Espressione dell'immunoglobulina G nelle cellule epiteliali tubolari prossimali umane

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ZHENLING DENG et al

Astratto. prossimaletubolarecellule epiteliali (PTEC) hanno caratteristiche immunitarie innate e producono fattori proinfiammatori, chemochine e componenti del complemento che guidano la transizione epiteliale-mesenchimale (EMT). I nostri studi precedenti hanno rivelato che le cellule mesangiali e i podociti umani erano in grado di sintetizzare e secernere rispettivamente immunoglobuline (Ig) A e IgG. Lo scopo del presente studio era di valutare l'espressione di Igs nei PTEC. In primo luogo, le IgG sono state rilevate nel citoplasma, nella membrana cellulare e nel lume diPTECnella normale corteccia renale daimmunoistochimica. In secondo luogo, la trascrizione del gene Ig e la ricombinazione V(D)J sono state rilevate in singoli PTEC mediante PCR annidato e sequenziamento di Sanger. In terzo luogo, Ig, Igκ e Igλ sono stati chiaramente rilevati in una linea PTEC immortalata (HK‑2) mediante immunocolorazione e western blotting, in cui è stato utilizzato RP215 (un anticorpo che si lega principalmente alle IgG non derivate da cellule B). Inoltre, nelle cellule HK-2 sono stati rilevati trascritti dei geni Ig, Igκ e Igλ, ricombinazione conservativa V(D)J nella regione variabile Ig, gene attivante la ricombinazione 1/2 e citidina deaminasi indotta dall'attivazione. Questi dati hanno suggerito che le PTEC possono esprimere le IgG in modo simile ai linfociti B. Inoltre, l'espressione di IgG è stata sovraregolata dal TGF‑1 e potrebbe essere coinvolta nell'EMT.

Parole chiave:prossimaletubolarecellule epiteliali, unicellulari, HK‑2, IgG, transizione epiteliale-mesenchimale

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introduzione

prossimaletubolarecellule epiteliali (PTEC) sono il tipo cellulare più abbondante nelrenee svolgono un ruolo importante nella riparazione renale e/o nella progressione delle malattie renali croniche. Le PTEC esercitano funzioni immunologiche esprimendo molteplici recettori Toll-like (TLR), come TLR 1, 2, 3, 4 e 9 (1,2) e molecole associate alla funzione cellulare presentante l'antigene, inclusi MHCII, CD74, CD80 e CD86 (3). Queste caratteristiche immunitarie innate delle PTEC consentono loro di agire come risposta immunitaria a un'ampia gamma di stimoli, con la conseguente produzione e rilascio di mediatori bioattivi, tra cui citochine proinfiammatorie, chemochine e componenti del complemento, che guidano l'infiammazione interstiziale e la fibrosi (4). Le PTEC esprimono anche i recettori Fc neonatali e preservano la capacità di legame specifico pH-dipendente e di transcitosi dell'immunoglobulina (Ig)G (5). Tuttavia, per quanto ne sappiamo, non è noto se i PTEC esprimano Igs.

In precedenza è stato ipotizzato che le Ig siano prodotte esclusivamente da cellule B mature e plasmacellule e che le Ig agiscano come anticorpi per riconoscere e neutralizzare vari agenti patogeni. Tuttavia, questa teoria è stata contestata negli ultimi decenni, poiché prove crescenti hanno riportato che le Igs, comprese IgA, IgG e IgM, possono essere prodotte e secrete da cellule non-B, come le cellule tumorali epiteliali umane (6,7) e cellule normali non-B (8,9), nonché in siti immuno-privilegiati, come gli occhi (10), i neuroni centrali (11,12), la placenta (13) e il testicolo e l'epididimo (14)

Simile alle Igs (B-Igs) derivate dai linfociti B, anche le non-B-Igs sono i prodotti della trascrizione e del riarrangiamento del gene Ig e mostrano i classici pattern di ricombinazione V(D)J con aggiunte di nucleotidi alle giunzioni e ipermutazioni somatiche(7, 11,14). A differenza delle B‑Igs, le non‑B‑Igs presentano modelli di ricombinazione V(D)J limitati e una minore diversità (7). Funzionalmente, le non-B-Ig non solo esercitano un'attività anticorpale naturale nella pelle e nella mucosa (8), ma possono anche agire come fattori di crescita per promuovere la proliferazione e l'adesione cellulare e possono aumentare l'inizio e la metastasi del cancro legandosi alle integrine ( 15-17). Ad esempio, le IgG cancerose riconosciute da RP215 svolgono la loro funzione oncogenica interagendo con il complesso integrina 6 4 e attivando le vie FAK e Src (15).

