'anisomicina [41] è l'attivatore di p38/MAPK, la cui concentrazione di esplorazione è 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256 e 512 nM, e gli altri metodi sperimentali sono gli stessi della PMA.

2.2.7. Misurazioni dell'attività TYR.

Le cellule sono state trattate con diverse concentrazioni di sitogluside per 2 giorni. Dopo la digestione e la centrifugazione, le cellule sono state contate e risospese due volte in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Successivamente, a ciascun campione sono stati aggiunti 500 μL di soluzione di desossicolato di sodio allo 0,5%. I campioni sono stati incubati a 4 gradi per 10 minuti e poi a 37 gradi per 15 minuti. È stato aggiunto 1 ml di soluzione di L-DOPA all'1%, dopodiché 200 μL sono stati immediatamente pipettati in una 96-piastra a pozzetti. Successivamente, è stato utilizzato un lettore di piastre multimodale per misurare i valori di assorbanza (A0) a 475 nm e la misurazione è stata ripetuta dopo 30 minuti (A30).TIROl'attività è stata calcolata come (A{0}}A0)/numero di cella.

2.2.8. Sonda di attività TYR.

Una sonda a fluorescenza nel vicino infrarosso perTIROl'attività basata sulla resorufina è stata utilizzata per visualizzare l'attività nelle cellule viventi, come descritto in precedenza [42]. In breve, le cellule MNT1 e B16F0 sono state coltivate in una 6-piastra a pozzetti e trattate con diverse concentrazioni di sitogluside per 2 giorni . È stata aggiunta una sonda di fluorescenza da 10 μM e dopo 4 ore le cellule sono state sostituite con PBS. Dopo che la luce rossa è stata eccitante, è stato immediatamente utilizzato un microscopio fluorescente invertito per scattare foto.

2.2.9. Estrazione proteica e Western Blotting.

Dopo che le cellule sono state trattate con diverse concentrazioni di sitogluside per 2 giorni, la proteina cellulare totale è stata estratta utilizzando il RIPA Lysis Buffer (Thermo Fisher) e i cocktail di inibitori della proteasi e inibitori della fosfatasi (Roche). La concentrazione proteica è stata determinata utilizzando un kit di analisi delle proteine ​​BCA (KeyGEN Biotec). Dopo il blocco con l'1% di BSA, gli anticorpi primari controTIRO, MITF, TRP1, TRP2, RAB27A,CREB, p-CREB, ERK, p-ERK, JUK, p-JUK, p38 e p-p38 sono stati incubati con le membrane per una notte a 4 gradi at1: 1000 e GAPDH a 1: 3000 Le membrane sono state lavate con TBS-T e incubate con anticorpo secondario di capra anti-coniglio a 1: 3000 per 1 ora. L'anticorpo legante è stato rilevato mediante elettrochemiluminescenza (ECL).

2.2.10. Analisi statistica.

Il software SPSS22.{1}} è stato utilizzato per l'analisi statistica e il test t di Student o l'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA) è stato utilizzato per confronti di più gruppi. Il test U di Mann-Whitney è stato utilizzato per i dati non parametrici. p < 0:05="" in="" tutti="" i="" casi="" è="" stato="" considerato="" statisticamente="" significativo.="" ∗∗∗p="">< 0:001,="" ∗∗p="">< 0:01="" e="" ∗p=""><>

3. Risultati

3.1. Ingredienti compositi di MTC.

Sono state studiate quattordici MTC, registrate nella Ben-Cao-Gang-Mu e nelle prescrizioni popolari, con effetti anti-pigmentazione. Un totale di 372 ingredienti della medicina cinese dai 14 MTC sono stati recuperati dal database TCMSP (tabella supplementare S1).

3.2. Geni bersaglio regolati da MTC e geni di pigmentazione correlati.

Secondo il sistema di previsione del bersaglio nel database TCMSP, sono stati ottenuti un totale di 834 geni bersaglio dai 14 TCM. Un totale di 9431 geni correlati apigmentazionesono stati recuperati dal database GeneCards, di cui 6180 sono stati selezionati e avevano un punteggio di rilevanza > 1.

