I flavonoidi come agenti antivirali promettenti contro l'infezione da SARS-CoV-2: una revisione del meccanismo

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Astratto: Un coronavirus di nuova diagnosi nel 2019(COVID-19) ha colpito tutte le attività umane sin dalla sua scoperta.Flavonoidicomunemente presenti nella dieta umana hanno attirato molta attenzione a causa delle loro notevoli attività biologiche. Questo documento fornisce una rassegna completa dei benefici dei flavonoidi nella malattia COVID-19. Gli effetti precedentemente riportati dei flavonoidi su cinque virus a RNA con manifestazioni cliniche simili e/o trattamenti farmacologici, inclusi influenza, virus dell'immunodeficienza umana (HIV), sindrome respiratoria acuta grave (SARS), sindrome respiratoria mediorientale (MERS) ed Ebola, sono stati considerato. I flavonoidi agiscono direttamenteantiviraleproprietà, dove inibiscono diversi stadi del ciclo infettivo del virus e gli effetti indiretti quando modulano le risposte dell'ospite all'infezione virale e le successive complicanze. I flavonoidi hanno mostrato attività antivirale attraverso l'inibizione della proteasi virale, dell'RNA polimerasi, dell'mRNA, della replicazione del virus e dell'infettività. I composti erano anche efficaci per la regolazione di interferoni, citochine pro-infiammatorie e vie infiammatorie subcellulari come il fattore nucleare-kB e le chinasi Jun N-terminali. Baicalin,quercetina, e i suoi derivati, l'esperidina e le catechine sono i flavonoidi più studiati a questo proposito. In conclusione, i flavonoidi alimentari sono promettenti opzioni di trattamento contro l'infezione da COVID-19; tuttavia, si raccomandano indagini future per valutare le proprietà antivirali di questi composti su questa malattia.

Parole chiave: infiammazione;polmone; danno ossidativo; antivirale; polifenolo

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1. Introduzione

Entro la fine del 2019, dalla Cina è stata segnalata una polmonite insolita che è stata ulteriormente diagnosticata come un nuovo coronavirus (CoV) che causa la sindrome respiratoria acuta grave (SARS) ed è stata chiamata COVID-19[1,2]. Successivamente, il virus (SARS-CoV-2) si è diffuso ad altri paesi ed è stato dichiarato pandemia dall'OMS l'11 marzo 2020 [3]. Ilvirusviene trasmesso principalmente dalle goccioline respiratorie e la gravità varia da sintomi letali da lievi a gravi. Si ritiene che i casi asintomatici nel periodo di incubazione siano un'importante fonte di contagio [4]. Nella maggior parte dei casi, i sintomi lievi richiedono 1-2 settimane per risolversi, mentre i casi gravi possono portare alla morte [5].

SARS-CoV-2 colpisce il sistema respiratorio, provocando febbre e tosse secca [4]; tuttavia, il virus può causare insufficienza d'organo, principalmente nel cuore e nei reni, oltre a causare tempeste di citochine, che aumentano ulteriormente la mortalità. Il ciclo di vita virale di SARS-CoV-2 include

attaccamento, penetrazione, biosintesi, maturazione e rilascio. Dopo l'attacco, l'RNA virale entra nel nucleo cellulare per la replicazione e l'mRNA virale inizia a generare proteine ​​strutturali virali, comprese le proteine ​​​​spike (S), membrana (M), busta (E) e nucleocapside (N) [6]. Il recettore dell'enzima di conversione dell'angiotensina 2(ACE2), che è altamente espresso nei polmoni, ha anche dimostrato di agire come co-recettore per SARS-CoV [7].

SARS, MERS e SARS-CoV-2 sono tutti RNA CoV. Il genoma SARS-CoV-2 è identico per l'88% ai CoV simili alle sindromi respiratorie acute gravi derivate dai pipistrelli (SARS), per il 79% simile a SARS-CoV e per il 50% simile a MERS-CoV [8,9]. Le proteine ​​SARS-CoV-2 sono per il 90% -100 omologhe alla SARS-CoV; tuttavia, orf10 e orf8 sono diversi tra SARS-CoV-2 e SARS-CoV. Orf8 è una proteina accessoria per i CoV. Forma una proteina alfa elica a sei filamenti che migliora la capacità del virus di diffondersi. SARS-CoV-2 orfla/b, spike, involucro, membrana e nucleoproteina sono anche strettamente correlati a quelli di SARS-CoV [10] .

Poiché non esiste un agente antivirale specifico contro SARS-CoV-2, per il trattamento del COVID-19 vengono presi in considerazione i farmaci antivirali attualmente disponibili. Remdesivir è un nuovo farmaco antivirale introdotto specificamente per il virus Ebola nel 2015. Ha un effetto inibitorio sulla RNA polimerasi virale ed è stato recentemente utilizzato in alcuni studi per il trattamento del COVID-19 [11]. Favipiravir ha un effetto inibitorio sull'influenza e sul virus Ebola con lo stesso meccanismo ed è anche valutato in SARS-CoV-2 [12-14]. Lopinavir è un inibitore della proteasi virale ed è stato inizialmente sviluppato per il trattamento dell'HV. Studi in vitro hanno mostrato un effetto inibitorio del lopinavir nelle cellule infettate da CoV [15,16]; tuttavia, le revisioni sistematiche non hanno mostrato alcun effetto benefico contro SARS-CoV-2 [17].