Il nostro studio precedente ha dimostrato che le cellule mesangiali (18) e i podociti (19) possono sintetizzare e secernere IgA e IgG e partecipare alla crescita cellulare e all'adesione cellulare in vitro. Il presente studio mirava a valutare i livelli di espressione delle Igs nei PTEC e studiarne il potenziale ruolo nella transizione epiteliale-mesenchimale (EMT).

Effetti del cistanche: beneficio renale

Materiali e metodi

Coltura cellulare e trattamento.Una linea PTEC immortalata HK‑2 è stata acquistata da American Type Culture Collection. Le cellule HK‑2 sono state coltivate in DMEM/F12 integrato con 100 U/ml di penicillina, 0,1 mg/ml di streptomicina (tutta Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) e il 10% di siero bovino fetale (FBS; Origine australiana; Biological Industries USA, Inc.) a 37˚C in un'atmosfera contenente il 95% di aria e il 5% di CO2. Per evitare l'interferenza delle Ig nell'FBS, il terreno è stato sostituito con un terreno privo di siero 24-48 h prima della raccolta cellulare. Le cellule HK‑2 sono state trattate con diverse concentrazioni (2, 5 e 10 ng/ml) di TGF‑1 (Sigma‑Aldrich; Merck KGaA).

Isolamento PTEC singolo e sintesi di cDNA.Un campione di rene umano di tessuto corticale macroscopicamente normale è stato ottenuto da un paziente (maschio, 31 anni) sottoposto a nefrectomia a causa di carcinoma renale senza evidente disfunzione renale. È stata preparata una sospensione unicellulare digerendo la corteccia renale con 1 mg/ml di collagenasi I (Sigma‑Aldrich; Merck KGaA) a 37˚C per 20 min. I PTEC sono stati selezionati utilizzando anti-CD10 coniugato con ficoeritrina (PE) (cat. n. 312203) e anti-CD13 coniugato con alloficocianina (APC) (cat. n. 301705; entrambi BioLegend, Inc.) mediante ordinamento cellulare attivato con fluorescenza ( BD FACSAria II Special Order System) come precedentemente descritto (20). I corrispondenti anticorpi di controllo dell'isotipo (cat. n. 400111 e 400119; entrambi BioLegend, Inc.) sono stati utilizzati per escludere la colorazione non specifica. Le cellule viventi con doppia marcatura positiva sono state isolate come PTEC. Un singolo PTEC è stato selezionato manualmente al microscopio a luce invertita utilizzando una pipetta capillare ed è stato quindi trasferito in una provetta per PCR a parete sottile da 0,2 ml contenente tampone di lisi (21). L'estrazione di un singolo PTEC RNA e la sintesi di cDNA sono state eseguite secondo i metodi descritti in precedenza(21). Un totale di cinque singoli PTEC sono stati utilizzati per rilevare la trascrizione e il riarrangiamento del gene Ig.

Amplificazione PCR.L'RNA totale è stato estratto da cellule HK‑2, cellule mononucleate del sangue periferico [PBMC, isolate da una donatrice sana di 31 anni utilizzando Ficoll (cat. n. 7111011; Dakewe Biotech., Ltd.) ] e corteccia renale (dello stesso paziente utilizzato in isolamento PTEC singolo) utilizzando il reagente TRIzol® (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) e la concentrazione di RNA è stata valutata utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop (NanoDrop; Thermo Fisher Scientific, Inc.) . Successivamente, 2 µg di RNA totale sono stati trascritti inversamente in cDNA utilizzando il kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis (n. cat. K1622; Thermo Fisher Scientific, Inc.). La PCR è stata eseguita utilizzando primer mirati alle regioni costanti di Ig, Igκ, Igλ e citidina deaminasi indotta dall'attivazione (AID). La PCR nidificata è stata eseguita per amplificare la regione variabile di Ig , la proteina 2 correlata al recettore delle lipoproteine ​​a bassa densità (LRP2) e il gene di attivazione della ricombinazione (RAG)1 e RAG2. I prodotti della PCR sono stati separati mediante elettroforesi su un gel di agarosio all'1,0% e sono stati visualizzati utilizzando GelRed (n. cat. 41003; Biotium, Inc.). I primer di AID, RAG1/2 e le regioni costanti di Ig, Igκ, Igλ utilizzati in questo studio si riferiscono ai primer utilizzati da Jing et al (19). I primer della regione variabile Ig si riferiscono ai primer usati da van Dongen et al (22). Gli altri primer utilizzati per la PCR sono elencati nella Tabella SI. Le condizioni di termociclaggio sono elencate nella Tabella SII.

