La fisetina attenua le risposte infiammatorie indotte dai lipopolisaccaridi nei macrofagi

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Diversi studi hanno riportato l'efficacia e la sicurezza dei polifenoli nella salute umana; tuttavia, la verifica della loro efficacia rimane insufficiente. Lo scopo di questo studio era di esaminare se la fisetina, uno dei flavonoidi prevalentemente presenti in frutta e verdura, potesse sopprimere il lipopolisaccaride-(LPS-)indottoinfiammatoriorisposte nei macrofagi. LPS ha aumentato l'abbondanza di mRNA proinfiammatorio (MCP 1, IL-1ß e iNOS) ma è stato soppresso dalla fisetina. L'incremento di ossido nitrico da parte di LPS, un fattore di stress ossidativo, è stato attenuato dalla fisetina. Inoltre, è stata ridotta la fosforilazione potenziata da LPS della protein chinasi attivata dal mitogeno (ERK e JNK). Infine, la fisetina ha attenuato l'espressione o l'attività di uPA, uP AR, MMP-2 e MMP{5}}, noti come fattori associati al reclutamento o all'infiltrazione dei macrofagi. Insomma,fisetinaè un promettente agente terapeutico per le malattie infiammatorie correlate ai macrofagi, come la sepsi e l'aterosclerosi.

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1. Introduzione

L'uso terapeutico di componenti naturali ha guadagnato maggiore attenzione negli ultimi 2 decenni. Sulla base della loro grande efficacia e bassa tossicità, il 40 percento degli agenti terapeutici approvati dalla FDA sono componenti naturali o loro derivati ​​[1]. La tossicità associata ad altri farmaci è stata prevenuta con successo da diversi prodotti naturali [2]. Pertanto, è molto importante e significativo esplorare ulteriormente i composti naturali derivati ​​dalle piante.

Polifenolisono i metaboliti secondari vegetali e sono ampiamente presenti in cibi e bevande di origine vegetale, frutta, verdura, spezie, tè e vino. Sebbene non siano considerati micronutrienti essenziali, diversi tipi di letteratura mostrano i loro effetti benefici sulla salute umana, specialmente nelle diete associate a un consumo elevato di frutta e verdura [3-5]. Numerosi studi sono stati condotti nel corso di decenni per indagare sugli effetti farmacologici dei polifenoli, suggerendo benefici per la salute. Prove crescenti hanno dimostrato che alcuni polifenoli possiedonoantinfiammatorioproprietà

[6-8]. Inoltre, studi recenti hanno dimostrato che diversi tipi di polifenoli possono inibire enzimi regolatori o fattori di trascrizione coinvolti nell'infiammazione [9].

La dieta influenza diversi stadi dell'infiammazione e dimostra un impatto importante su diverse malattie infiammatorie[10,11]. L'infiammazione gioca un ruolo chiave nello sviluppo di malattie come diabete, asma, malattie cardiovascolari e cancro [12]. Pertanto, il controllo dell'infiammazione può prevenire queste malattie. Poiché i macrofagi sono i principali mediatori dell'infiammazione, hanno diverse funzioni nell'omeostasi e nell'infiammazione dei tessuti. Pertanto, gli agenti che modulano efficacemente le loro funzioni sono di grande valore clinico poiché l'attivazione aberrante dei macrofagi può causare risposte immunitarie dannose. L'attuale tendenza della ricerca indica chiaramente che i prodotti naturali sono una delle fonti più importanti di nuovi farmaci [13].

Un polifenolo, l'isetina (3,3',4',7-tetraidrossiflavone), è riccamente contenuto in fragola, mela, pomodoro, cipolla, arancia, pesca, uva, kiwi, cachi, tè e vino [14] . Finora, la fisetina ha riportato un forte antinfiammatorio [15-17],

effetti antiossidanti [18], antitumorali[19,20, antiangiogenici [21], antidiabetici [22], neuroprotettivi [23] e cardioprotettivi [24] sia in colture cellulari che in modelli animali rilevanti per malattie umane. Sebbene la fisetina abbia molti effetti fisiologici, il suo effetto sui macrofagi non è molto riportato.

