Gli estratti di Cistanche Deserticola possono antagonizzare l'immunosenescenza e prolungare la durata della vita nei topi 8 (SAM-P8) inclini alla senescenza accelerati

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Il topo con accelerazione di senescenza 8 subceppi (SAM-P8), ampiamente accettato come modello animale per lo studio di farmaci antietà e invecchiamento, è stato utilizzato per esaminare gli effetti dell'integrazione alimentare con estratti di Cistanche deserticola (ECD) che è stato ampiamente utilizzato in medicina tradizionale cinese a causa della sua capacità percepita di promuovere la funzione immunitaria negli anziani. I topi maschi SAM-P8 di otto mesi sono stati trattati con ECD mediante somministrazioni orali giornaliere per 4 settimane. I risultati hanno mostrato che l'integrazione alimentare di l50 mg/kg e 450 mg/kg di ECD potrebbe prolungare la durata della vita misurata dall'analisi di sopravvivenza di Kaplan-Meier in modo dose-dipendente. È stato dimostrato che l'integrazione alimentare di topi SAM-P8 per 4 settimane con 100.500 e 2500 mg/kg di ECD provoca aumenti significativi sia delle cellule T naive che delle cellule natural killer nelle popolazioni di cellule del sangue e della milza. Al contrario, le cellule T della memoria periferica e la citochina proinfiammatoria, IL{19}} nel siero, erano sostanzialmente diminuite nei topi che ingerivano 100 e 500 mg/kg di ECD al giorno. Inoltre, le cellule Sca-1 positive, i progenitori riconosciuti diingenuo perifericoLe cellule T, sono state ripristinate in parallelo. I nostri risultati forniscono un chiaro supporto sperimentale per studi clinici osservazionali di lunga data che lo dimostranoCistanchedeserticola possiede effetti significativi nell'allungare la durata della vita e suggerisce che ciò si ottiene antagonizzandoimmunosenescenza.

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1. Introduzione

Cistanchedesertico, uno dei più popolari medicinali e prodotti per la salute tradizionali cinesi a base di erbe, è stato descritto in numerose farmacopee storiche cinesi a base di erbe come dotato di proprietà antietà. Di conseguenza, è stato ampiamente utilizzato in Cina per il trattamento di vari disturbi legati all'età tra cui demenza senile, impotenza, infertilità, infezioni croniche e disturbi ematopoietici negli anziani [1]. I moderni approcci chimici hanno consentito di isolare due tipi principali di composti, i glicosidi feniletanoidi e gli oligosaccaridi, come i principali ingredienti attivi della Cistanche deserticola [1]. Nell'ultimo decennio, Cistanche deserticola e i suoi estratti sono stati studiati intensamente e hanno dimostrato di essere in grado di proteggere i neuroni dai danni indotti dalle neurotossine [2], inibendo il tetracloruro di carbonio indottoepatotossicità[2] e promuovere il recupero delle cellule del midollo osseo dal danno da radiazioni indotto da Co60 [3]. È stato anche dimostrato che ha effetti antinfiammatori, antiossidanti e antietà [4]. Tuttavia, non sono stati rigorosamente testati se Cistanche deserticola può aumentare la durata della vita e quali sono i meccanismi molecolari sottostanti [3] associati alle sue proprietà antietà.

