Esame della variazione diurna e delle differenze sessuali nella neurofisiologia dell'ippocampo e nella memoria spaziale, parte 3

Per esaminare le differenze di sesso e ora del giorno, abbiamo stratificato il nostro set di dati in base alla regione dell'asse antero-posteriore seguita da ANOVA fattoriale a tre vie. Abbiamo scoperto che il sesso non ha avuto effetti significativi su diversi potenziali d'azione generati in risposta alle iniezioni di corrente depolarizzante nelle cellule registrate da fette anteriori (p=0.321, effetto principale del sesso, RM-ANOVA a tre vie) o posteriori (p=0.568, effetto principale del sesso, RM-ANOVA a tre vie); pertanto, i dati di entrambi i sessi sono stati raggruppati per l'analisi finale.

La memoria è una parte molto importante del nostro percorso di vita. Non solo facciamo affidamento sulla memoria per apprendere nuove conoscenze, ma ne abbiamo anche bisogno per aiutarci a risolvere problemi e prendere decisioni.

Tuttavia, la nostra comprensione dei meccanismi è insufficiente. Le cellule sono gli elementi costitutivi di base del nostro corpo, quindi come si relazionano con la memoria? Le cellule svolgono un ruolo fondamentale nella memoria.

Innanzitutto, la segnalazione intracellulare è la base della nostra memoria. Durante la memoria e l'apprendimento, le cellule nervose modificano la connessione tra i neuroni per formare nuove reti neurali. Questo cambiamento si ottiene attraverso i neurotrasmettitori inclusi neurotrasmettitori e neuropeptidi. Neurotrasmettitori e neuropeptidi trasportano queste informazioni attraverso le sinapsi alle cellule bersaglio. Pertanto, la trasmissione del segnale intracellulare è una parte importante del nostro processo di apprendimento e memoria.

In secondo luogo, anche la qualità e la quantità delle cellule possono influenzare la nostra memoria. Se non abbiamo abbastanza cellule nel nostro corpo, ci sentiamo stanchi e abbiamo una memoria debole. Inoltre, la ricerca mostra che lo stato nutrizionale delle cellule può influenzare anche l’apprendimento e la memoria. Nuovi risultati di ricerca mostrano che gli alimenti contenenti acidi grassi omega-3 possono migliorare la qualità e la quantità delle cellule nervose.

Inoltre, le nostre cellule possono influenzare la memoria anche attraverso il movimento fisico. L’esercizio fisico può promuovere la nuova generazione di cellule nervose, migliorando così la nostra memoria. L'esercizio rilascia fattori neurotrofici, sostanze che stimolano la rigenerazione delle cellule nervose e la formazione di connessioni sinaptiche.

In sintesi, le cellule sono la base della nostra memoria e sono influenzate dalla nostra vita quotidiana. Nella nostra vita quotidiana, possiamo promuovere il miglioramento della memoria evitando il fumo e l'abuso di alcol, mantenendo uno stile di vita sano, consumando cibi contenenti acidi grassi omega-3 e impegnandoci in esercizi adeguati, rendendo i nostri ricordi più chiari e felici. Si può vedere che dobbiamo migliorare la nostra memoria. La Cistanche deserticola può migliorare significativamente la memoria perché la Cistanche deserticola è un materiale medicinale tradizionale cinese con molti effetti unici, uno dei quali è quello di migliorare la memoria. L'efficacia della carne macinata deriva dai vari principi attivi che contiene, tra cui acidi, polisaccaridi, flavonoidi, ecc. Questi ingredienti possono favorire la salute del cervello in vari modi.

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Le cellule anteriori registrate di notte hanno sparato più potenziali d'azione rispetto a quelle registrate durante il giorno (p=0.046, l'effetto principale dell'RMANOVA a due vie dell'ora del giorno; Fig. 7B). Tuttavia, le cellule posteriori mostravano una differenza nostatistica giorno-notte nel numero di potenziali d'azione attivati ​​(p=0.484, l'effetto principale dell'ora del giorno, RM-ANOVA a due vie; Fig. 7E).

L'esame del potenziale di membrana di base non ha rivelato differenze nel sesso o nell'ora del giorno nelle cellule registrate dalle fette anteriori (p=0.572 e 0.535, effetti principali del sesso e dell'ora del giorno , rispettivamente, ANOVA a due vie; Fig. 7C). Tuttavia, i potenziali di membrana delle cellule registrate dalle fette posteriori durante la notte erano più depolarizzati rispetto a quelli registrati durante il giorno, indipendentemente dal sesso (p= 0.044, l'effetto principale dell'ANOVA a due vie in base all'ora del giorno; Fig .7F).