3.3. Classifica di 14 MTC e del Disease-Compound-TargetNetwork.

Utilizzando il software Cytoscape, abbiamo preso l'intersezione dei geni regolatori di ciascuna MTC e dei geni correlati alla pigmentazione e ottenuto i potenziali principi attivi e geni bersaglio comuni. Successivamente, la rete target del composto della malattia tra TCM epigmentazionefu costruito. Sulla base di ciò, abbiamo ottenuto il "grado" medio di ciascun ingrediente attivo e classificato i MTC in base ai loro punteggi. Secondo i punteggi della classifica, le prime 5 erbe erano Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones e Paeoniae Radix Alba (Figura 2(a)). Attraverso l'analisi KEGG di 220 geni bersaglio delle prime 5 MTC, il 19,3% dei geni era ricco nella via di segnalazione PI3K-Akt, il 13,6% dei geni era correlato alla via di segnalazione del TNF e circa il 12,3% dei geni era correlato a IL{{ 12}}. Inoltre, 37 geni erano coinvolti nel percorso MAPK e 28 geni erano coinvolti nel percorso HIF-1. Questi percorsi sono strettamente correlati alla regolazione del metabolismo della melanina e al fotoinvecchiamento cutaneo. Tra le prime 20 vie di segnalazione arricchite, le vie relative all'infiammazione rappresentavano un quarto di queste (Figura 2 (c)). Le figure 2(d)–2(h) illustrano la rete bersaglio del composto della malattia tra Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones, Paeoniae Radix Alba e pigmentazione, rispettivamente. Secondo il diagramma di Venn degli ingredienti nei primi cinque MTC, abbiamo scoperto che quattro MTC contenevano sitogluside e beta-sitosterolo (Figura 2 (b), tabella supplementare S2).

3.4. Potenziali ingredienti attivi nell'inibire la pigmentazione.

Secondo la rete dell'obiettivo dei composti della malattia, 148ingredienti si riferivano apigmentazionesono stati ottenuti da 14TCM. Attraverso una ricerca bibliografica, 25 dei 148 ingredienti sono stati segnalati per inibire la melanogenesi. Quattro principi attivi sono stati segnalati come estratti vegetali che inibiscono la melanogenesi. Sono stati studiati quattordici principi attivi e i loro derivati ​​sono stati segnalati per regolare la pigmentazione. È interessante notare che quattro ingredienti hanno dimostrato di promuovere la melanogenesi, mentre il meccanismo di sei ingredienti nella regolazione della melanogenesi non è ancora chiaro. I restanti 95 potenziali ingredienti medicinali cinesi non sono stati ancora esplorati per la regolazione della pigmentazione. Informazioni dettagliate su questi ingredienti sono fornite nella tabella supplementare S3.

3.5. Effetti in vitro e in vivo del sitogluside sulla melanogenesi.

Dopo il processo di screening di cui sopra, abbiamo scoperto che quattro MTC nei primi MTC contenevano sitogluside e -sitosterolo. -È stato segnalato che il sitosterolo inibisce l'ormone stimolante i melanociti ( -MSH), stimolando la melanogenesi attraverso la via di segnalazione p38 nelle cellule di melanoma B16F10 [43]. Tuttavia, non sono stati riportati gli effetti anti-pigmentazione del sitogluside e del suo meccanismo specifico. Pertanto, abbiamo scelto sitogluside come farmaco candidato per questi studi. Il test CCK8 è stato eseguito per esplorare le potenziali concentrazioni tossiche di sitogluside nelle cellule MNT1 e B16F0. I risultati hanno mostrato che sitogluside non ha avuto effetti evidenti sulla proliferazione delle cellule (Figure 3 (a) e 3 (b)) a concentrazioni inferiori a 400 μM. La colorazione della melanina condotta utilizzando 25, 50, 100 e 200 μMsitogluside ha mostrato che sitogluside può ridurre contenuto di melanina nelle cellule MNT1 e B16F0 in modo dose-dipendente (Figura 3 (c)). Inoltre, il trattamento con sitogluside ha inibito significativamente la pellepigmentazionein zebrafish in un modo tempo e dose-dipendente (Figura 3 (d)). Questi risultati hanno suggerito che il sitogluside ha inibito la melanogenesi in vitro e in vivo.