L'immunosenescenza, cioè l'alterazione del sistema immunitario con l'età, costituisce lo sfondo su cui è stata notata una maggiore suscettibilità alle infezioni, al cancro, alle malattie neurodegenerative e alle malattie autoimmuni negli anziani [5]. Interventi terapeutici, come la restrizione calorica [6] e l'integrazione di vitamina E, sono stati segnalati per essere efficaci nel ritardare la progressione dell'immunosenescenza e quindi ridurre la morbilità di alcune malattie legate all'età, oltre a prolungare la durata della vita sia dell'uomo che dei roditori [7, 8]. Tuttavia, gli studi in questo settore sono complicati dal fatto che l'invecchiamento è associato al paradosso dell'immunodeficienza simultanea e dell'infiammazione cronica [9]. Ciò significa che la semplice stimolazione della proliferazione linfocitaria o l'antinfiammatorio non rappresentano interventi terapeutici ideali nell'affrontare l'invecchiamento e le condizioni legate all'età [10]. Di conseguenza, nella ricerca di interventi medici in grado di prevenire o alleviare condizioni legate all'età, tra cui infezioni, cancro, malattie autoimmuni, aterosclerosi e malattie neurodegenerative che sono le principali cause di morte e disabilità, e la riparazione dei difetti del sistema immunitario deve essere accompagnata da un'inibizione risposte infiammatorie. Il topo con senescenza accelerata [11] è un modello murino consanguineo, derivato dal ceppo AKR/J, ampiamente utilizzato negli studi sull'invecchiamento. Il sottoceppo P8 (SAM-P8) di questi topi ha una durata di vita notevolmente ridotta rispetto al sottoceppo R1 (SAM-R1), che mostra anche un processo di invecchiamento più lento [12]. Parallelamente al loro invecchiamento prematuro, i topi SAM-P8 mostrano anche una maggiore senescenza neurologica, immunosenescenza e correlata all'etàematopoieticodeficit che imitano da vicino le caratteristiche tipiche dell'invecchiamento umano [13, 14]. L'analisi dei meccanismi sottostanti responsabili del processo di invecchiamento accelerato e dei disturbi legati all'età indica che la disfunzione mitocondriale [15], lo stress ossidativo e l'aumento del tasso di mutazione del DNA somatico sembrano essere tutti coinvolti [16, 17]. Questo sistema murino, con il suo background genetico omogeneo, fornisce quindi un eccellente modello sperimentale per lo studio dell'invecchiamento e delle terapie antietà [12]. Questo studio si è concentrato sullo studio se gli estratti di Cistanche deserticola sono in grado di prolungare la durata della vita dei topi SAM-P8 e invertire il loro stato di immunosenescenza.