Nel presente studio, abbiamo studiato gli effetti benefici della fisetina sulla risposta infiammatoria dei macrofagi attivati ​​dalipopolisaccaride(LPS).

2. Materiali e metodi

2.1. Isolamento dei macrofagi peritoneali residenti.

I topi BALB/c sono stati ottenuti dall'Istituto di Scienze Mediche dell'Università di Tokyo e mantenuti nell'Animal Resource Center dell'Università di Okayama. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti per conformarsi alle linee guida NIH (Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio). Il protocollo sperimentale è stato approvato dagli Ethics Review Committees for Animal Experimentation della Okayama University Graduate School of Medicine, Dentistry, and Pharmaceutical Sciences (OKU-2018449). Tutti i topi sono stati mantenuti in una struttura di barriera e alimentati con una normale dieta di laboratorio. I topi BALB/c maschi e femmine, di 16 ± 4 settimane di età sono stati anestetizzati con isoflurano ed eutanasia tramite dislocazione cervicale. I macrofagi sono stati raccolti tramite lavaggio peritoneale utilizzando soluzione salina (5 ml). La soluzione di lavaggio peritoneale è stata centrifugata a 1500 rpm per 5 minuti. Il sedimento è stato sospeso in un piccolo DMEM(SIGMA, Cat. No.D6046). I globuli rossi sono stati lisati utilizzando una soluzione di cloruro di ammonio. Il numero di macrofagi è stato calcolato utilizzando un emocitometro, quindi risospeso in DMEM contenente FBS termoinattivato (10 percento vv), penicillina (10 U/mL) e streptomicina (10 mg/mL) e placcato in 6-pozzetto piastre (Coring Incorporated, Cat. No.3516) [25,26].

2.2. Condizioni di coltura cellulare.

Dopo la fame di siero durante la notte, i macrofagi sono stati incubati con concentrazioni selezionate di fisetina （10, 30 e 100 μM; SIGMA, Cat. N. F4043) o veicolo per 3 ore e incubato in presenza o assenza di LPS (10 ng/mL; SIGMA, Cat. N. L4391) per un tempo adeguato. Quindi, il mezzo e le cellule sono stati raccolti. Il mezzo è stato utilizzato per il dosaggio dell'ossido nitrico (NO) e per la zimografia della gelatina. I lisati cellulari sono stati utilizzati per la reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) e il western blotting.

2.3. Reazione a catena della polimerasi in tempo reale.

Gli mRNA sono stati estratti dai macrofagi utilizzando RNeasy Mini Kits (QIAGEN, Cat. No.74104). La trascrizione inversa è stata eseguita utilizzando un iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad, Cat. No. 1708891). La qPCR è stata eseguita con un sistema ABI Step One Real-Time PCR (Applied Biosystems, QuantStudio 3) utilizzando una Fast SYBR Green Real-time PCR Mixture (Applied Biosystems, Cat. n. 4385612)[27). Primer per la proteina chemiotattica dei monociti 1(MCP-1)(Takara Bio Inc, Cat. No. MA066003), interleuchina 1 beta(IL-1 )(Takara Bio Inc., Cat. No. MA025939), ossido nitrico sintasi inducibile (iNOS)(Takara Bio Inc, Cat. No. MA083369), matrice metalloproteinasi-(MMP-)2(Takara Bio Inc., Cat. No. MA127110), MMP-9(Takara Bio Inc. ., Cat. No.MA031311) e 18S ribosomiale RNA(18S)(Takara Bio Inc., Cat. No.MA050364) erano disponibili in commercio. Ogni campione è stato normalizzato ai valori per l'espressione di mRNA 18S (metodo AACT) [27].

2.4. Saggio di ossido nitrico.

I singoli supernatanti della coltura cellulare sono stati raccolti e centrifugati per 10 minuti a 14,{2}}rpm a 4 gradi. Quindi, il supernatante è stato utilizzato per il dosaggio dell'ossido nitrico (NO). Il test NO è stato eseguito come descritto nei kit disponibili in commercio (BioAssay Systems, Cat. No. D2NO-100). Il kit di dosaggio dell'ossido nitrico QuantiChrom di BioAssay Systems è un dosaggio colorimetrico per la determinazione della produzione di NO in seguito alla riduzione dei nitrati in nitriti utilizzando il metodo Griess migliorato.