Abbiamo esaminato 15 proprietà aggiuntive della membrana, comprese le proprietà del potenziale d'azione del potenziale d'azione singolo suscitato dall'iniezione di corrente di reobase, dall'abbassamento e dalla resistenza di ingresso (Tabella 1). È stato osservato un effetto significativo del tempo di crescita del potenziale d'azione tra sesso e potenziale d'azione nei neuroni anteriori (maschio:0.295 6 0.01 ms, femmina: 0.275 6 0.01 ms; p=0.047, ANOVA a due vie). Nessun altro parametro ha raggiunto significatività statistica (tabella dati estesa 1-1).

Dato che l'attivazione del potenziale d'azione e il potenziale di membrana sono entrambe misure dell'eccitabilità neuronale, possiamo concludere che i neuroni piramidali CA1 attraverso il circuito dell'ippocampo sono complessivamente più eccitabili di notte, ma i meccanismi alla base di questo aumento notturno dell'eccitabilità possono variare lungo l'asse antero-posteriore dell'ippocampo.

Le differenze giorno-notte nella neuroneccitabilità piramidale CA1 non sono intrinseche

Poiché la variazione giorno-notte osservata nell'eccitabilità potrebbe essere guidata da fattori sinaptici e/o intrinseci, abbiamo nuovamente valutato l'eccitabilità in una coorte separata di animali in presenza di antagonisti sinaptici (CPP, NBQX, GBZ) per isolare il neurone piramidale CA1 dal circuito .In queste condizioni, non abbiamo riscontrato alcun effetto significativo dell'ora del giorno nel numero di potenziali d'azione generati in risposta alle iniezioni di corrente depolarizzante nelle cellule registrate sia dalle fette anteriori che da quelle posteriori (p=0.933 per anteriore e p { {6}}.569 per l'effetto principale posteriore dell'ora del giorno, RM-ANOVA a due vie; Fig. 8A, D).

Inoltre, i potenziali di base in queste condizioni non erano influenzati dall'ora del giorno o dal sesso nelle cellule registrate da entrambe le parti anteriori (p=0.896 e 0.888, effetto principale del sesso e dell'ora del giorno, rispettivamente, ANOVA a due vie; Fig. 8B) o fette posteriori (p {{10}}.999 e 0,702, effetto principale del sesso e dell'ora del giorno, rispettivamente, ANOVA a due vie; Fig. 8E). Sono state studiate ulteriori proprietà della membrana in presenza di antagonisti sinaptici, comprese le proprietà dei potenziali d'azione dei singoli potenziali d'azione suscitati dall'iniezione di corrente di reobase, dall'abbassamento e dalla resistenza di ingresso (Tabella 2).

Sia l'iperpolarizzazione del potenziale ad azione rapida che quella a potenziale d'azione medio (fAHP e mAHP) erano maggiori durante il giorno (fAHP: 5,776 0,74 mV, mAHP: 9,296 0,65 mV), rispetto alla notte nella parte anteriore neuroni (fAHP: 4,08 6 0,51 mV,mAHP: 7,06 6 0,59 mV; p=0,044 e 0,024 per fAHPe mAHP, a due vie ANOVA; Tabella 2). Nei neuroni anteriori, fAHP era maggiore nei maschi (5,827 6 0,56 mV) rispetto alle femmine (3,98 6 0,58 mV; p=0,034, ANOVA a due vie; Tabella 2). Nessun altro parametro nei neuroni anteriori o posteriori ha raggiunto la significatività statistica (Tabella dei dati estesi 1-1).

Nel complesso, l'assenza di un aumento della neuronaleccitabilità notturna (potenziale di membrana e velocità di attivazione del potenziale d'azione) in presenza di antagonisti sinaptici suggerisce che le differenze diurne nell'input sinaptico veloce eccitatorio e/o inibitorio contribuiscono almeno parzialmente all'aumento notturno dell'eccitabilità.

Discussione

Qui abbiamo esaminato gli effetti del sesso e dell'ora del giorno su molteplici aspetti della fisiologia dell'ippocampo, dal comportamento alla fisiologia neuronale individuale. Dimostriamo che l'ora del giorno influisce sull'apprendimento spaziale e sulla memoria, sull'entità dell'LTP, sull'inibizione sinaptica sui neuroni piramidali CA1 e sull'eccitabilità neuronale piramidale CA1. Abbiamo scoperto che il sesso era più influente sulle differenze giorno-notte nelle prestazioni OLM, mentre il suo effetto sulla trasmissione sinaptica, sull'entità dell'LTP e sull'eccitabilità neuronale era sottile o completamente assente. Inoltre, abbiamo scoperto che la posizione lungo l'asse antero-posteriore ha un impatto significativo in modo eccitabile sui neuroni piramidali CA1. Questi risultati illustrano la complessità della rete ippocampale e l’importanza di considerare fattori come il sesso e l’ora del giorno negli studi futuri.