Cistanche può migliorare l'immunità e l'anti-fatica

2. Materiali e metodi
2.1. Materiali. La Cistanche deserticola YC MA fresca è stata raccolta da varie aree del nord-ovest della Cina, comprese le regioni autonome di Xinjiang, Neimenggu e Ningxia. I campioni utilizzati per preparare gli estratti sono stati autenticati dal professor Pengfei Tu, specialista in farmacognosia presso il Dipartimento di Medicinali Naturali, Scuola di Scienze Farmaceutiche, Università di Pechino. L'esemplare di voucher di Cistanche deserticola (numero CD-2007-03-08) utilizzato era stato depositato nell'erbario della School of Pharmaceutical Sciences, Università di Pechino, Cina. 2.2. Preparazione di Estratti di Cistanche deserticola (ECD) e Analisi HPLC. La Cistanche deserticola (2,0 kg) essiccata all'aria e affettata è stata polverizzata ed estratta due volte con il 70 percento di etanolo per 1 ora. I rapporti pianta/etanolo utilizzati erano 1/6 (p/p) nella prima estrazione e 1/4 (p/p) nella seconda. I due estratti sono stati combinati e filtrati prima di essere concentrati ad una densità relativa di 1,10–1,15 sotto la pressione ridotta a 60∘ C. Questo concentrato è stato quindi essiccato sotto vuoto e la polvere risultante era l'estratto di Cistanche deserticola (ECD) utilizzato in questo studio. I componenti dell'ECD sono stati analizzati utilizzando HPLC come descritto in precedenza [1]. In breve, 100 mg di polvere ECD è stato sciolto in 10,0 ml di H2O e dopo la filtrazione è stato iniettato nell'HPLC. L'analisi HPLC è stata eseguita su un sistema di cromatografia liquida Agilent 1100 (Agilent Co., USA). La fase mobile consisteva in una miscela di metanolo (A) e acido metanoico allo 0,10 percento (B). È stato impiegato un programma di cromatografia a gradiente; questo era 26,5 percento (A) e 73,5 percento (B) in 0–7 minuti, 26,5–29,5 percento (A) e 73,5–70,5 (B) in 8–10 minuti e 29,5 percento (A) e 70,5 percento (B ) in 20–27 minuti. La velocità di flusso è stata mantenuta costante a 1,0 mL/min, il volume di iniezione era di 10 mL e la temperatura della colonna è stata mantenuta a 25°C. È stato utilizzato un rivelatore UV impostato a 330 nm per monitorare il deflusso della colonna e generare cromatogrammi. I glicosidi e gli oligosaccaridi feniletanoidi sono stati identificati dai loro tempi di ritenzione e dagli spettri di assorbimento. La quantificazione è stata effettuata mediante curve di calibrazione standard esterne. La resa degli estratti di Cistanche deserticola (ECD) era di circa il 3,33% e il contenuto di feniletanoidi era del 17,94%. Acteoside ed echinacoside erano due costituenti principali di questa frazione, con il loro contenuto rispettivamente del 3,80% e dell'8,25%. Gli oligosaccaridi rappresentano l'82% dell'ECD totale. Le concentrazioni dei principali componenti attivi dell'ECD sono riportate nella Tabella 1. 2.3. Analisi della durata della vita animale. I topi maschi SAM-P8 e SAM-R1 di controllo sono stati acquistati dal Laboratory Animal Breeding and Research Center del Peking University Health Science Center (Pechino, Cina). Questo studio è stato approvato dal Comitato di ricerca sugli animali dell'Università di Pechino e condotto secondo le linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio dell'Università di Pechino. Il numero di certificazione di questi mouse era SCXK2001-2008. I topi sono stati tenuti in gabbie metaboliche standard in condizioni controllate dall'ambiente (22 ± 2∘ C, 45-60% di umidità e 12 ore di ciclo luce/buio) e hanno consentito il libero accesso a cibo e acqua. Dopo 2 settimane di acclimatamento, gli animali sono stati divisi in cinque gruppi: 3 gruppi di trattamento ECD, un gruppo di controllo SAM-R1 e un gruppo di controllo SAM-P8 senza trattamento. La dieta dei 3 gruppi di trattamento è stata integrata con una dieta mista