2.5. macchia occidentale.

Le proteine ​​a cellule intere sono state estratte dai macrofagi usando un tampone di lisi (Cell Signaling, Cat. No.9803). Ciascun campione è stato applicato in SDS-PAGE al 10% e trasferito su una membrana di fluoruro di polivinilidene, immunoblotting con anticorpi primari (la fosforilazione della chinasi regolata dal segnale extracellulare (p-ERK); Segnalazione cellulare, Cat. No.9101, la fosforilazione di c-Jun N-terminale chinasi (p-JINK); Segnalazione cellulare, Cat. No.9251, l'attivatore del plasminogeno dell'urochinasi (uPA); Abcam, Cat. No.

ab20789, l'attivatore del plasminogeno dell'urochinasi e il recettore (uPAR); R&S, Cat.No.AF534 e -actina; Sigma Cat. N. A5441)[28]. Le membrane sono state quindi incubate con anticorpi secondari appropriati e gli immunocomplessi sono stati visualizzati su chemiluminescenza (Merck Millipore, n. cat. WBLUF0100, n. cat. WBLUC0100) e quantificati utilizzando un General Electric Imager (GE Healthcare, LAS4000 mini)[29].

2.6. Zimografia della gelatina.

I supernatanti di colture cellulari sono stati risolti in condizioni non riducenti mediante SDS-PAGE (10 percento p/vol) polimerizzato in presenza di gelatina (0, 1 percento p/p) per valutare le attività di MMP{ {4}}. I gel sono stati lavati con Triton X-100 (2,5 percento vol/vo) per 60 minuti e acqua distillata per 15 minuti due volte. I gel sono stati quindi incubati per una notte a 37 gradi Cin 50 mM di tampone Tris contenente cloruro di calcio (5 mM) pH8.0. Dopo l'incubazione, i gel sono stati colorati con Coomassie Brilliant Blue R-250(Bio-Rad, Cat. No.{ {18}}) per 30 minuti a temperatura ambiente, quindi decolorazione con Coomassie Brilliant Blue R-250 Destaining Solution (Bio-Rad, Cat. No.161-0438) fino alla comparsa delle bande chiare. Le immagini del gel sono state quantificate utilizzando una General Electric Imager (GE Healthcare, LAS 4000 mini); le regioni digerite non colorate e traslucide rappresentavano aree di attività MMP [30].

2.7. Statistiche.

Tutte le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando Sigma Plot v14.0(Systat Software Inc, California, USA). I dati sono presentati come media ± errore standard della media. La significatività statistica tra più gruppi è stata valutata mediante un'analisi della varianza unidirezionale o bidirezionale seguita dal test post hoc di Holm-Sidak o dal test post hoc di Student-Newman-Keuls. valore<0.05 was="" considered="" statistically="">

3. Risultati

3.1. La fisetina ha attenuato i mediatori infiammatori nei macrofagi stimolati con LPS.

Poiché i macrofagi attivati ​​producono citochine proinfiammatorie e mediatori dell'infiammazione come NO[8], abbiamo esaminato gli effetti della fisetina sui mediatori dell'infiammazione nei macrofagi stimolati con LPS. Innanzitutto, per studiare se la fisetina esercita l'effetto antinfiammatorio a livello trascrizionale, abbiamo determinato i livelli di espressione dell'mRNA A di geni infiammatori come MCP-1, IL-1 e iNOS (Figura 1(a) ). Come previsto, le espressioni di questi geni infiammatori sono state soppresse dalla fisetina in modo dose-dipendente. Successivamente, per confermare se la fisetina sopprime la risposta infiammatoria nei macrofagi, abbiamo valutato la sua capacità di sopprimere la produzione di NO nei macrofagi trattati con LPS (Figura 1 (b)). Come previsto, la fisetina ha ridotto la produzione di NO in modo dose-dipendente.