Mentre i ritmi circadiani regolano l’LTP e l’apprendimento e la memoria dipendenti dall’ippocampo, il ruolo delle differenze sessuali e diurne in questi processi era precedentemente sconosciuto. Sorprendentemente, abbiamo scoperto che i ritmi circadiani regolano le prestazioni della memoria dipendenti dall'ippocampo in modo dipendente dal sesso. I topi maschi hanno ottenuto risultati migliori nell'attività OLM di notte, come riportato in precedenza (Takahashi et al., 2013; Snider et al., 2016). I topi femmina, invece, si comportavano meglio durante il giorno. Non è chiaro il motivo per cui i topi femmine abbiano prestazioni migliori durante il periodo inattivo, ma una possibile spiegazione potrebbe essere il ciclo estrale, che non è stato controllato nel presente studio.

Mentre sono necessarie ulteriori ricerche sulle femmine che pedalano naturalmente per trarre conclusioni definitive sull'impatto specifico del ciclo estrale sulla memoria spaziale dipendente dall'ippocampo, studi sui ratti hanno scoperto che le femmine in proestro ed estro hanno sovraperformato quelle in diestro nei compiti di riconoscimento e posizionamento degli oggetti (Frye et al. ., 2007; Parigi e Frye, 2008). In effetti, i livelli di estrogeni influiscono sulle prestazioni nei compiti di memoria ippocampo-dipendenti e la somministrazione di estradiolo esogeno migliora le prestazioni nei compiti di memoria ippocampo-dipendenti (Luine et al., 2003; Li et al., 2004; Phan et al., 2012; Vedder et al., 2013, 2014; Tuscher et al., 2015). Comprendere come il ciclo estrale e il ciclo circadiano convergono per modulare la cognizione nelle femmine sarà un argomento interessante e importante per la ricerca futura.

È interessante notare che abbiamo scoperto che questi effetti sessuali sulle differenze diurne nelle prestazioni OLM non si estendono alla regolazione diurna dell'LTP, che è considerato un correlato cellulare dell'apprendimento e della memoria. È importante notare che i tempi CT e ZT utilizzati nei due esperimenti non erano perfettamente speculari. I test OLM sono stati condotti nel mezzo dei periodi soggettivi diurno e notturno in costante oscurità (CT quattro e CT 16), come adattato da (Snider et al., 2016), mentre gli esperimenti di elettrofisiologia hanno esaminato le prime ore del giorno e le prime ore della notte in un ciclo LD (ZT 1–6 e ZT 12–18).

Tuttavia, questa scoperta alquanto inaspettata potrebbe essere un esempio di come lo stesso processo fisiologico (LTP) possa essere utilizzato per ottenere risultati diversi a seconda del contesto (maschi vs femmine). Inoltre, mentre il compito OLM che abbiamo scelto è dipendente dall'ippocampo (Barker e Warburton, 2011); l’apprendimento e la memoria sono processi complessi che possono fare affidamento su più sistemi di memoria, e forse le femmine fanno più affidamento su altri circuiti rispetto ai maschi. Inoltre, il ciclo estrale può influenzare le strategie di apprendimento e i relativi contributi dei diversi circuiti di memoria femminili (Korol et al.,2004).

Pertanto, gli effetti sesso-dipendenti osservati nel compito OLM potrebbero essere mediati da un meccanismo diverso dall'LTP nella sinapsi CA3-CA1. È anche possibile che la stimolazione ad alta frequenza utilizzata, in contrapposizione a una stimolazione più fisiologica (ad esempio, theta burst), possa aver occluso il rilevamento della regolazione sesso-dipendente dell'LTP. Un'ulteriore limitazione del test OLM degna di nota è una possibile interruzione dei ritmi comportamentali derivante dalla manipolazione ripetuta (5 min/giorno) 4 giorni prima dell'addestramento e del test. Indipendentemente da ciò, questi risultati esemplificano l’importanza di tenere conto sia del sesso che dell’ora del giorno quando si progettano studi di ricerca e si interpretano i risultati.