diverse concentrazioni di ECD: resa di dosi medie basse (50 mg/kg), medie (150 mg/kg) e alte (450 mg/kg) di ECD quotidiano. I gruppi di controllo senza trattamento SAM-R1 e SAM-P8 sono stati alimentati con la stessa dieta senza ECD. La misurazione dell'assunzione di cibo di tutti gli animali è stata effettuata ogni tre giorni durante l'esperimento. Il monitoraggio della pressione sanguigna e della frequenza cardiaca è stato eseguito in modo non invasivo ogni tre mesi per la durata dell'esperimento per determinare lo stato di salute dei topi. La durata della vita di ogni topo è stata registrata fino alla morte di tutti gli animali. 2.4. Analisi di cellule T naive, cellule T di memoria, cellule NK e cellule Sca-1 positive in popolazioni di cellule del sangue periferico e della milza mediante citometria a flusso. I topi SAM-P8 maschi di otto mesi e i topi SAM-R1 di controllo sono stati divisi in 5 gruppi: 3 gruppi di trattamento ECD di topi SAM-P8, un gruppo di controllo SAM-P8 senza trattamento e un gruppo di controllo SAM-R1. La dieta dei 3 gruppi di trattamento è stata integrata da una sonda gastrica giornaliera di ECD a dosi di 100 mg/kg, 500 mg/kg o 2500 mg/kg. Dopo 4 settimane di trattamento, gli animali sono stati fissati per 12 ore e quindi anestetizzati con soluzione di pentobarbital sodico (50 mg/kg, iniezione peritoneale, ip), e il sangue è stato raccolto e trattato con un anticoagulante, sodio citrato (2 mg/mL). ). I linfociti del sangue sono stati raccolti e analizzati. Quindi i topi sono stati tamponati con alcol al 75% e le cavità addominali sono state aperte in un armadio ultrapulito (cappa). Le milze sono state lavate con PBS; quindi macinato e filtrato con un colino cellulare (70 𝜇m). La sospensione risultante di cellule spleniche è stata lavata e risospesa in terreno PRMI 1640 a una concentrazione di 2 × 106 /mL. Le cellule spleniche di ciascun topo sono state aliquotate in 6 provette per l'analisi della citometria a flusso. La concentrazione finale di sospensione di cellule spleniche in ciascuna provetta era 2 × 105/100 𝜇L. I linfociti del sangue periferico e i linfociti splenici sono stati incubati separatamente con FITC-CD4, PerceCD3, Perce-CD8a, PC-CD28, PE-CD44, FITC-CD45RB, PE CD49b/pink e FITC-ly-6A/E ( Sca-1) (tutti acquistati da BD Biosciences, San Diego, CA, USA) anticorpi monoclonali a temperatura ambiente per 30 min. La soluzione di lisi, che è specificamente destinata alla lisi dei globuli rossi preservando i leucociti, eliminando così le cellule interferenti per l'analisi citofluorimetrica, è stata incubata con sangue al buio a temperatura ambiente per 5 minuti. Dopo centrifugazione a 500 × g per 5 minuti, il surnatante è stato decantato. Quindi le cellule pellet sono state lavate 3 volte con PBS, risospese in soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato (PBS, pH 7,4) contenente lo 0,01% di sodio azide e sottoposte a FCM analisi. Le sottopopolazioni di linfociti sono state analizzate mediante citometria a flusso utilizzando un citometro a flusso FACS Calibur (BD Biosciences, San Diego, CA, USA) e un software di analisi BD CellQuest. 2.5. Valutazione della vitalità cellulare dei linfociti T periferici mediante annessina V-FITC e doppia colorazione PI e analisi FACS. Dopo l'integrazione alimentare di topi SAM P8 con tre dosi di ECD per 4 settimane, gli animali sono stati fissati per 12 ore e quindi anestetizzati, e il sangue è stato raccolto e analizzato. I linfociti apoptotici e necrotici vitali sono stati quantificati utilizzando il kit Annexin V-FITC (Beijing Biosea Biotechnology Co., Ltd., Pechino, Cina). I linfociti sono stati sottoposti a doppia colorazione con annessina V marcata coniugata con isotiocianato di fluoresceina (Annexin V-FITC) e ioduro di propidio (PI). In breve, le sospensioni di linfociti contenenti circa 106 cellule/mL sono state lavate due volte con PBS e sospese in 200 𝜇L di tampone legante (10 mM HEPES/NaOH, pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2) e 10 𝜇L di annessina V-FITC è stato aggiunto alla sospensione cellulare. Dopo 15 min di incubazione al buio a temperatura ambiente, sono stati aggiunti altri 300 𝜇L di tampone legante e 5 𝜇L PI. Immediatamente dopo altri 5 minuti di incubazione al buio, i campioni di linfociti doppiamente colorati sono stati analizzati utilizzando un citometro a flusso, FACS Calibur (BD Biosciences, San Diego, CA, USA). 2.6. Determinazione delle citochine plasmatiche mediante saggio immunologico Cytometric Bead Array (CBA). I livelli plasmatici di citochine sono stati quantificati utilizzando un kit di analisi cytometric bead array (CBA) (BD Biosciences, San Diego, CA, USA) in grado di rilevare simultaneamente IFN-𝛾, TNF-𝛼, IL-6, IL{{96 }}, IL-10, GM-CSF e IL-3 in un unico campione. Pertanto, questo test immunologico multiplex ha consentito il rilevamento di citochine immunostimolanti (IL-2), citochine proinfiammatorie (IFN-𝛾, TNF- 𝛼 e IL-6), citochine inibitorie infiammatorie (IL{{105 }}) e citochine ematopoietiche (IL-3 e GM-CSF). In breve, 50 𝜇L di plasma sono stati miscelati con 50 𝜇L di microsfere di cattura di citochine coniugate con PE che erano state ricoperte con anticorpi di cattura specifici per IFN-𝛾, TNF-𝛼, IL-6, IL-2, IL proteine ​​-10, GM-CSF e IL-3. Dopo 2 ore di incubazione a temperatura ambiente, i campioni sono stati lavati in soluzione fisiologica tamponata con fosfato (PBS, pH 7,4) ghiacciata contenente lo 0,01% di sodio azide, quindi fissati in 0,5 mL di paraformaldeide all'1% in PBS e mantenuti a 4∘ C in il buio fino all'analisi, e quindi analizzato dal citometro a flusso FACS Calibur (BD Biosciences, San Diego, CA, USA). 2.7. Analisi statistica. I dati sono mostrati come valori medi ± SD I confronti tra i diversi gruppi sono stati effettuati mediante ANOVA unidirezionale con un test post hoc. Nello studio sulla durata della vita, i dati sono stati sottoposti all'analisi di sopravvivenza di Kaplan-Meier, che includeva l'uso di entrambi i test Log-rank (Mantel-Cox) e Gehan-Breslow Wilcoxon. L'analisi statistica è stata condotta utilizzando il pacchetto statistico per le scienze sociali per Windows (SPSS, Chicago, IL) e un valore 𝑃 inferiore a 0,05 è stato considerato significativo.