3.2. Fisetina ridotta proteina chinasi attivata dal mitogeno nei macrofagi stimolati con LPS.

Poiché è stato segnalato che la fisetina inibisce le vie della protein chinasi (MAPK) attivate dal mitogeno in vari tipi di cellule [31, 32], abbiamo esaminato gli effetti della fisetina sui MAPK nei macrofagi. Innanzitutto, è stata osservata l'attivazione di MAPK indotta da LPS nei macrofagi (Figura 2 (a)). L'aumento di p-ERK da LPS ha raggiunto il picco a 15 minuti dopo la stimolazione, mentre l'incremento di p-JNK da LPS ha raggiunto il picco a 30 minuti. Pertanto, negli esperimenti successivi, i macrofagi sono stati stimolati con LPS per 30 minuti. Il cotrattamento con fisetina ha ridotto significativamente il miglioramento indotto da LPS di p-ERK e p-JNK (Figure 2 (b) e 2 (c)).

3.3. Fisetina uPA e uPAR ridotti nei macrofagi stimolati con LPS.

L'attivazione dei macrofagi è strettamente correlata all'invasività delle cellule. Inoltre, uPA e uPAR nei macrofagi contribuiscono all'infiltrazione delle cellule. Pertanto, è stato studiato l'effetto della fisetina sull'espressione di uPA e uPAR. LPS ha indotto l'abbondanza proteica di uPA (Figura 3 (a)) e uPAR (Figura 3 (b)). Il cotrattamento di fisetina ha ridotto l'incremento di uPA (Figura 3 (a)) e uPAR di LPS (Figura 3 (b)).

3.4. Fisetina ridotta MMP-2 e MMP-9 nei macrofagi stimolati con LPS.

Inoltre, per chiarire l'effetto della fise-tin sulle MMP, abbiamo esaminato le espressioni MMP-2 e MMP-9, i mediatori a valle di uPA/uPAR. Per quanto riguarda il livello di mRNA, LPS ha aumentato significativamente l'espressione di mRNA di MMP-2 e MMP-9, rispetto al trattamento del veicolo (Figura 4 (a)). La fisetina ha ridotto il potenziamento di queste espressioni geniche di MMP-2 o MMP9 indotte da LPS in modo dose-dipendente (Figura 4(a)). Inoltre, le attività proteiche di MMP-9 sono state valutate mediante zimografia (Figura 4 (b)). Le attività proteiche di MMP-9(92kDa) sono state aumentate dalla stimolazione LPS, che è stata ridotta dalla fisetina (Figura 4 (b)).

4. Discussione

Abbiamo trovato un importante effetto della fisetina contro l'infiammazione nei macrofagi. Il presente studio ha dimostrato che la fisetina attenuava l'induzione di componenti infiammatori come MCP-1, IL-1, iNOS e NO, indotta da LPS nei macrofagi. Inoltre, la fisetina ha soppresso l'attivazione di MAPK e attenuato l'incremento indotto da LPS dell'espressione di uPA e uPAR. Inoltre, la fisetina ha attenuato l'aumento dell'abbondanza di mRNA di MMP-2 e MMP-9 e l'attività di MMP-9.

Nella sepsi causata da infezione da Gram-negativi, l'LPS è comunemente riconosciuto come l'agente eziologico della sepsi. In molti studi, l'LPS è stato utilizzato come modello di sepsi e infiammazione. Inoltre, l'infiammazione cronica induce il cancro precoce mediante l'attivazione di cellule infiammatorie e la produzione impropria di un mediatore proinfiammatorio come iNOS e fattori di trascrizione come il fattore di trascrizione nucleare kappa B (NF-xB)[33]. Inoltre, è stato anche riportato che lo stress ossidativo viene ridotto attenuando l'espressione di iNOS [34]. Il nostro studio ha dimostrato che la fisetina può essere efficace nella prevenzione e nel trattamento della sepsi e dello shock settico, a causa dell'effetto soppressivo sull'abbondanza di mRNA dei geni pro-infiammatori e della produzione di NO. In questo studio, la fisetina ha soppresso la produzione di NO riducendo l'espressione dell'mRNA del gene proinfiammatorio (iNOS); pertanto, era probabile che la fisetina attenuasse lo stress ossidativo. Di conseguenza, questi risultati hanno supportato gli effetti antinfiammatori, antitumorali e antiossidanti della fisetina.