Le piante medicinali sono state una fonte affidabile di farmaci naturali, compresi gli agenti antivirali, sin dai tempi antichi. La medicina tradizionale e gli studi etnofarmacologici di diversi paesi in tutto il mondo hanno sempre aperto nuove strade per la scoperta di farmaci [18-22]. Oseltamivir, che è un agente antivirale convenzionale, è un derivato dell'acido shikimico, un metabolita secondario dell'anice stellato (Illicium verum Hook.f.). Nel caso di SARS-CoV-2, studi in silico hanno rivelato le possibili proprietà antivirali degli ingredienti vegetali [23-25]. I flavonoidi sono un'ampia classe di sostanze fitochimiche che si trovano comunemente in diversi alimenti e verdure nella dieta umana con numerose preziose attività farmacologiche, comprese le proprietà antivirali. È dimostrato che questi composti possono inibire la patogenesi virale prendendo di mira le fasi essenziali del ciclo di vita virale [26]. Quercetina, catechine, kaempferol e baicalein sono esempi dei più importanti flavonoidi che esibiscono proprietà antivirali [18,27,28]. Questo studio mira a discutere l'evidenza antivirale disponibile dei flavonoidi come possibile trattamento contro SARS-CoV-2 considerando gli effetti precedentemente riportati di questi composti su cinque virus a RNA con manifestazioni cliniche simili e/o trattamenti farmacologici, inclusa l'influenza, virus dell'immunodeficienza umana (HIV), sindrome respiratoria acuta grave (SARS), sindrome respiratoria mediorientale (MERS) ed Ebola.

2. Risultati

Attività antiviraledei flavonoidi possono essere classificati in effetti antivirali diretti in cui il virus è direttamente influenzato dal flavonoide e effetti indiretti in cui il flavonoide migliora i meccanismi di difesa dell'ospite contro l'infezione virale. Qui, i meccanismi antivirali alla base dei flavonoidi sono discussi con riferimento ai flavonoidi più importanti che dimostrano questi meccanismi.

2.1. Meccanismo antivirale direttoS

2.1.1. Inibizione della proteasi virale

Le proteasi virali vengono utilizzate per scindere i precursori poliproteici virali in determinati punti per rilasciare proteine ​​​​funzionali. È stato anche dimostrato che specifiche proteasi virali scindono le proteine ​​​​della cellula ospite, inclusi i fattori di inizio della traduzione (eF4 e elF3d) nell'HIV, per prevenire la traduzione della proteina ospite [29,30]. I coronavirus generano tre tipi di proteasi virali, tra cui 3-cisteina simile alla chimotripsina (3CLpro), proteasi simile alla papaina (PLpro) e proteasi principale (M pro)[31]. 3CLpro è importante per la vita di SARS-CoV ciclo, PLpro svolge un ruolo nella replicazione SARS-CoV-2 e Mopar è responsabile della maturazione delle proteine ​​funzionali in SARS-CoV-2 [32,33]. Di conseguenza, queste molecole sono bersagli farmacologici adatti nella ricerca antivirale e nella scoperta di farmaci [34].

Kaempferol, che è un flavonoide abbondante in diversi alimenti, ha ridotto il CPE nelle cellule Vero E6 infettate da isolati clinici di SARS-CoV-2 con circa l'88% di inibizione a una concentrazione di 125 μM. Un'indagine accoppiata in silico suggerisce che l'inibizione dell'enzima SARS-CoV-2 3CLpro sia il principale meccanismo d'azione [35]. L'aggiunta di kaempferol a 3CLpro e PLpro di SARS-CoV e MERS-CoVexpressed in E.coli ha causato effetti antivirali attraverso l'inibizione di questi enzimi [36]. Park e collaboratori (2017) hanno mostrato che la presenza del gruppo idrossile nel kaempferolo provoca un'attività antivirale più potente attraverso l'inibizione di 3CLpro e PLpro [37]. L'epigallocatechina gallato (EGCG) è un flavonoide presente nel tè (Camellia sinensis L.) con proprietà antimicotiche, antibatteriche e antivirali [38.39]. Gli studi hanno indicato che l'EGCG inibisce l'attività della trascrittasi inversa (RT), l'attività della proteasi, p24, l'ingresso virale e la produzione virale nelle cellule THP-1 e H9 infettate da HIV-1 e la modifica dei liposomi dell'EGCG ne amplifica l'inibizione effetti. Studi privi di cellule hanno anche mostrato una significativa downregulation della cinetica della proteasi dopo il trattamento con EGCG. Il gruppo galloile nell'EGCG è considerato responsabile delle sue attività antibatteriche e antivirali [40]. L'isoliquiritigenina, un calcone, può essere utilizzato come agente terapeutico nelle infezioni batteriche e virali [41]. Questo composto ha mostrato un effetto inibitorio su SARS-CoV e MERS-CoV 3CLpro e PLpro espressi in E.coli. La presenza di un gruppo funzionale prenilico sull'anello resorcinolico consente la formazione di interazioni idrofobiche con le proteasi [37]. Le teaflavine sono polifenoli presenti in vari tipi di tè [42]. Gli esperimenti sulla proteasi ricombinante SARS-CoV hanno mostrato una significativa riduzione dell'attività di 3CLpro dopo il trattamento con theaflavina-3,3'-digallato con un valore IC50 di 9,5 uM. Il gruppo gallato attaccato alla posizione 3' in alcune teaflavine potrebbe essere essenziale per l'interazione con il sito proattivo 3CL [43]. Prenilisoflavonoidi estratti da Erythrina senegalensis DC. sono stati utilizzati per valutare l'attività anti-proteasica contro la proteasi ricombinante dell'HIV-1. I risultati hanno mostrato che i composti potrebbero inibire la proteasi ricombinante dell'HIV-1 in vitro con valori compresi tra 0,5 e 30 μMIC50. I gruppi idrossi e prenile potrebbero essere responsabili dell'inibizione della proteasi dell'HIV [44]. Quercetina e quercetina- -galattoside hanno sottoregolato l'attività di PLpro, 3CLpro, deubiquitinazione e DelSGylation in SARS-CoV, MERS-CoV e HIV-1. La posizione dei gruppi ossidrile potrebbe essere efficace nell'attività antiproteasica. La quercetina con cinque gruppi ossidrile nelle posizioni 3,5,7,3' e 4' ha mostrato un forte effetto inibitorio sulle proteasi virali; mentre la presenza del gruppo glicosile nelle posizioni 3,7A ha ridotto l'effetto inibitorio [37,45].