Sequenziamento Sanger e analisi dei dati di sequenziamento.I prodotti PCR della regione variabile Ig ottenuti da singole PTEC, cellule HK‑2 e PBMC sono stati rispettivamente clonati in un pGEM‑T Easy Vector System I (cat. n. A1360; Promega Corporation), che è stato trasformato nelle cellule TOP10 competenti (CB104; Tiangen Biotech Co., Ltd.). In breve, 5 µl di prodotti di ligazione sono stati aggiunti a 30 µl di cellule competenti TOP10, incubate in ghiaccio per 30 minuti, sottoposte a shock termico a 42˚C per 90 secondi e incubate in ghiaccio per 5 minuti. Quindi, 500 µl di LB sono stati aggiunti e lasciati riposare a 37˚C per 40 minuti prima di inoculare parte del liquido batterico su piastre Petri rivestite con 0,1 mmol/l di IPTG e 20 µg/ml di X‑Gal. I piatti sono stati capovolti a 37˚C durante la notte. In tutto, 5‑16 colonie bianche per campione sono state scelte casualmente e sequenziate utilizzando un analizzatore genetico ABI 3730XL (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Le sequenze V(D)J riorganizzate sono state confrontate con quelle nello strumento di ricerca dell'allineamento locale di base (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) per identificare i segmenti e le giunzioni del gene germinale più corrispondenti dopo il taglio del primer .

Analisi Western blot.Le cellule HK‑2 sono state lisate in tampone di lisi TSD [1% SDS, 50 mM Tris‑HCl (pH 7,5), 50 mM DTT] contenente un cocktail di inibitore della proteasi (Applygen Technologies Inc.), sonicato in acqua ghiacciata per 1 minuto ( lavorando 5 sec e riposando 15 sec; 3 volte) e lisato per 30 min a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione a 12,{12}} xg per 10 minuti a 4˚C, la concentrazione proteica del lisato cellulare è stata determinata utilizzando un kit BCA (Applygen Technologies Inc.). Successivamente, al lisato è stato aggiunto un tampone di carico riducente 5X, fatto bollire a 100˚C per 10 minuti e i campioni sono stati immediatamente utilizzati per l'analisi western blot. Il siero, utilizzato come controllo positivo per le Ig, è stato isolato da un donatore sano (lo stesso donatore utilizzato nei PBMC) mediante centrifugazione a 2.103 xg per 10 minuti a temperatura ambiente.

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Il western blot è stato eseguito secondo procedure standard. In breve, 3{{40}} µg di proteine ​​sono state separate mediante SDS‑PAGE su gel al 10% e sono state trasferite su una membrana di nitrocellulosa. Successivamente, la membrana è stata bloccata in latte scremato al 5% a temperatura ambiente per 1 ora ed è stata incubata con anticorpi primari a 4˚C durante la notte, comprese le Ig antiumane di coniglio (cat. n. ab109489; 1:1,{{8} }), coniglio antiumano Ig 4 (cat. n. ab109493; 1:1,{13}}), anti-Igκ (cat. n. ab124727; 1:10,{17}}), anti- Igλ (cat. n. ab124719; 1:20,{21}}), coniglio antiumano ‑actina (cat. n. ab8227; 1:2,000) (tutti da Abcam) e RP215 anticorpo monoclonale (mAb) (donato dal professor Xiaoyan Qiu, Università di Pechino, Pechino, Cina; 1:1,000), che identificava specificamente un epitopo associato ai carboidrati su Ig non-B. La membrana è stata quindi incubata con anticorpi secondari IgG‑IRDyeTM680CW di capra anti-coniglio (cat. n. 926‑32211) o anti-topo (cat. n. 926‑32210) (entrambi 1:10,000; entrambi LI‑COR Biosciences) a temperatura ambiente per 1 h. Il segnale è stato rilevato utilizzando il sistema di imaging Odyssey e il software Odyssey V3.0 (entrambi LI‑COR Biosciences). Il software ImageJ (versione 1.8.0; National Institutes of Health) è stato utilizzato per la semiquantificazione.