3.6. Effetti del sitogluside sull'espressione TYR.

Dai risultati precedenti, il sitogluside può ridurre efficacemente il contenuto di melanina, ma come regoli questo processo è ancora sconosciuto e quindi interessante. Il western blotting è stato eseguito per rilevare l'espressione dei geni correlati alla melanogenesi (TYR,MITF, TRP1, TRP2 e RAB27A) a livello proteico. I risultati delle analisi hanno dimostrato che l'espressione di TYR era significativamente sottoregolata e le espressioni di MITF e TRP1 erano moderatamente sottoregolate dopo il trattamento con sitogluside (Figura 4(a)). Poiché MAPK e PKA sono le vie di segnalazione chiave a monte che regolano TYR, abbiamo ulteriormente esplorato i cambiamenti nelle proteine ​​​​chiave in queste due vie. Dopo che le cellule MNT1 e B16F0 sono state trattate con sitogluside per 2 giorni, i livelli di fosforilazione di ERK e P38 erano significativamente sottoregolati , considerando che non ci sono stati cambiamenti significativi nei livelli totali di CREB, ERK, JNK e proteine ​​p38 o nei livelli di fosforilazione di JNK e CREB (Figura 4 (b), Figura S1A). Secondo i risultati dell'esperimento CCK8, abbiamo scoperto che la PMA inferiore a 100 ng/mL non è tossica per entrambe le cellule (Figura S1B) e la PMA a 25 ng/mL può ovviamente aumentare il livello di fosforilazione di ERK. Il livello di fosforilazione di ERK è diminuito gradualmente dopo 4 ore (Figura S1C-D). Attraverso la colorazione della melanina Fontana-Masson, abbiamo scoperto che la PMA può aumentare significativamente il contenuto di temalanina delle cellule MNT1 e B16F0. I risultati del westernblotting suggeriscono anche che la PMA può sovraregolare il livello di fosforilazione di ERK e il sitogluside può ridurre il livello di fosforilazione di ERK sovraregolato dalla PMA. Inibendo il livello di fosforilazione di ERK e riducendo il livello proteico diTIRO, sitogluside riduce il contenuto di melanina aumentato da PMA (Figure 4 (c) e 4 (e), Figura S2A). Allo stesso tempo, abbiamo scoperto che l'anisomicina ha risultati simili. L'anisomicina al di sotto di 8 nM non è tossica per entrambe le cellule e l'anisomicina a 2 nM può aumentare significativamente il livello di fosforilazione di p38. A 8 ore, il livello di fosforilazione di p38 è ancora elevato (Figura S1B, Figura S1E-F). I risultati della colorazione della melanina e del western blotting di Fontana-Masson suggeriscono anche che il sitoglusidecan inibisce il livello di fosforilazione di p38 sovraregolato dall'anisomicina, riducendo il contenuto della proteina TYR e inibendopigmentazione(Figure 4 (d) e 4 (f), Figura S2B). Pertanto, il sitogluside può ridurre l'espressione di TYR inibendo le vie ERK/MAPK e p38/MAPK. Tuttavia, il meccanismo con cui sitogluside inibisce queste vie di segnalazione rimane poco chiaro. Abbiamo tracciato i recettori di membrana a monte di queste vie di segnalazione e abbiamo utilizzato l'aggancio molecolare per esplorare il meccanismo di regolazione delle vie a valle. Le energie di legame tra il sitogluside e i sei recettori di membrana, vale a dire l'oppioide u, la melanocortina 1, il fattore delle cellule staminali, l'endotelina B, i recettori adrenergici e della prostaglandina erano -7.8,{7}}.8, {{9 }}.5, -5.4, -3.4 e 0 kal/mol, rispettivamente. Attraverso l'aggancio molecolare, abbiamo scoperto che tra i recettori a sei membrane, il sitogluside aveva affinità molto elevate con l'oppioide u, la melanocortina 1 e i recettori del fattore di crescita delle cellule staminali (Figura 4 (g)). Ipotizziamo che il sitogluside possa inibire le vie ERK/MAPK e p38/MAPK legandosi ai suddetti recettori di membrana, sottoregolando così l'espressione di TYR.