2.1.2. Inibizione della RNA polimerasi virale e dell'mRNA virale

L'RNA polimerasi RNA-dipendente (RdRp) è un importante enzima che catalizza la replicazione dell'RNA da una sequenza di RNA [46]. Questo enzima è codificato in tutti i virus a RNA, così come in alcuni eucarioti [47]. I virus sono parassiti intracellulari obbligati, cioè non possono sopravvivere indipendentemente dalle cellule. Devono utilizzare apparecchiature traslazionali cellulari per tradurre gli mRNA per la produzione di proteine, necessaria per la replicazione. Pertanto, qualsiasi interferenza con la traduzione dell'mRNA inibirebbe la replicazione, la diffusione e l'evoluzione virale [48].

Una recente indagine di Zandi et al. ha rivelato l'effetto antivirale in vitro della baicalina e della baicaleina contro l'infezione da SARS-CoV-2 nella linea cellulare Vero CCL-81 attraverso l'inibizione di RdRp, con una maggiore potenza della baicaleina. Ulteriori valutazioni in silico hanno mostrato che questi due composti hanno una maggiore affinità per RdRp rispetto alla riconsegna: anche il sito di attacco di baicalin e baicalein sembra essere diverso da quello di remdesivir; quindi, questi flavonoidi possono essere usati come trattamento adiuvante insieme a remdesivir [49]. Gli effetti della quercetina-7-O-glucoside(Q7G) sono stati valutati in uno studio in vitro su cellule MDCK infettate da virus influenzali A e B rispetto all'agente antivirale standard oseltamivir. Oseltamivir è stato utilizzato come farmaco controllato e ha mostrato un'attività antivirale moderata con valori di IC50 da 25,4 a 42,2 ug/mL; mentre il Q7G ha inibito il virus dell'influenza A e B con valori di IC50 da 3,10 ug/mL a 8,19 ug/mL. Oseltamivir ha anche mostrato un'attività più debole contro l'influenza B rispetto all'influenza A; mentre Q7G ha dimostrato una forte attività contro tutti i virus dell'influenza. Inoltre, i saggi quantitativi di PCR hanno riportato una maggiore diminuzione della sintesi dell'RNA virale dopo il trattamento con Q7G rispetto all'oseltamivir, indicando l'effetto inibitorio di Q7G sull'RNA polimerasi virale. L'analisi del docking molecolare ha rivelato che questa interazione è dovuta all'attaccamento di Q7G alla subunità PB2 dell'RNA polimerasi virale [50].

Oroxylin A(OA) è un flavonoide presente in Oroxylum Indicum(L.)Kurz. È stato dimostrato che l'OA può inibire diversi ceppi di influenza A nelle cellule MDCK in modo dose-dipendente. Il trattamento orale di topi infettati dal virus dell'influenza H1N1 con OA ha anche ridotto la morte indotta dal virus, la perdita di peso corporeo e il danno polmonare, con un tasso di sopravvivenza del 60,0 percento a una dose giornaliera di 100 mg/kg. È stato riportato che gli effetti antivirali dell'OA sono dovuti alla downregulation della trascrizione dell'mRNA della matrice H1N1 (M1) e della sintesi proteica (in et al. 2018). La proteina M1 è una proteina all'interno dell'involucro virale che si lega all'RNA virale e può mediare l'incapsulamento dei nuclei nucleoproteici dell'RNA nell'involucro della membrana [51]. Sebbene l'OA possa inibire la sintesi proteica, non potrebbe bloccare l'ingresso del virus nella cellula ospite o l'ingresso della nucleoproteina (NP) nel nucleo della cellula ospite [52]. Baicalin e biochanin A potrebbero inibire l'infezione influenzale da H5N1 nelle cellule A549 con valori IC50 rispettivamente di 18,79 e 8,92 μM. Questo effetto è stato mediato dalla soppressione dell'esportazione di ribonucleoproteina virale nucleare (RNP) [53]. Altri studi hanno anche dimostrato che la baicalina può sottoregolare l'espressione della proteina M1 dell'influenza [54,55].