Purificazione di IgG e spettrometria di massa.Dopo che le cellule HK‑2 sono state coltivate in DMEM/F12 senza FBS per 48 ore, il surnatante di coltura è stato raccolto dopo centrifugazione a 2,103 xg per 10 minuti a 4˚C. Il supernatante cellulare è stato purificato mediante cromatografia di affinità utilizzando la proteina G Sefarosio, secondo le istruzioni del produttore (n. cat. 17‑0618‑02; Thermo Fisher Scientific, Inc.). L'eluente è stato ultrafiltrato per sostituire il tampone di eluizione (0,1 M di glicina; pH 2,4) con PBS. Le proteine ​​purificate sono state separate mediante SDS‑PAGE su gel al 10%, rilevate mediante western blotting e ulteriormente analizzate mediante spettrometria di massa, eseguita da Beijing Protein Innovation Co., Ltd.

Immunofluorescenza.Le cellule HK-2 sono state coltivate su vetrini coprioggetto, che sono stati fissati in acetone freddo non diluito per 5 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, i vetrini sono stati lavati due volte in PBS e bloccati con FBS/PBS al 5% a temperatura ambiente per 20 minuti, dopodiché sono stati incubati con anticorpi primari a 4˚C durante la notte. Gli anticorpi erano gli stessi utilizzati nel western blotting: Rabbit anti‑human Ig (1:150), anti‑human Igκ (1:250), anti‑human Igλ (1:250) e RP215 mAb (1:200). ); PBS è stato utilizzato come controllo negativo. Dopo il lavaggio in PBS, i vetrini sono stati incubati con anticorpi IgG anti-coniglio di capra marcati con isotiocianato di fluoresceina (n. cat. A11008) o anti-topo di capra (n. cat. A11001) (1:1,000; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) a temperatura ambiente per 1 h. I nuclei sono stati colorati con DAPI. Le immagini sono state acquisite con un microscopio a fluorescenza Leica DFC300 FX (Leica Microsystems GmbH).

Colorazione immunoistochimica.Cortecce renali paracancerose sono state raccolte da quattro pazienti maschi (età, 38-49 anni) con carcinoma renale. Le normali cortecce renali paracancerose dopo nefrectomia sono state fissate con 10 percento di formalina per 48 ore a temperatura ambiente e quindi incorporate in paraffina. I campioni di rene umano inclusi in paraffina sono stati tagliati in sezioni da 3 µm e deparaffinati e reidratati attraverso una serie di concentrazioni graduate di etanolo. Il recupero dell'antigene è stato eseguito facendo bollire in 0.05 M Tris‑EDTA (pH 9,0) in una pentola a pressione per 3 min. Le sezioni sono state quindi incubate con una soluzione di H2O2 al 3% per 10 minuti a temperatura ambiente per eliminare la perossidasi endogena e incubate con siero di capra normale (n. cat. ZLI‑9022, ZSGB‑BIO, Cina) per 30 minuti a temperatura ambiente per bloccare l'aspecificità siti di legame dell'anticorpo a temperatura ambiente. Successivamente, è stata eseguita la colorazione immunoistochimica indiretta con anticorpi primari a 4˚C durante la notte, inclusi RP215 mAb (1:200; 5 µg/ml), Ig antiumane di coniglio (1:2,{23}}), antiumane Igκ (1:1,{26}}), Igλ antiumano (1:1,000) (gli stessi anticorpi usati nel western blotting). Le sezioni senza anticorpi primari sono state utilizzate come controlli negativi. I vetrini sono stati quindi incubati con anticorpi secondari marcati con perossidasi di rafano non diluiti (numeri di cat. PV‑6001 e PV‑6002; entrambi OriGene Technologies, Inc.) a temperatura ambiente per 30 minuti. Gli anticorpi legati sono stati rilevati utilizzando diaminobenzidina. Infine, i vetrini sono stati colorati di contrasto con ematossilina. Le immagini sono state catturate utilizzando un microscopio ottico (ingrandimento x200). Analisi statistica. I dati sono presentati come media ± deviazione standard e sono stati analizzati utilizzando SPSS 20.0 per Windows (IBM Corp.). Tutti gli esperimenti sono stati ripetuti 3 volte. Le differenze tra più gruppi sono state analizzate utilizzando l'ANOVA a una via e il test posthoc di Tukey. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