Un lavoro precedente del nostro laboratorio ha rivelato che i neuroni piramidali sIPSC su CA1 mostrano differenze diurne, che si perdono in un modello murino di malattia di Alzheimer (Fusilier et al., 2021). Qui, abbiamo replicato e ampliato i risultati precedenti esaminando le sIPSC in entrambi i sessi e conducendo ulteriori esperimenti in presenza di TTX (mIPSC) per iniziare a identificare i meccanismi presinaptici e postsinaptici che contribuiscono alle differenze diurne. La mancanza di differenze diurne nell'IEI delle mIPSC suggerisce che l'inibizione dipendente dal potenziale d'azione sulle cellule piramidali CA1 è maggiore durante il giorno che durante la notte sia nei topi maschi che in quelli femmine. Dato che queste correnti inibitorie sono state isolate farmacologicamente con gli antagonisti dei recettori del glutammato, è probabile che si generi spontaneamente un aumento dell’interneuronattività diurna. Infatti, studi precedenti suggeriscono che alcuni interneuroni nell'area CA1 sono spontaneamente attivi (Sik et al., 1995; Maccaferri e McBain, 1996; Oliva et al., 2000; Amilhon et al., 2015; Huh et al., 2016; Miri et al. ., 2018); tuttavia, mancano prove definitive della variazione diurna nell'attivazione spontanea degli interneuroni nell'ippocampo e costituiranno un'importante area di studio futuro che potrebbe fornire informazioni sulla disfunzione circadiana associata a malattie che comportano ipereccitabilità della rete ippocampale, tra cui il morbo di Alzheimer e l'epilessia.

Oltre a ricevere input inibitori dalle popolazioni interneuronali locali, i principali input eccitatori sulle cellule piramidali CA1 arrivano dagli assoni dei neuroni principali dell'area a valle CA3 (collaterali di Schaffer; cellule piramidali CA3) o dalla corteccia entorinale (via temperoammonica). L'esame delle sEPSC ha rivelato che la tendenza dell'input eccitatorio sulle cellule piramidali CA1 è maggiore durante la notte che durante il giorno. In assenza di rilascio di neurotrasmettitori dipendente dal potenziale d'azione, questo fenomeno persiste nei maschi, ma non nelle femmine, suggerendo che l'aumento dell'eccitazione notturna nelle femmine è probabilmente guidato dal potenziale d'azione. Le cellule piramidali CA3 mostrano anche differenze diurne nell'eccitabilità, in modo tale che le cellule notturne mostrano una maggiore corrente di calcio, una diminuzione dopo l'iperpolarizzazione e un ridotto adattamento della frequenza dei picchi rispetto alle cellule diurne (Kole et al., 2001). Questa maggiore eccitabilità notturna delle cellule piramidali CA3 potrebbe tradursi in un aumento di sEPSC sulle cellule piramidali CA1 durante la notte rispetto al giorno.

Successivamente volevamo esaminare in che modo la variazione diurna nella trasmissione sinaptica eccitatoria e inibitoria potrebbe influire sull'eccitabilità dei neuroni piramidali CA1. Uno studio precedente sui ratti ha scoperto che l’eccitabilità della membrana oscillava nel tempo circadiano e che i neuroni erano più depolarizzati durante la notte soggettiva/il primo giorno soggettivo (Naseri Kouzehgarani et al., 2020). Uno studio recente ha rilevato un aumento dell’eccitabilità notturna nei neuroni piramidali CA1 del topo (Fusilier et al., 2021). Qui, abbiamo replicato i risultati precedenti e ampliato il nostro studio per tenere conto delle potenziali differenze sessuali e dell'influenza dell'asse ippocampale antero-posteriore. Nel complesso, abbiamo scoperto che, in un circuito sinaptico intatto (cioè senza antagonisti sinaptici), i neuroni piramidali CA1 erano più eccitabili di notte rispetto al giorno, indipendentemente dal sesso. È interessante notare che l'aumento notturno dell'eccitabilità non era uniforme lungo l'asse antero-posteriore dell'ippocampo. Mentre i neuroni registrati dalle sezioni anteriori attivavano più potenziali d'azione in risposta alle iniezioni di corrente depolarizzante e non mostravano alcuna differenza diurna nel potenziale di membrana di base, i neuroni posteriori erano più depolarizzati di notte ma non mostravano un aumento notturno statisticamente significativo in diversi potenziali d'azione attivati.