3. Risultati
3.1. Analisi dei Potenziali Componenti Attivi negli Estratti di Cistanche deserticola (ECD). Come mostrato nella Tabella 1, l'ECD è composto principalmente da due tipi di composti, glicosidi feniletanoidi e oligosaccaridi. Nei glicosidi feniletanoidi sono stati identificati l'echinacoside, l'acetonide e l'acido 8-epiloganico, mentre negli oligosaccaridi è stato identificato solo il galattitolo.

Figura 1: Gli effetti degli estratti di Cistanche deserticola (ECD) sulla durata della vita dei topi SAM-P8. Topi maschi di otto mesi con accelerazione della senescenza/8 (SAM-P8) proni sono stati divisi casualmente in 4 gruppi (in ciascun gruppo, 𝑛 {{10}}}): 3 gruppi di trattamento e un no -gruppo di controllo del trattamento. Il sottoceppo non senescente (SAM-R1) dei topi è stato utilizzato come controllo sperimentale. L'assunzione di cibo di tutti gli animali è stata monitorata durante l'esperimento a 3-intervalli di giorni. I 3 gruppi di trattamento sono stati alimentati ad libitum con diete integrate con dosi basse (50 mg/kg), medie (150 mg/kg) e alte (450 mg/kg) di Cistanche deserticola estratto (ECD). I due gruppi di animali di controllo sono stati alimentati con la stessa dieta senza integrazione di ECD. (a) Curve di sopravvivenza di Kaplan-Meier di topi SAM-P8 a dieta con ECD o controllo del veicolo. L'analisi di sopravvivenza di Kaplan-Meier è stata condotta utilizzando i test Log-rank (Mantel-Cox) e Gehan-Breslow-Wilcoxon. (b) Istogramma della vita media dei gruppi di topi. Le barre di errore mostrano che la deviazione standard dalla media e dalla significatività statistica è stata effettuata utilizzando l'analisi ANOVA seguita da 𝑡-test post hoc. ###𝑃 < 0,001="" sam-p8="" contro="" sam-r1;="" ∗∗𝑃="">< 0,01="" gruppo="" trattato="" con="" alte="" dosi="" rispetto="" a="" sam-p8;="" ∗𝑃="">< 0,05="" gruppo="" trattato="" con="" dose="" media="" rispetto="" a="" sam-p8="" (in="" ciascun="" gruppo,="" 𝑛="">