Diversi studi hanno riportato che LPS ha indotto la fosforilazione di MAPK, inclusi ERK e JNK [35]. Inoltre, è stato riportato che la fisetina inibisce la migrazione e l'invasione delle cellule cervicali umane sottoregolando l'espressione di uPA attraverso la soppressione di MAPK [36]. In macro -fagi, sono disponibili pochi rapporti sull'effetto della fisetina sull'espressione e l'attività di uPA e uPAR. Il nostro studio ha dimostrato per la prima volta che la fisetina ha soppresso l'espressione di uPA e uPAR indotta da LPS attraverso la soppressione della segnalazione MAPK nei macrofagi, come precedentemente riportato nelle cellule tumorali.

Le MMP sono una famiglia di proteasi la cui espressione è correlata a determinati processi, come lo sviluppo, la fisiologia e la patologia. In comune, la MMP-9 è stata riconosciuta come un marker di varie malattie infiammatorie, come l'aterosclerosi, l'artrite e il lupus eritematoso sistemico [37]. Inoltre, MMP-9 era strettamente associato alla migrazione cellulare [38,39]. Diversi studi hanno riportato in particolare che MMP-2 e MMP-9 sono coinvolti nell'aterogenesi e svolgono un ruolo importante nella stabilizzazione delle placche aterosclerotiche 40-42]. Su questo punto, i nostri risultati suggeriscono che gli inibitori di MMP-9 può essere promettente come approccio terapeutico per la stabilizzazione delle placche vulnerabili. Inoltre, recenti indagini hanno dimostrato che la guarigione delle ferite cutanee è compromessa dall'eccessiva attivazione di MMP-9 [43]. Pertanto, è stato suggerito che la fisetina ha anche un potenziale come approccio terapeutico per la guarigione della pelle. Saranno necessari studi futuri per chiarirne i dettagli sui meccanismi molecolari.

Una tendenza recente nell'industria farmaceutica sta scoprendo strategie per sviluppare la pianta naturale stessa come nuovo farmaco. Infatti, due recenti studi sugli animali hanno dimostrato che l'infiammazione polmonare acuta indotta da LPS e l'artrite indotta da collagene sono state migliorate dal trattamento con fisetina |32,44. Un altro studio ex vivo ha anche dimostrato che la fisetina è in grado di attenuare il rilascio di citochine indotto da LPS dai leucociti di pazienti con broncopneumopatia cronica ostruttiva o diabete di tipo 2[45]. Molti farmaci immunosoppressori sono stati sviluppati per attenuare le malattie infiammatorie e autoimmuni[46-50]; tuttavia, la maggior parte dei composti mostra effetti collaterali significativi. Poiché i polifenoli sono comunemente presenti nella frutta e nella verdura dietetica, presumibilmente possono essere agenti immunosoppressori più sicuri [51, 52]. Frutta e verdura contengono una vasta gamma di sostanze fitochimiche tra cui lattoni sesquiterpenici, terpenoidi, polisaccaridi e composti fenolici. I nostri risultati, che dimostrano gli effetti antinfiammatori, antitumorali e antiossidanti della fisetina, indicano fortemente che può essere sviluppato come nuovo farmaco. Sebbene la fisetina sia un candidato promettente per l'immunoterapia, il potenziale dei prodotti naturali contenenti fisetina come agente terapeutico per una determinata malattia deve essere ulteriormente verificato in ambito clinico.

5. Conclusioni

Il presente studio ha dimostrato che la fisetina ha attenuato gli incrementi diinfiammatoriogeni (MCP-1, IL-1b e iNOS), la produzione di NO e la fosforilazione di MAPK,uPA, uPAR e MMP, indotta da LPS nei macrofagi. Questi risultati hanno suggerito che la fisetina potrebbe essere un agente terapeutico per diverse malattie correlate ai macrofagi.