Questi risultati suggeriscono che i meccanismi alla base dell'aumento notturno dell'eccitabilità neuronale possono essere diversi a seconda della posizione lungo l'asse antero-posteriore. Mentre la nostra preparazione della fetta coronale ci ha impedito di isolare veramente l'ippocampo ventrale da quello dorsale, abbiamo osservato che i neuroni delle fettine posteriori mostravano caratteristiche coerenti con i dati precedentemente pubblicati raccolti dai neuroni piramidali ventrali di CA1, mentre i neuroni delle fettine anteriori erano coerenti con i dati che esaminavano i neuroni piramidali dorsali di CA1 ( Malik et al., 2016; Milior et al., 2016). Nello specifico, i neuroni posteriori (di tipo ventrale) erano più eccitabili rispetto ai neuroni anteriori, raggiungendo la velocità di scarica massima prima dei neuroni anteriori, avevano una maggiore resistenza all'input e valori di reobase inferiori rispetto ai neuroni anteriori ( neuroni di tipo dorsale). Date le differenze note nella morfologia dendritica e nell'espressione dei canali ionici nei neuroni ippocampali dorsali e ventrali (Bannermanet al., 2004; Fanselow e Dong, 2010; Marcelin et al., 2012; Dougherty et al., 2012, 2013; Hönigsperger et al., 2015; Kim e Johnston, 2015; Malik et al., 2016; Milioret al., 2016; Soltesz e Losonczy, 2018), non sorprende che i meccanismi alla base dell'ineccitabilità delle differenze diurne possano essere diversi tra queste popolazioni. L'eccitabilità neuronale in presenza di antagonisti sinaptici suggerisce che gli input sinaptici contribuiscono almeno parzialmente all'aumento notturno dell'eccitabilità. Tuttavia, sono necessari esperimenti futuri per determinare il ruolo specifico sia dei fattori sinaptici che intrinseci nella regolazione delle differenze diurne della fisiologia nei neuroni piramidali CA1.

Inoltre, la differenza tra cellule anteriori e posteriori risultava ridotta in presenza di antagonisti sinaptici, suggerendo che i fattori sinaptici potrebbero essere almeno parzialmente responsabili di alcune delle differenze regionali che abbiamo osservato. Sarà interessante restringere il modo in cui l'espressione e la funzione dei vari recettori dei neurotrasmettitori e dei canali ionici vengono modulati sia nell'ora del giorno che nella posizione lungo l'asse longitudinale. Un vantaggio della tecnica del patch cieco utilizzata nel presente studio è la capacità di raccogliere dati da neuroni situati in profondità al di sotto della superficie del tessuto, dove la salute e la vitalità cellulare sono maggiori, ma il targeting visualizzato dei neuroni sarebbe difficile. Tuttavia, questo approccio vieta di prendere di mira specifiche sottopopolazioni neuronali. ; pertanto, nello studio sono stati inclusi i neuroni piramidali presenti in tutte le aree dello strato cellulare piramidale CA1. Studi futuri che esamineranno gli effetti dell'ora del giorno e del sesso in diverse sottopopolazioni di cellule piramidali CA1 (ad esempio, neuroni profondi e superficiali) forniranno informazioni utili per comprendere la fisiologia specifica del tipo di cellula.

L'ippocampo è uno dei circuiti più studiati e ben caratterizzati nel cervello dei mammiferi. Tuttavia, la maggior parte delle conoscenze su come funziona questo circuito si basa su studi condotti durante il giorno su roditori notturni, per lo più maschi. Non tenere conto di fattori come l’ora del giorno e il sesso porta a un quadro incompleto della fisiologia dell’ippocampo e del suo funzionamento dinamico in più contesti. Il sesso e l'ora del giorno sono considerazioni particolarmente importanti per la rilevanza traslazionale dello studio dell'ippocampo in modelli di malattie come l'Alzheimer o l'epilessia, che sono influenzate dai ritmi circadiani e possono colpire uomini e donne in modo diverso.

È importante notare che, ad eccezione degli esperimenti che testano l’OLM, tutti gli esperimenti di questo studio sono stati condotti in un ciclo luce-buio. Pertanto, sono necessari studi futuri in condizioni costanti per determinare il ruolo del sistema circadiano sulle differenze diurne osservate. Sebbene qui siano stati esaminati solo due punti temporali, negli studi futuri sarà interessante e utile determinare come la fisiologia dell'ippocampo sia dinamica attraverso più punti temporali nel ciclo circadiano. In conclusione, questo studio rivela variazioni diurne nella funzione ippocampale-sinaptica e neuronale e sottolinea l'importanza di considerare il sesso, i ritmi circadiani e l'eterogeneità neuronale all'interno di una regione del cervello nello studio dei circuiti neurali.

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