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Risultati

Espressione di IgG nelle cellule epiteliali tubulari renali della corteccia renale.Le normali cortecce renali, che sono state raccolte da donatori sottoposti a nefrectomia a seguito di carcinoma a cellule renali, sono state utilizzate per determinare l'espressione di IgG nelle cellule epiteliali tubulari renali mediante immunoistochimica utilizzando anticorpi contro Ig, Igκ, Igλ e RP215 umani (un anticorpo che prevalentemente si lega a non-B‑IgG). La colorazione positiva delle catene pesanti e leggere di IgG non è stata rilevata solo nei PTEC, ma anche nelle cellule epiteliali dei tubuli contorti distali, nel citoplasma, nella membrana cellulare o nel lume tubulare (Fig. 1).

Trascrizione e ricombinazione V(D)J di IgG in singole PTEC. Per evitare l'interferenza del sangue residuo, il legame e la transcitosi delle IgG da parte delle PTEC nella corteccia renale e per ottenere prove dirette dell'espressione di IgG nelle PTEC, le singole PTEC sono state smistate dalla corteccia renale umana utilizzando la co-etichettatura CD10 e CD13 per flusso citometria (20). Come mostrato in Fig. 2A, le PTEC a doppio positivo CD10/CD13 rappresentavano il 4,1% delle cellule vitali nel campione. Le PTEC isolate sono state ulteriormente confermate utilizzando il gene marcatore specifico LRP2 e la contaminazione dei linfociti B è stata eliminata da CD19. Le trascrizioni della regione variabile Ig sono state amplificate in cinque singoli PTEC mediante PCR nidificato (Fig. 2B e C). I risultati del sequenziamento di Sanger hanno rivelato che i PTEC hanno mostrato una ricombinazione VDJ funzionale e conservativa della catena pesante di IgG (Tabella I), indicando che l'espressione di IgG può verificarsi nei PTEC.

Espressione di catene leggere e pesanti di IgG nelle cellule HK‑2. Poiché era difficile rilevare l'espressione della proteina IgG in un singolo PTEC e ottenere un numero sufficiente di PTEC per il western blotting, la linea cellulare HK-2, che è composta da PTEC immortalate, è stata selezionata per confermare ulteriormente l'espressione della proteina IgG. L'analisi dell'immunofluorescenza ha dimostrato una colorazione positiva di Ig, Igκ e Igλ nel citoplasma e una colorazione positiva più forte di RP215 prevalentemente nel citoplasma e nella membrana cellulare (Fig. 3A).

Successivamente, l'espressione delle catene pesanti e leggere di IgG nelle cellule HK-2 è stata rilevata mediante western blotting in condizioni riducenti. Per eliminare l'interferenza di FBS nel mezzo di coltura, il mezzo contenente FBS è stato macchiato con gli anticorpi corrispondenti e colorato in negativo. Un anticorpo IgG commerciale è stato in grado di rilevare le IgG derivate dal siero ma non le IgG derivate da HK‑2. Al contrario, RP215 potrebbe rilevare le IgG derivate da HK‑2, ma non le IgG sieriche. Sia l'anticorpo IgG commerciale che l'RP215 sono stati in grado di rilevare Ig a 55 kDa. È stata rilevata una banda Ig 4 (36 kDa) nelle cellule HK‑2, coerente con il peso molecolare previsto. Inoltre, nei lisati cellulari sono state osservate espressioni Igκ (25 kDa) e Igλ (50 kDa, dimero) (Fig. 3B). Successivamente, le IgG nel supernatante cellulare sono state purificate dalla proteina G, confermata dal western blotting e sequenziata mediante spettrometria di massa, che ha dimostrato che la banda di 55 kDa conteneva frammenti della catena Igκ e della regione variabile della catena pesante di Ig, secondo il National Center for Database delle informazioni sulla biotecnologia (NCBI) (Fig. 3C‑E). Questi dati suggerivano che le cellule HK‑2 producessero e secernessero proteine ​​IgG.