La cdc host{0}}come la chinasi 1(CLK1) ha un ruolo chiave nello splicing del gene M2 del virus dell'influenza H1N1 ed è un importante bersaglio anti-influenzale. M2 è un canale protonico nell'involucro virale del virus dell'influenza A [56,57]. È stato dimostrato che la gallocatechina-7-isolata da Pithecellobium clypearia è un inibitore della cdc{11}}simile chinasi 1 (CLK1) dell'ospite, un bersaglio anti-influenzale grazie al suo ruolo nello splicing alternativo dell'mRNA virale M2. Le indagini sull'effetto della gallocatechina-7-gallato alla dose giornaliera di 30 mg/kg su topi ICR infettati dal virus H1N1 hanno mostrato una sopravvivenza significativamente maggiore fino a 8 giorni. Ha anche inibito il danno polmonare acuto indotto dal virus e la perdita di peso. Inoltre, le valutazioni sulle cellule A549 infettate da H1N1- hanno dimostrato una significativa sottoregolazione degli mRNA virali NP e M2. Inoltre, la fosforilazione dei fattori di splicing SF2/ASF e SC35, fattori chiave per lo splicing alternativo del gene del virus M2, è stata significativamente ridotta dopo il trattamento con gallocatechina-7-gallato [58]. Cirsimaritina (CST), un flavonoide di Artemisia scoparia Waldst. e Kitam è stato valutato in merito ai suoi effetti antivirali in vitro sulle cellule MDCK e THP-1 infettate con tre ceppi di virus dell'influenza che mostravano valori di IC50 compresi tra 5,8 e 11,1 ug/mL, rispetto a 3,4-8,9 ug/mL per la ribavirina. I dati hanno dimostrato che la CST potrebbe ridurre efficacemente l'influenza M2 e l'espressione proteica in modo dose-dipendente in modo che la potenza della CST a 20 ug/mL fosse superiore a 10 uM della ribavirina antivirale standard [59]. La luteolina è un altro flavonoide con un effetto inibitorio sull'espressione di M2mRNA. Nelle cellule MDCK infettate con diversi ceppi influenzali, 15 μM di luteolina erano più efficaci di 10 μM di oseltamivir nelle cellule infettate da H1N1 e H2N3. La luteolina ha anche sottoregolato l'espressione della proteina del rivestimento I (COPI) del virus dell'influenza, mediando l'ingresso del virus e la via endocitica, nelle cellule infette [60]. Santin è un flavonoide estratto da Artemisia rupestris L., che è stato anche suggerito per avere effetti virus anti-influenzali attraverso la soppressione dell'espressione dell'mRNA di M2 in modo dose-dipendente [61].

È stato indicato che la quercetina potrebbe essere un probabile agente terapeutico contro l'infezione dell'influenza nelle prime fasi dell'infezione in modo che possa essere utilizzata per la profilassi del virus dell'influenza. Le indagini sugli effetti della quercetina sulle cellule MDCK e A549 infettate da ceppi del virus dell'influenza A hanno rivelato che potrebbe inibire l'mRNA virale NP in modo dose-dipendente, con l'attività più alta a una concentrazione di 50 μM 【62】.

La ricerca ha dimostrato che la tricina(4'5,7-triidrossi-3',5'-dimetossiflavone) esibisce attività antivirali contro i ceppi di influenza A e B. I test RT-PCR hanno indicato che la tricina potrebbe sopprimere la sintesi dell'mRNA della proteina M nelle cellule MDCK infettate dal virus dell'influenza; senza effetti significativi sulla biosintesi di neuraminidasi ed emoagglutinina. La concentrazione efficace del 50% di tricina, che potrebbe inibire la sintesi dell'mRNA virale, era 3.4-10 uM

per i ceppi del virus dell'influenza A e 4,9 μM per il virus dell'influenza B. Nei topi infettati dal virus dell'influenza, la tricina con una dose di 20 ug/kg ha migliorato la perdita di peso corporeo e il tempo di sopravvivenza [63].

2.1.3. Ingresso virale, replicazione e infettività

I virus a RNA codificano le proteine ​​utilizzando il macchinario cellulare ospite per il loro ciclo di vita. La comprensione di queste necessità delle cellule ospiti non solo ci informa sui percorsi molecolari utilizzati dal virus, ma presenta anche ulteriori bersagli per lo sviluppo di farmaci [64].