3.7. Effetto del sitogluside sull'attività TYR.

DaTIROè l'enzima chiave nella sintesi della melanina, è l'obiettivo più importante per inibire la melanogenesi. La maggior parte dei cosmetici o degli agenti schiarenti per la pelle disponibili in commercio, come HQ, arbutina e acido kojico, sono inibitori del TYR. Abbiamo utilizzato sitogluside e alcuni clinicamente utilizzatisbiancamento della pelleagenti (arbutina, nicotinamide, acido cogico, HQ e acido ascorbico) per condurre l'aggancio molecolare con TYR. Le dettagliate interazioni tra sitogluside ei suddetti agenti conTIROsono mostrati nella Figura 5(a). Le energie di legame di questi sei composti erano -6.2, -6.4, -5.6, -5.7, -5.4 e{{ 11}}.4 kcal/mol, rispettivamente. Si ritiene generalmente che quando l'energia di affinità è -4, indichi una forza di legame e quando è maggiore o uguale a -7.0, indichi una forza di legame forte. La parte di Sitoglu si è classificata seconda per affinità, leggermente più debole dell'arbutina, esibendo una capacità di combinazione relativamente eccezionale.

Allo stesso tempo, è stato utilizzato un esperimento di conversione della L-DOPA per rilevare l'attività di TYR, utilizzando l'acido cogico come controllo positivo. I risultati hanno mostrato che il sitogluside ha inibito l'attività TYR nelle cellule MNT1 e B16F0 in modo dipendente dalla concentrazione e il gruppo ad alta concentrazione (200 μM) ha mostrato un effetto inibitorio equivalente a quello mostrato da 200 μM kojic acido (Figure 5(b) e 5(c)). Inoltre, i risultati dell'esperimento della sonda TYR hanno mostrato che quando la concentrazione di sitogluside aumentava, l'intensità della fluorescenza diminuiva gradualmente nelle cellule e l'intensità della fluorescenza del gruppo ad alta concentrazione era vicina a quella di 200 μM di acido cogico nelle cellule MNT1 e B16F0 (Figura 5 (d), figura S2C). Questi risultati indicano che il sitogluside può inibire efficacementeTIROattività nelle celle MNT1 e B16F0. Inoltre, ipotizziamo che il sitogluside, un composto sterolo naturale, possa penetrare direttamente nella membrana cellulare e legarsi al TYR e inibirne l'attività, inibendo così la melanogenesi.

4. Discussione

In questo studio, abbiamo utilizzato la farmacologia di rete per esplorare i meccanismi del potenzialesbiancamento della pelleingredienti trovati in 14 MTC, documentati nelle prescrizioni Ben-Cao-Gang-Mu e infolk, nell'inibirepigmentazione. Lo studio ha anche proposto un metodo innovativo che utilizza il parametro topologico medio di "grado" di ciascun ingrediente attivo per valutare la potenziale efficacia delle erbe. Secondo il "grado" medio, sono stati selezionati Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarummultijugum Maxim., Ampelopsis japonica, PseudobulbusCremastrae Seu Pleiones e Paeoniae Radix Alba, e attraverso l'analisi di arricchimento KEGG dei geni regolati da questi cinque MTC, è stato inaspettato che il 25 per cento degli arricchiti le vie di segnalazione erano correlate all'infiammazione, comprese le vie di segnalazione di IL-17, TNF, HIF-1, PI3K-Akt e MAPK.