Trascrizione e ricombinazione V(D)J di catene leggere e pesanti di IgG nelle cellule HK‑2. La trascrizione del gene Ig e la ricombinazione funzionale V(D)J sono un prerequisito per l'espressione di Ig. Per confermare l'espressione di IgG nelle cellule HK‑2, le trascrizioni di Ig, Igκ e Igλ sono state valutate amplificando le regioni costanti e variabili nelle cellule HK‑2 (Fig. 4A e B). Il sequenziamento dei prodotti PCR costanti ha mostrato un'elevata omologia con la sequenza pubblicata nel database NCBI. La clonazione di T‑A e il sequenziamento di Sanger hanno dimostrato che le Ig nelle cellule HK‑2 mostravano una ricombinazione conservativa di V(D)J con VH4‑4/D2‑8/JH5. Al contrario, la diversità della ricombinazione V(D)J è stata osservata nei PBMC, che hanno eliminato il bias del primer (Tabella II). Simile ai linfociti B, le IgG derivate da HK‑2 hanno mostrato la tipica ricombinazione produttiva V(D)J con le giunzioni V‑D e D‑J (Fig. 4C). Inoltre, le ipermutazioni somatiche sono state rilevate in Ig derivate da HK‑2 (intervallo, 6,8‑8,4 percento) con 7 motivi hotspot su 15 (RGYW/WRCY, W=A/T, R= A/G, Y=C/T) che presentano mutazioni.

Inoltre, sono state rilevate trascrizioni AID (un elemento essenziale per l'ipermutazione somatica e la ricombinazione del cambio di classe nei linfociti B) e RAG1 e RAG2 [necessari per la ricombinazione V(D)J] nelle cellule HK-2 (Fig. 4B), indicando che il meccanismo alla base della sintesi di Ig nelle cellule HK-2 può essere simile a quello delle cellule B.

Il TGF‑1 sovraregola l'espressione di IgG nelle cellule HK‑2. Le cellule HK‑2 sono state stimolate con varie concentrazioni di TGF‑1 per 48 ore. La colorazione dell'immunofluorescenza ha rivelato che le IgG citoplasmatiche mostravano una colorazione positiva potenziata rispetto al gruppo di controllo (Fig. 5A). Il western blotting ha confermato che le IgG erano significativamente sovraregolate dal TGF‑1 (P<0.05; fig.="" 5b="" and="">

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Discussione

Il presente studio ha dimostrato che le PTEC esprimevano IgG con trascrizione genica e ricombinazione funzionale conservativa V(D)J, che era simile a non-B-IgG. Espressione di IgG sovraregolata di TGF‑1 nelle cellule HK2.

Per indagare se le PTEC esprimessero IgG, le IgG sono state rilevate per la prima volta nel citoplasma, nella membrana cellulare e nel lume delle PTEC nella normale corteccia renale umana mediante immunoistochimica; i risultati hanno indicato che i PTEC producevano e secernevano IgG. Ciò è in contrasto con il nostro esame patologico di routine, in cui non è stata rilevata alcuna IgG apparente nei PTEC. Ciò potrebbe essere dovuto alla colorazione PTEC molto debole, che era troppo bassa per essere rilevata, in particolare nelle malattie glomerulari immuno-correlate in cui le Igs sono fortemente positive nei glomeruli e la colorazione PTEC può essere persa involontariamente ma artificialmente. La transcitosi di IgG dalla circolazione da parte delle PTEC attraverso il recettore Fc è stata parzialmente esclusa, poiché è stata osservata una chiara colorazione di IgG da parte di RP215 nella membrana cellulare e nel citoplasma. Questi risultati hanno suggerito che le IgG derivate da PTEC erano simili ad altre non-B-IgG e potevano avere epitopi glicosilati unici, che possono essere specificamente riconosciuti da RP215 invece di un anticorpo anti-IgG commerciale (15). La scoperta che solo una parte delle cellule epiteliali tubulari esprime IgG può essere spiegata dall'espressione dinamica a diversi cicli cellulari, che era simile al pattern di espressione delle IgA derivate dalle cellule mesangiali (18). La co-colorazione delle IgG con marcatori tubulari (come acquaporina 1 e acquaporina 3) sarebbe utile per ulteriori studi per migliorare i risultati del presente studio.