Uno studio in vitro ha valutato l'effetto della quercetina e dell'isoramnetina sull'ingresso di SARS-CoV-2 nelle cellule ACE2h. L'ACE2 espresso sulle cellule polmonari è un co-recettore della proteina spike virale e, quindi, è l'obiettivo principale degli agenti antivirali contro SARS-CoV-2. È stato osservato che questi due flavonoidi hanno un'elevata affinità di legame con ACE2 e successivamente riducono l'ingresso virale attraverso l'inibizione dell'attaccamento della proteina spike a questo recettore [65]. Un altro studio ha valutato l'effetto della baicaleina sull'infezione da SARS-CoV-2 nelle cellule Vero E6 e nei topi transgenici hACE2. Una significativa riduzione è stata osservata nella replicazione virale in vitro e in vivo, nonché nella perdita di peso corporeo e nel danno polmonare negli animali [66]. Diidrossi-6'-metossi-3',5'-dimetilcalcone e miricetina-3'5'-dimetil etere 3-O- -D-galattopiranoside sono flavonoidi derivato da Cleistocalyx operculate (Roxb.) Merry. e LM Perry. Il saggio di riduzione dell'effetto citopatico (CPE) ha mostrato che questi flavonoidi inibiscono la replicazione virale del virus dell'influenza H1N1 nelle cellule MDCK. Studi sulla relazione struttura-attività (SAR) hanno indicato che i gruppi OH in C-7 e C{30}}, un doppio legame tra C-2 e C-3, e in particolare un gruppo carbonile nella posizione C-4, ci sono gruppi funzionali critici che migliorano significativamente le proprietà antivirali dei flavonoidi [67].3-il deossisappanchalcone (3DSC) isolato da Caesalpinia sappan L. potrebbe inibire la replicazione del virus dell'influenza in alte concentrazioni tramite inibizione dell'espressione virale di NP nelle cellule MDCK infettate dal virus H1N1. A parità di concentrazione (30 uM), sia la ribavirina che il 3DSC hanno mostrato una significativa inibizione dell'espressione di NP, sebbene la ribavirina abbia avuto un effetto più forte [68]. Gli studi hanno dimostrato che la biocanina A e la baicaleina inibiscono l'attivazione della caspasi-3, un enzima coinvolto nella replicazione virale [53,69]. Questi composti potrebbero anche inibire l'esportazione nucleare dei complessi virali RNP, che è fondamentale nella replicazione virale [53]. La biocanina A ha mostrato un effetto inibitorio contro p38 e NF-kB attivati ​​dal mitogeno, che hanno dimostrato di essere coinvolti nella replicazione virale. NF kB e p38 sono attivati ​​a causa dello stress ossidativo e sono noti per influenzare la replicazione e la patologia del virus dell'influenza A [53,70]. Indagini su colture cellulari di cellule MDCK e cellule A549 infettate con il virus dell'influenza hanno mostrato che la baicaleina potrebbe inibire la replicazione virale a concentrazioni di 20-80 ug/mL. È interessante notare che baicalin ha mostrato un'attività antivirale simile a ribavirina e oseltamivir a concentrazioni rispettivamente di 40 ug/mL e 60 ug/mL. La baicalina ha anche inibito la replicazione virale nei polmoni dei topi in vivo[71]. È stato dimostrato che la CST sottoregola la proteina NF-kB e la fosforilazione di NF-KB nel nucleo [59]. È già noto che NF-KB ha un ruolo importante ininfiammazione, lo stress ossidativoe soppressione dell'immunità dell'ospite [72]. La downregulation di NF-kB inibisce anche la replicazione in vari tipi di virus, incluso il virus dell'influenza [73].

Nelle cellule Vero E6 infettate da SARS-CoV-2, la naringenina potrebbe inibire il CPE in modo dipendente dal tempo e dalla concentrazione. Questo effetto è stato mediato dall'inibizione dei canali endolisosomiali a due pori (TPC), un percorso che coinvolge l'infettività di SARS-CoV-2, Ebola e MERS facilitando l'ingresso virale [74]. L'EGCG ha mostrato un effetto inibitorio dose-dipendente (25,50 μM) sulla replicazione dell'HIV nei linfociti T; tuttavia, l'inibizione della replicazione virale non è stata direttamente influenzata dall'inibizione della RT. Fassina et al. hanno analizzato l'enzima p24, che è coinvolto nel confezionamento delle particelle virali. I risultati hanno mostrato una downregulation della concentrazione di p24 e dell'attività RT nei linfoblasti T infetti da HIV. Sulla base dei seguenti risultati, è stato notato che l'EGCG ha inibito la replicazione virale attraverso la downregulation dell'infezione virale. Non vi è ancora alcuna certezza sull'esatto effetto dell'infezione virale EGCGon [75]. La segnalazione gp120 è comunemente associata all'aumento della replicazione dell'HIV-1 nelle cellule precedentemente infettate[75]. Gli studi mostrano l'effetto inibitorio della genisteina sulla gp120 e, successivamente, sulla replicazione virale HV-1. Non vi è stato alcun cambiamento nella replicazione virale dopo la somministrazione