3.2.L'impatto degli estratti di Cistanche deserticola sulla durata media della vita dei topi SAM-P8. Per questo e gli studi successivi, i topi SAM-P8 maschi di otto mesi sono stati divisi in 4 gruppi. Tra questi, un gruppo di topi è stato alimentato con una dieta normale senza ECD, gli altri 3 gruppi hanno ingerito separatamente le diete che contengono proporzioni diverse di ECD. I topi del sottoceppo SAM-R1, che hanno un normale processo di invecchiamento e durata della vita, sono stati usati come gruppo di controllo in tutti gli esperimenti. Rispetto al gruppo di controllo SAM-R1, la durata media della vita dei topi SAM-P8 è stata significativamente ridotta (Figura 1(a); 𝑃 < 0.001).="" sebbene="" l'integrazione="" della="" dieta="" con="" la="" dose="" bassa="" (50="" mg/kg)="" di="" ecd="" non="" sia="" riuscita="" a="" produrre="" un="" aumento="" significativo="" della="" durata="" della="" vita="" dei="" topi="" sam-p8,="" con="" l'integrazione="" supplementare="" media="" (150="" mg/kg)="" e="" alta="" (450="" mg/ml)="" dosi="" si="" è="" verificato="" un="" aumento="" dose-dipendente="" della="" durata="" della="" vita="" (figure="" 1(a)="" e="" 1(b);="" 𝑃="">< 0,05–0,01)="" che="" è="" stato="" confermato="" dall'analisi="" di="" sopravvivenza="" di="" kaplan-meier,="" che="" includeva="" l'uso="" sia="" del="" log-rank="" (="" mantel-cox)="" e="" gehan-breslow-wilcoxon.="" 3.3.="" inversione="" dell'immunosenescenza="" nei="" topi="" sam-p8="" da="" estratti="" di="" cistanche="" deserticola="" (ecd).="" una="" diminuzione="" dei="" linfociti="" t="" naive="" periferici="" e="" il="" concomitante="" aumento="" dei="" linfociti="" t="" della="" memoria="" periferica="" sono="" caratteristiche="" importanti="" dell'immunosenescenza="" che="" sono="" ampiamente="" considerate="" come="" le="" principali="" ragioni="" alla="" base="" delle="" anomalie="" immunologiche="" legate="" all'età.="" questa="" immunosenescenza="" in="" sam-p8="" rispetto="" agli="" animali="" sam-r1="" era="" chiaramente="" evidente="" quando="" l'analisi="" facs="" è="" stata="" utilizzata="" per="" enumerare="" i="" linfociti="" (cd3="" più="" cd44low="" cd45rbhigh)="" come="" indicatore="" di="" cellule="" t="" naive="" e="" linfociti="" (cd3="" più="" cd44high="" cd45brlow)="" come="" indicatore="" della="" memoria="" t="" cellule.="" pertanto,="" sia="" nel="" sangue="" periferico="" (figura="" 2)="" che="" nelle="" popolazioni="" di="" cellule="" della="" milza="" (figura="" 3)="" sono="" stati="" osservati="" livelli="" ridotti="" di="" cellule="" t="" naive="" e="" livelli="" aumentati="" di="" cellule="" t="" di="" memoria="" nei="" topi="" sam-p8.="" è="" stato="" riscontrato="" che="" l'integrazione="" della="" dieta="" dei="" topi="" sam-p8="" con="" ecd="" è="" in="" grado="" di="" invertire="" questi="" indicatori="" di="" immunosenescenza="" in="" modo="" dose-dipendente="" sia="" nelle="" popolazioni="" di="" sangue="" periferico="" (figura="" 2)="" che="" di="" cellule="" della="" milza="" (figura="" 3).="" come="" ulteriore="" indicatore="" dell'inversione="" dell'immunosenescenza="" da="" parte="" dell'integrazione="" della="" dieta="" con="" ecd,="" è="" stato="" analizzato="" il="" livello="" di="" cellule="" natural="" killer="" [18],="" uno="" dei="" principali="" marcatori="" cellulari="" del="" sistema="" immunitario="" innato.="" ciò="" ha="" dimostrato="" che="" l'integrazione="" con="" la="" dieta="" ecd="" ha="" comportato="" un="" aumento="" dose-dipendente="" delle="" cellule="" nk="" (cd3="" più="" cd49="" più)="" nelle="" popolazioni="" di="" linfociti="" sia="" del="" sangue="" periferico="" (figura="" 4)="" che="" delle="" cellule="" della="" milza="" (figura="" 5).="" 3.4.="" gli="" estratti="" di="" cistanche="" deserticola="" rafforzano="" l'intensità="" di="" fluorescenza="" relativa="" delle="" cellule="" sca-1="" positive="" nei="" topi="" sam-p8.="" l'antigene="" delle="" cellule="" staminali-1="" (sca-1)="" è="" uno="" dei="" biomarcatori="" più="" importanti="" delle="" cellule="" staminali="" ematopoietiche="" (hsc)="" nelle="" popolazioni="" di="" cellule="" del="" midollo="" osseo.="" le="" cellule="" sca-1="" positive="" rappresentano="" anche="" i="" progenitori="" dei="" linfociti="" che="" sono="" stati="" recentemente="" esportati="" dal="" midollo="" osseo="" nel="" sangue="" periferico="" dove="">