Il sequenziamento dell'RNA unicellulare può visualizzare chiaramente la trascrizione di un gene specifico in una determinata cellula. Le trascrizioni della catena Ig e la ricombinazione V(D)J sono state rilevate in singoli PTEC. Sebbene siano state utilizzate solo cinque singole PTEC, il processo è stato rigoroso poiché la corteccia renale è stata raccolta lontano dal tumore e ogni singola cellula è stata classificata mediante citometria a flusso con due geni marcatori specifici per PTEC, riconfermati utilizzando un terzo gene marcatore specifico (LRP2) e la contaminazione dei linfociti B è stata eliminata. I risultati hanno rivelato che le PTEC non si presentano solo con le trascrizioni del gene IgG, ma anche con la classica ricombinazione V(D)J nella regione variabile come cellule B, come la ricombinazione produttiva V(D)J con V‑D e D‑J giunzioni (Fig. 4), indicando che le PTEC hanno il potenziale per produrre IgG. Inoltre, la ricombinazione V(D)J più conservativa ha illustrato che le PTEC si presentano con trascrizioni del gene IgG e ricombinazione V(D)J simili ad altre cellule non-B.

HK‑2, una linea PTEC immortalata, è facile da coltivare in grandi quantità. Il presente studio ha confermato l'espressione della proteina IgG in cellule HK-2 in coltura; Le IgG sono state rilevate nelle cellule HK-2 sia mediante immunofluorescenza che mediante western blotting. Anche Ig 4, una sottoclasse di Ig , è stata rilevata a una dimensione di banda coerente con il peso molecolare previsto. La spettrometria di massa ha rivelato che la proteina purificata dal supernatante cellulare utilizzando la proteina G conteneva frammenti della regione variabile della catena pesante Ig e della catena Igκ, fornendo prove della secrezione di IgG da parte delle PTEC. La trascrizione di IgG nelle cellule HK‑2 ha ulteriormente supportato l'espressione di IgG nelle PTEC e la ricombinazione conservativa V(D)J con IGHV4‑4/IGHD2‑8/IGHJ5 nelle cellule HK‑2 ha ulteriormente supportato la presenza di IgG nelle cellule HK‑2 simili ad altri linfociti non-B.

Il presente studio ha anche studiato il meccanismo alla base della produzione di IgG nei PTEC esaminando la trascrizione di RAG1, RAG2 e AID nelle cellule HK‑2. È stato rivelato che RAG1, RAG2 e AID sono stati trascritti nelle cellule HK‑2. Inoltre, le trascrizioni RAG1, RAG2 o AID sono state precedentemente rilevate in numerose altre cellule non-B, come i podociti (19) e diverse linee cellulari tumorali (23). Questi risultati hanno suggerito che le cellule non-B, comprese le PTEC, possono avere meccanismi di sintesi di Ig simili a quelli dei linfociti B. Tuttavia, se AID e/o RAG1/2 siano geni necessari per le IgG derivate da PTEC richiede ulteriori indagini. Inoltre, i linfociti T CD4 helper follicolari sono importanti per regolare la differenziazione dei linfociti B del centro germinativo in plasmacellule e supportare la produzione di Igs (24). I nostri dati non pubblicati hanno rivelato che le Ig non-B erano ancora rilevate nei topi NOD-SCID carenti di cellule T e B, indicando che le Ig non-B non dipendevano interamente dalle cellule T helper. Se le cellule T helper sono necessarie affinché le PTEC esprimano le IgG richiede ulteriori ricerche.