estrazione di genisteina con una concentrazione di {{0}},5 ug/mL, ma in un intervallo di 5-10 ug/mL, la genisteina potrebbe sopprimere la replicazione virale [76]. L'erbacitrina è un flavonoide derivato dalla Drosera peltata Thunb. ed era precedentemente noto come agente antivirale. È stato dimostrato che l'erbacitrina inibisce sia la RT che l'integrasi nelle colture cellulari MT-4 e MT-2 infette da HIV-1, con conseguente blocco della replicazione virale in stadi diversi. Ad una concentrazione di 21,5 ug/M, l'erbacitrina potrebbe sopprimere l'attività R, mentre potrebbe inibire l'integrasi a una concentrazione inferiore, 2,15 uM [77]. La scutellarina purificata da Erigeron breviscapus è un flavonoide con attività anti-HIV-1. Questo flavonoide ha inibito l'attività RT dell'HIV-1 e la fusione cellulare come principali partecipanti alla replicazione virale [Z8]. L'esperidina e la linarina sono flavonoidi con rutinosio sull'anello A e sostituzione metossi (-OCH3) sull'anello B. È stato dimostrato che l'isoquercetina inibisce la replicazione del virus dell'influenza A e B nelle cellule MDCK infette. La combinazione di isoquercetina con amantadina ha anche mostrato un effetto sinergico sulla replicazione virale nelle cellule MDCK infettate dal virus dell'influenza A solo a basse dosi (0,5 μM per isoquercetina e 1 μM per amantadina). I valori del titolo del virus dopo la somministrazione di isoquercetina e amantadina erano circa 7,5; l'aumento delle concentrazioni di isoquercetina e amantadina ha abbassato l'effetto sinergico sui titoli del virus al valore di 5 [79]. Il Q3R derivato da Houttuynia cordata esercita effetti anti-influenzali del virus. Gli effetti di Q3R sulle cellule MDCK infettate dal virus dell'influenza A sono stati confrontati con l'oseltamivir. Lesioni ed edemi polmonari sono stati inibiti dal Q3R più dell'oseltamivir. Q3R ha avuto anche un'efficacia maggiore rispetto a oseltamivir. L'effetto inibitorio del Q3R sulla replicazione del virus dell'influenza è stato indiretto e attraverso l'interazione con le particelle virali. Oseltamivir ha dimostrato un'attività antivirale moderata, circa il 58% contro il virus dell'influenza A, e una debole attività antivirale inferiore al 49% con dosi inferiori a 10 ug/mL; mentre Q3R ha mostrato un'inibizione virale del 86 percento a 100 ug/mL e un'inibizione del 66 percento a concentrazioni di 10 ug/mL [80]. La quercetina 3- -OD-glucoside (Q3G) ha dimostrato di prevenire la replicazione del virus Ebola in vitro. La somministrazione profilattica di Q3G 30 minuti prima dell'infezione ha mostrato una significativa prevenzione del virus Ebola. Q3G potrebbe anche inibire l'ingresso virale nelle fasi iniziali. Quindi O3G potrebbe essere un flavonoide efficace per la profilassi del virus Ebola [81].

2.2. Effetti antivirali indiretti

2.2.1. Effetto sugli interferoni

Gli interferoni (IFN) comprendono un gruppo di proteine ​​prodotte da diverse cellule immunitarie in risposta a molti agenti patogeni come virus, parassiti, batteri e cellule tumorali. Esistono tre classi principali di IFN, inclusi interferoni di tipo I o stabili agli acidi (sottotipi IFN, IFN-, IFN-K, IFN-e, IFN-w e IFN-t), tipo II (IFN-y), e IFN di tipo III noti come IFN-λ 【82-84】. Mostrano un'ampia gamma di attività biologiche come l'attivazione della risposta immunitaria innata, l'aumento dell'espressione delle molecole del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC), la soppressione dell'angiogenesi. Il loro ruolo più importante è quello di interferire con le infezioni virali [84,85].

Nelle prime fasi dell'infezione virale, gli IFN attivano l'innatosistema immune. Studi recenti hanno riportato una diminuzione dell'induzione e della segnalazione di IFN di tipo I e di tipo I nei pazienti con COVID-19 [86]. Questi tipi di IFN hanno dimostrato effetti antivirali diminuendo l'immigrazione dei neutrofili nel sito di infiammazione, aumentando la presentazione dell'antigene, sopprimendo la pro-infiammazione mediata dai macrofagi mononucleati e attivando l'immunità acquisita per la progressione delle risposte delle cellule B e T antigene-specifiche. 86-90]. Pertanto, l'uso di IFN nella fase iniziale della malattia potrebbe ridurre i sintomi di COVID-19 riducendo la replicazione virale. I ricercatori hanno anche riferito che i livelli di IFN-potrebbero aumentare nei pazienti COVID-19 con ARDS. Il rapido aumento dei livelli di IFN potrebbe invitare citochine pro-infiammatorie nel tessuto alveolare e provocare infiammazione polmonare e danno polmonare[90,91]. Pertanto, sembra che la sovraregolazione o la disregolazione degli IFN e di altre risposte di citochine pro-infiammatorie o entrambe potrebbero esercitare un ruolo significativo nella progressione e nelle caratteristiche patologiche della SARS-CoV-2.