Recentemente, è stato dimostrato che una varietà di mediatori dell'infiammazione attivano o inibiscono le vie di segnalazione legate alla melanogenesi che promuovono o inibiscono la pellepigmentazione[6]. Cellule di melanoma B16F10 in coltura, TNF- hanno ridotto l'espressione diTIROe l'attività di TRP1 e TYR in modo dose-dipendente [44]. IL-17 e il TNF- possono ridurre l'espressione dei geni correlati alla melanogenesi nei melanociti e IL-17 può aumentare significativamente l'effetto inibitorio del TNF- sulla melanogenesi. Dopo il trattamento con etanercept (anti-TNF), i geni correlati alla melanogenesi erano significativamente sovraregolati nelle lesioni cutanee dei pazienti con psoriasi[45]. È stato segnalato che HIF-1, un potente fattore di trascrizione che regola la risposta infiammatoria, è coinvolto nella regolazione di fattori come IL-17 e TNF- [46–48]. Pertanto, è probabile che HIF-1 partecipi alla regolazione della melanogenesi influenzando l'infiammazione. Altre citochine come IL-18, IL-33, GM-CSF e IL-1 può promuovere la melanogenesi attivando PKA, MAPK o altre vie di segnalazione, mentre IFN-, IL-1, IL-4 e IL-6 riducono la melanogenesi inibendo STAT1, NF-κB, e le vie di segnalazione JAK2-STAT6 [6]. I nostri risultati suggeriscono che i primi cinque MTC (Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones e Paeoniae Radix Alba) possono esercitare un effetto anti-pigmentazione principalmente attraverso vie antinfiammatorie. La letteratura precedente ha anche menzionato che queste prime cinque MTC hanno potenti effetti antinfiammatori e antietà [49, 50]. Ciò supporta anche la nostra congettura che le MTC possano svolgere un ruolo non trascurabile nella pigmentazione postinfiammatoria.

Durante l'analisi della letteratura di 148 ingredienti trovati in 14 MTC, abbiamo anche scoperto che tra 35 degli ingredienti riportati, quasi il 70% di essi è stato confermato per ridurre il contenuto di melanina o inibire l'attività TYR. Ciò non solo conferma che le registrazioni delle prescrizioni di sbiancamento della pelle nei libri antichi sono ampiamente affidabili, ma mostra anche che il riferimento alla letteratura antica è un metodo affidabile per ottenere la conoscenza delle MTC. Ci sono ancora 95 composti che rimangono inesplorati, che hanno il potenziale per resisterepigmentazione. Attraverso l'analisi dei diagrammi di Venn dei primi cinque MTC, sono stati ottenuti 13 ingredienti comuni. Tra questi, esperimenti in vitro hanno confermato che daidzeina, rutina e (più)-catechina possono ridurre il contenuto di melanina [51-53]. Il saccarosio disturba la corretta maturazione del melanosoma inducendo stress osmotico e inibendo la via della PI3 chinasi, interferendo così con la melanogenesi [54]. La quercetina riduce la melanogenesi indotta da stress ossidativo [55]. Inoltre, metodi chimici e fisici come analisi spettroscopiche e di attività struttura hanno confermato che il lupeoland kaempferol può inibireTIROe ridurre la melanogenesi[56, 57]. Ciò indica che la farmacologia di rete forse è un metodo fattibile per scavaresbiancamentoingredienti. Quattro TCM tra i primi cinque MTC contenevano sitogluside e non ci sono rapporti sul fatto che il sitogluside regoli la pigmentazione o il suo meccanismo correlato. Pertanto, abbiamo scelto sitogluside per questi studi.