4. Discussione

La difesa immunitaria contro microrganismi di nuova invasione o cellule tumorali endogene dipende dalla diversità del repertorio di cellule T, che a sua volta si basa sulla generazione e sul mantenimento di cellule T naive [19]. Durante il processo di invecchiamento, è stato dimostrato che la diversità del repertorio dei linfociti T si riduce drasticamente a causa del progressivo esaurimento dei linfociti T ingenui nel pool di riserva periferico. È questa carenza di cellule T naive reattive che è stata ritenuta responsabile della suscettibilità degli anziani alle infezioni, al cancro e agli scarsi risultati dopo la vaccinazione [20]. Vari interventi, tra cui la restrizione calorica [7], l'esercizio [21] e l'integrazione di vitamina E [8], sono stati tutti utilizzati per ricostituire con successo le cellule T naive e quindi prolungare la durata della vita e ridurre l'insorgenza di infezioni e cancro tra gli anziani. In questo studio, abbiamo dimostrato che l'ECD è in grado di aumentare il livello di cellule T naive nel pool periferico e vi è stata una concomitante estensione della durata della vita e riduzione della frequenza di formazione del tumore nei topi con accelerazione della senescenza (gruppo terapeutico ECD versus SAM-P8, 0 contro 1/6). Pertanto, sembra ragionevole concludere che la capacità dell'ECD di invertire l'esaurimento dipendente dall'età delle cellule T naive periferiche può contribuire ai suoi effetti noti nel ridurre le malattie legate all'età che derivano da osservazioni cliniche a lungo termine.