Lascia al. studiare gli effetti anti-influenzali della baicalina, un glicosilossiflavone che è l'7-O-glucuronide della baicaleina, nel modello in vitro e in vivo dell'infezione da virus dell'influenza A. Il fattore 6 (TRAF6) associato al recettore del TNF è un mediatore efficace nella via di segnalazione della produzione di IFN. La sovraespressione di TRAF6 porta ad un aumento della produzione di IFN di tipo I [54]. I microRNA (miRNA) sono piccole molecole che controllano la regolazione genica post-trascrizionalmente [92]. miR-146a ha dimostrato di avere un ruolo regolatore nell'infiammazione [93]. miR-146a potrebbe migliorare la replicazione di H1N1 e H3N2 attraverso la downregulation di TRAF6. Baicalin (20 ug/mL) ha indicato una significativa riduzione dell'espressione di miR-146a, NP virale, livelli di proteine ​​Ml, titolo virale e anche un aumento del tasso di sopravvivenza dei topi [54]. In un altro studio, Nayak e colleghi hanno rappresentato l'attività del virus anti-influenzale (H1N1-pdm09) della baicalina attraverso la regolazione della proteina virale NS1, con conseguente up-regulation del fattore di regolazione dell'interferone 3 (IRF-3), IFN - , e IFN- . Questa sovraregolazione dell'IFN ha ridotto la replicazione virale che potrebbe ridurre i trascritti virali e l'espressione di citochine pro-infiammatorie, tra cui IL-8 e TNF-x [55].

Ding et al. progettato uno studio per studiare gli effetti dell'esperidina, un glicoside flavanonico, nel danno polmonare indotto dal virus dell'influenza A (H1N1) nei ratti maschi. I risultati hanno mostrato che l'esperidina attenuava il danno polmonare diminuendo la produzione di citochine pro-infiammatorie, inclusi IFN-, TNF-x e IL-6, sopprimendo le vie di segnalazione MAPK. L'esperidina ha anche ridotto l'IFN- nelle cellule endoteliali microvascolari polmonari infettate da H1N1 [94]. In un altro studio di Kim et al. l'isoquercetina ha attenuato efficacemente il danno polmonare indotto dal virus H1N1 nei topi riducendo l'IFN-, iNOS, RANTES, i titoli dei virus, la bronchite virale e la bronchiolite [79].

L'oroxilina A (OA) di Oroxylum Indicum(L.)Kurz ha prevenuto il danno polmonare indotto dal virus dell'influenza A H1NI nei topi attraverso la sovraregolazione di IFN- e IFN- 【52】. Wogonin, un altro flavonoide isolato da Scutellaria baicalensis Georgi, ha mostrato una significativa attività anti-influenzale mediante la regolazione dei percorsi AMPK. La wogonin ha anche aumentato la regolazione delle molecole a valle di IFN-, IFN-λl e IFN, incluso il gene di resistenza ai mixovirus A (MxA) e 2-5' oligoadenilato sintetasi (OAS), nelle cellule infettate da MDCK e A549 [95].

2.2.2. Effetto sulle citochine pro-infiammatorie (TNF, IL e MCP)

I CoV contengono alcuni frame di lettura aperti che codificano alcune proteine ​​accessorie. È stato dimostrato che queste proteine ​​accessorie modulano le vie infiammatorie come la segnalazione dell'IFN e le citochine pro-infiammatorie [96]. È stato chiarito che la prognosi di COVID-19 potrebbe essere peggiorata dalla secrezione di citochine pro-infiammatorie, tra cui interleuchine, IFNy e TNF- [97]. Blanco-Mello et al. hanno indicato che una risposta immunitaria inappropriata potrebbe aiutare la replicazione del virus e le complicazioni dovute a tipi gravi di COVID-19 [98]. Ruan et al. hanno anche dimostrato che un aumento delle citochine infiammatorie come IL-6 è associato a ARDS, insufficienza respiratoria ed esiti clinici avversi [99]. L'insufficienza respiratoria causata da danno polmonare è il risultato della sovrapproduzione di citochine pro-infiammatorie dopo l'infiltrazione di cellule immunitarie nel polmone [100]. La tempesta di citochine è una risposta infiammatoria sistemica associata a un'ampia gamma di fattori come infezioni e determinati farmaci. Diversi studi hanno mostrato una connessione significativa tra tempesta di citochine, grave infiammazione e insufficienza multiorgano nei pazienti COVID-19 [101-103]. Il riconoscimento del virus SARS-CoV-2 con il sistema immunitario innato e adattivo potrebbe comportare l'attivazione e la produzione di citochine infiammatorie. Secondo studi recenti, i livelli plasmatici di citochine pro-infiammatorie sono aumentati nei pazienti con COVID-19. Queste citochine infiammatorie come TNF- , IL6, IL 2, IL-1 , IL7, IL 10 e IL-18, nonché la proteina chemiotattica dei monociti-1(MCP-1 ), hanno ruoli chiave nella progressione patologica e nella gravità di COVID-19 attraverso un aumento della carica virale, polmonite, danno polmonare, disturbi neurologici e mortalità [97,101].

Questi eventi potrebbero portare a insufficienza multiorgano e danno polmonare come complicanza principale della SARS-CoV-2; pertanto, la modulazione delle citochine pro-infiammatorie può essere considerata un obiettivo di trattamento ragionevole in COVID-19. Inoltre, in molti studi sono stati dimostrati significativi effetti antinfiammatori dei flavonoidi; quindi, potrebbero essere composti promettenti nella lotta contro le complicazioni legate all'infiammazione di COVID-19 [97].