È stato riportato che il sitogluside, un glicoside sterolico ampiamente presente nelle piante, esercita effetti antitumorali, antiossidanti e neuroprotettivi [58-60]. In questo studio, abbiamo scoperto che il sitogluside riduceva efficacemente il contenuto di melanina in vitro e in vivo. Esperimenti successivi hanno dimostrato che potrebbe ridurre significativamente l'espressione di TYR. L'acido kojico è stato utilizzato come controllo positivo e può anche inibire i livelli proteici dei geni correlati alla melanogenesi come TYR, MITF e TYRP1 sotto stimolazione -MSH, che è stato segnalato da Jeon et al. [61]. Data l'assenza di stimolazione esogena, l'acido kojico 200 μM ha avuto solo effetti inibitori moderati sull'espressione genica nel nostro studio, ma poiché il kojicacid ha una grande attività inibitoria della tirosinasi, lo usiamo ancora come controllo positivo in questo studio. È stato riportato che l'espressione di TYR è regolata direttamente o indirettamente dai percorsi MAPK o PKA, rispettivamente. È stato confermato che un numero crescente di ingredienti ha un effetto sbiancante sulla pelle inibendo la via di segnalazione MAPK. Ad esempio, la fargesina riduce l'espressione diTIROinibendo la via P38/MAPK [62]. I polisaccaridi del Ganoderma lucidum possono resistere alla melanogenesi indotta da UVB sottoregolando la via MAPK [63]. Il nostro studio ha scoperto che il sitogluside, a una concentrazione di 200 μM, aveva il potenziale per ridurre l'espressione di TYR inibendo le vie di segnalazione ERK/-MAPK e P38/MAPK. Ciò è stato riportato attraverso l'aggancio molecolare tra i recettori di membrana a monte delle vie MAPK [64] e il sitogluside. Abbiamo scoperto che il sitogluside si lega fortemente ai recettori oppioidi u, melanocortina 1 e fattore di crescita delle cellule staminali. Pertanto, ipotizziamo che il sitogluside possa interagire con questi recettori di membrana, inibire le vie di segnalazione ERK/MAPK e P38/MAPK e ridurre l'espressione di TYR.

Poiché il TYR è l'enzima chiave nella sintesi delle particelle di melanina nei melanociti, l'inibizione dell'attività del sito catalitico del TYR è essenziale per ridurre la pellepigmentazione[65]. Molti agenti schiarenti per la pelle sul mercato sono inibitori della TYRactivity, come HQ, arbutina e acido cogico. In questo studio, abbiamo utilizzato l'aggancio molecolare per esplorare gli effetti vincolanti del sitogluside e cinque comunisbiancamento della pelleprincipi attivi (arbutina, nicotinamide, acido cogico, HQ, acido andascorbico) [66] conTIRO. I risultati hanno mostrato che il sitogluside aveva una forte affinità di legame con TYR, più debole della thanarbutina, ma più forte dell'acido cogico, della nicotinamide, dell'HQ e dell'acido andascorbico. L'arbutina è un profarmaco di HQ e un prodotto naturale che può ridurre o inibire la sintesi della melanina inibendo il TYR. Tuttavia, la forma naturale di arbutina è chimicamente instabile e può convertirsi in HQ, che viene catalizzato e metabolizzato in metaboliti del benzene con potenziale tossicità per il midollo osseo [67]. L'uso di incosmetici a base di acido cogico è limitato a causa della sua cancerogenicità e instabilità durante la conservazione [68]. Pertanto, si prevede che il sitogluside, un composto sterolo naturale derivato da una varietà di piante, agisca come un potente agente schiarente per la pelle. Tuttavia, la solubilità del sitogluside nel DMSO è bassa, il che è anche un difetto di questo ingrediente naturale. La successiva verifica sperimentale ha rivelato che il sitogluside è sicuro nelle linee cellulari MNT1 e B16F{5}} e il gruppo a bassa concentrazione ha avuto un buon effetto inibitorio sull'attività TYR, mentre il gruppo ad alta concentrazione ha avuto lo stesso effetto della stessa concentrazione di acido cogico. Pertanto, il sitogluside può essere utilizzato terapeuticamente come regolatore dello sbiancamento cutaneo, che non solo riduce l'espressione di TYR ma ne inibisce anche l'attività (Figura 6).

5. Conclusioni

La farmacologia di rete è forse uno strumento efficace per la scoperta dei principi attivi naturali che riducono la pigmentazione cutanea e dei loro possibili meccanismi. Fructus LigustriLucidi, Hedysarum multijugum maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones e PaeoniaeRadix Alba hanno un potenzialesbiancamento della pelleproprietà e possono inibirepigmentazioneregolando l'infiammazione. Sitogluside è un romanzosbiancamento della pelleprincipio attivo con duplice effetto regolatorio, vale a dire. inibendoTIROespressione e attività.

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