5. Materiali e metodi

5.1. Materiali. Nella normale risposta immunitaria, in seguito al contenimento e all'eliminazione di un antigene estraneo, la maggior parte dei linfociti T espansi clonalmente va incontro a apoptosi e solo una piccola frazione viene trattenuta come linfociti T di memoria. Di conseguenza, con l'invecchiamento di un organismo immunocompetente, le cellule T della memoria periferica si accumulano come risultato di una vita di esposizione ad antigeni estranei convertendo le cellule T naive in cellule della memoria [22, 23]. Numerosi studi hanno suggerito che i difetti dell'apoptosi linfocitaria negli animali più anziani e nell'uomo contribuiscono anche all'allargamento del compartimento dei linfociti T della memoria [24, 25]. Inoltre, uno studio recente ha dimostrato che una sovrabbondanza di cellule T di memoria periferica può inibire la proliferazione omeostatica delle cellule T naive [26]. Questi studi recenti hanno anche suggerito che i linfociti T della memoria possono secernere livelli elevati di citochine proinfiammatorie che possono contribuire a infiammazioni persistenti in vari tessuti degli anziani. Di conseguenza, la riduzione del livello dei linfociti T di memoria dovrebbe essere utile sia per la proliferazione omeostatica dei linfociti T naive sia per alleviare lo stato infiammatorio in eccesso osservato negli organismi più vecchi. In questo studio, l'integrazione alimentare con ECD ha dimostrato di essere in grado di ridurre il livello di cellule T di memoria periferica e aumentare i livelli di cellule T naive. Inoltre, la supplementazione di ECD ha aumentato l'apoptosi nelle popolazioni di linfociti periferici, facendo potenzialmente spazio a nuovi linfociti naive. Anche la necrosi nei linfociti periferici, che è principalmente indotta dallo stress ossidativo negli animali senili, è stata inibita. Esistono numerose prove per indicare che l'invecchiamento in un organismo non è solo caratterizzato da deficienza immunitaria, ma anche da un aumento dell'infiammazione cronica [27]. Lo stato proinfiammatorio si manifesta più chiaramente nell'aumento dei livelli di citochine proinfiammatorie, tra cui IL-6, TNF- 𝛼 e IL-1𝛽, nella circolazione insieme all'aumento della frequenza di malattie infiammatorie croniche associate all'invecchiamento come Morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson e aterosclerosi. Una delle più importanti citochinesi infiammatorie IL-6 e la sua concentrazione plasmatica aumenta con l'invecchiamento e le malattie legate all'età [18, 28, 29] e studi epidemiologici suggeriscono che IL-6 è un buon biomarcatore di longevità in quanto è strettamente correlato alla mortalità nelle coorti di pazienti anziani [30, 31]. Coerentemente con ciò, una serie di interventi terapeutici che riducono la concentrazione di IL-6 sono in grado di alleviare le malattie legate all'età [18]. In questo contesto, era significativo che in questo studio l'integrazione alimentare con ECD fosse in grado di ridurre le concentrazioni periferiche di IL-6, con l'implicazione che questo effetto può contribuire ai meccanismi alla base della riduzione della frequenza delle malattie legate all'età che sono stati ottenuti attraverso l'uso a lungo termine dell'ECD nella pratica clinica. Accanto ai cambiamenti nella risposta immunitaria adattativa che si verificano con l'età, ci sono anche importanti cambiamenti nell'immunità innata quando un organismo invecchia. Tra questi, i cambiamenti nelle cellule natural killer [18], la prima linea di componenti cellulari a fornire la lisi citotossica diretta delle cellule tumorali e delle cellule infettate da virus, sono stati estesi poiché gli anziani mostrano una maggiore suscettibilità allo sviluppo del tumore e alle infezioni virali [18]. 32]. Questo studio ha indicato che le cellule CD3 più Ly49 più NK erano presenti a livelli significativamente più bassi nei topi SAM P8 senili rispetto agli animali di controllo SAM-R1, il che potrebbe essere un altro fattore alla base della maggiore suscettibilità dei topi anziani al cancro e alle infezioni da virus. L'aumento del livello di cellule NK osservato in questo studio in seguito all'integrazione alimentare con ECD potrebbe quindi essere benefico per gli organismi anziani in termini di maggiore resistenza allo sviluppo del tumore e all'infezione da virus. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi per chiarire il ruolo dell'effetto dell'ECD sulle cellule NK negli organismi invecchiati. In conclusione, questo studio ha dimostrato che il trattamento del sottoceppo soggetto a topo con accelerazione della senescenza, SAM P8, con ECD può indurre una significativa inversione delle alterazioni dell'immunosenescenza legate all'età. Sono state ridotte le carenze nelle popolazioni di cellule T e NK naive sia nelle popolazioni periferiche che in quelle della milza, mentre sono stati ridotti anche i livelli di cellule T di memoria ridondanti. Inoltre, l'integrazione alimentare con ECD è stata in grado di sopprimere sia le necrosi nei linfociti periferici che i livelli della citochina proinfiammatoria, IL-6. Infine, oltre a provocare cambiamenti nel sistema immunitario senile, l'integrazione alimentare con ECD ha prolungato significativamente la durata della vita dei topi SAM-P8 senili.

Riferimenti
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