Il TGF‑1 ha un ruolo immunomodulatore chiave nella produzione di Ig. Ad esempio, il TGF‑1 ha indotto il cambio di classe di IgA e la secrezione nei linfociti B stimolati nella milza del topo (25) e nei linfociti B delle tonsille umane (26). McIntyre et al (27) hanno dimostrato che il TGF‑1 stimolava selettivamente la secrezione di IgG2b da parte dei linfociti B attivati ​​da lipopolisaccaridi molto probabilmente inducendo un cambio di classe da IgM a IgG2b. Duan et al (28) hanno dimostrato che il TGF‑1 aumenta l'espressione di IgA sovraregolando il fattore di trascrizione Ets‑1 nelle cellule tumorali epiteliali. Il presente studio ha dimostrato che il TGF‑1 sovraregola l'espressione di IgG nelle cellule HK‑2. Dato che solo le IgG sono state rilevate nelle cellule HK‑2, è stato ipotizzato che il TGF‑1 inducesse l'espressione di IgG indipendentemente dal cambio di classe Ig. Il meccanismo di regolamentazione della produzione di IgG da parte del TGF‑1 richiede ulteriori indagini.

I PTEC svolgono un ruolo importante nella fibrosi interstiziale tubulare attraverso l'EMT e il TGF‑1 funge da mediatore profibrotico principale. Nel presente studio, l'aggiunta di TGF‑1 alle cellule HK‑2 in coltura ha aumentato l'espressione di IgG, indicando che le IgG derivate da HK‑2 possono essere positivamente associate all'EMT. Precedenti studi hanno riportato che il cancro-IgG era associato a metastasi e promuoveva l'EMT diminuendo la E-caderina nel carcinoma adenoide cistico salivare (29) e nel cancro del polmone (30). Vale la pena indagare se le IgG derivate da PTEC possono svolgere un ruolo nell'EMT tubulare renale e nella fibrosi interstiziale in condizioni patologiche, come lesioni da ischemia/riperfusione omalattia renale cronica.

In conclusione, per quanto ne sappiamo, il presente studio è stato il primo a dimostrare che le PTEC possono esprimere e secernere IgG e il TGF‑1 può sovraregolare l'espressione di IgG nelle cellule HK‑2. Tuttavia, il potenziale ruolo delle IgG derivate da PTEC nella fibrosi tubulo-interstiziale richiede ulteriori indagini.

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Finanziamento

Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (concessione n. 82070736, 91642109 e 81870488), della Hainan Natural Science Foundation (concessione n. 819QN355), della Hainan Medical University Scientific Research Cultivation Foundation (concessione n. HYPY201926) e i progetti di supporto chiave del programma di ricerca principale della Fondazione nazionale di scienze naturali (concessione n. 91642206).

Disponibilità di dati e materiali

I set di dati utilizzati e/o analizzati durante lo studio in corso sono disponibili presso l'autore corrispondente su ragionevole richiesta.

Contributi degli autori

In qualità di autori corrispondenti, YW e XQ hanno concepito e progettato lo studio. ZD ha partecipato al progetto di ricerca, ha eseguito esperimenti istologici e unicellulari, ha preparato campioni per la spettrometria di massa, ha analizzato i dati e ha scritto il manoscritto. ZJ ha partecipato alla progettazione della ricerca, alla maggior parte degli esperimenti riguardanti l'espressione di IgG nelle cellule HK‑2 e all'analisi dei dati rilevanti. YG, JM, HD e YL hanno eseguito esperimenti su linee cellulari parziali. ZC e YP hanno selezionato casi appropriati per esperimenti unicellulari in base alle caratteristiche cliniche. HY e ZS hanno partecipato a esperimenti unicellulari. SW ha partecipato alla colorazione immunoistochimica, ha analizzato i dati sulla colorazione dei tessuti e ha redatto e rivisto il manoscritto. YW, ZD e ZJ hanno confermato l'autenticità di tutti i dati grezzi. Tutti gli autori hanno esaminato il manoscritto e rivisto i dati. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.

Approvazione etica e consenso a partecipare

Il presente studio è conforme ai principi della Dichiarazione di Helsinki ed è stato approvato dal Comitato di etica medica del Terzo ospedale dell'Università di Pechino (approvazione n. S2020121) e condotto in conformità con il protocollo. Tutti i donatori hanno donato volontariamente la corteccia renale e hanno fornito il consenso informato scritto prima di donare la corteccia renale allo studio. Tutti i metodi sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e i regolamenti pertinenti. Questi campioni sono stati rigorosamente resi anonimi. Siero umano e PBMC, utilizzati come controlli positivi nel western blotting o nella PCR di trascrizione inversa nel presente studio, sono stati ottenuti dal sangue di un volontario sano, che ha fornito il consenso informato scritto per il campionamento.

Effetti del cistanche: beneficio renale

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