Yang et al. ha dimostrato l'effetto protettivo del 3-deossisappancalcone （30 μM） sull'infiammazione e l'apoptosi indotte dal virus dell'influenza H1N1 in vitro diminuendo i livelli di IL{5}} e IL{6}} [68]. La bacaleina, un flavone, e la biocanina A, un isoflavone O-metilato, hanno ridotto l'espressione di citochine pro-infiammatorie nelle cellule A549 e nei macrofagi primari derivati ​​da monociti umani (MDM) infettati da ceppi di virus dell'influenza H5N1, che potrebbero prevenire l'attivazione della via infiammatoria e danni ai tessuti [53]. Nelle cellule A549 e MDCK infettate dall'influenza A, la baicalina, la forma glicosilata della baicaleina (baicaleina-7-glucuronide), potrebbe aumentare i livelli di IFN, con conseguente riduzione della produzione di citochine pro-infiammatorie. Pertanto, IL-8 e TNF- erano significativamente inferiori nelle cellule trattate con baicalina rispetto alle cellule di controllo non trattate [55].

Uno studio in vitro ha dimostrato che concentrazioni di 2,5, 5 e 10 ug/mL di CST, un dimetossiflavone, hanno un effetto significativo sull'attenuazione della via di trasduzione del segnale NF-kB nelle cellule THP-1 infettate dall'influenza A virus (H1N1). Dopo l'inibizione di NF-kB, la produzione di citochine pro-infiammatorie tra cui I-1, IL-8, IL-10 e TNF-, nonché la proteina COX{{ correlata all'infiammazione 15}}, sono stati soppressi dal CST in modo dose-dipendente[59]. In uno studio in vitro di Yonekawa et al. sulle proprietà antivirali di esperidina e linarina, questi glicosidi flavonoidi hanno inibito la replicazione virale R5-HIV-1-NL(AD8) nelle cellule CD4 più NKT aumentando la produzione di citochine antinfiammatorie tra cui IL-2, IL-5 e IL-13. È stato osservato che l'effetto stimolante di questi due flavonoidi dipende in modo critico dalla frazione di zucchero poiché gli agliconi (esperetina e acacetina) non hanno mostrato tale attività. Inoltre, la sostituzione metossi(-OCH3) all'anello B è essenziale per l'attività stimolatoria dell'esperidina e della linarina sulle cellule CD4 più NKT. Potrebbero anche indurre la secrezione di RANTES, MIP-1 e MIP-1 da V61 più i recettori delle cellule T che esprimono i recettori delle cellule T che successivamente sopprimono la replicazione virale nelle cellule CD4 più NKT[104]. Kang et al. riportato effetti anti-influenzali di flavonoidi purificati da Pithecellobium clypearia Benth sul modello in vitro di infezione da virus dell'influenza A. Questi flavonoidi purificati hanno soppresso la produzione di IL-6 e MCP-1 nelle cellule polmonari umane A549 infettate da H1N1-[105]. Mehrbod et al. ha studiato l'effetto antinfiammatorio della quercetina-3-O- -L-rhamnopyranoside(Q3R), un flavone glicosilato, sulle cellule MDCK infettate dal virus dell'influenza H1N1. Q3R a una concentrazione di 150 ug/mL ha ridotto significativamente il titolo del virus e aumentato la produzione di IL{51}}, che potrebbe aumentare ulteriormente la secrezione di IL{52}} da parte dei linfociti T CD4 più e potenziarne l'attività antivirale. D'altra parte, l'O3R ha soppresso la produzione di TNF come uno degli importanti mediatori infiammatori che causano febbre e innescano la via pro-infiammatoria di NF-kB, peggiorando ulteriormente le condizioni dei pazienti [106]. Il trimetossi flavone Santin ha dimostrato attività anti-influenzale nelle cellule THP-1 e MDCK a una concentrazione di 60 μM. Il virus dell'influenza A（H3N2） induce la produzione di citochine pro-infiammatorie nelle cellule THP-1 con conseguente infiammazione e danno polmonare [61]. Le citochine antinfiammatorie potrebbero anche essere alterate durante l'infezione da virus dell'influenza.IL-10 è una citochina antinfiammatoria che può essere indotta dal virus dell'influenza. IL-10 inibisce le cellule T killer naturali invarianti sottoregolando la produzione di IL-12 da parte delle cellule dendritiche derivate da monociti polmonari[107]. I livelli di IL-6, IL-8, IL-10, IL-1 e TNF- sono stati significativamente ridotti nel gruppo trattato con Santin attraverso la downregulation di MAPK e NF- vie di segnalazione kB [61].

Oltre a quanto sopra, gallocatechina-7-gallato, genisteina e teaflavine sono altri flavonoidi con effetti modulanti sulla produzione di citochine pro-infiammatorie [58,76,108]; quindi, queste molecole sembrano avere un effetto antinfiammatorio desiderabile, utile nel controllare l'infiammazione correlata all'infezione virale.

2.2.3. Effetto sulle vie infiammatorie subcellulari (NF-kB, PI3K/Akt e MAPK/JNK)

Quando un virus entra in una cellula ospite, la cellula ospite riconosce la sua replicazione attraverso i recettori di riconoscimento del pattern (PRR)[109]. La struttura dell'RNA del virus è coinvolta nell'oligomerizzazione dei PRR e nell'attivazione dei fattori di trascrizione a valle, in particolare i fattori regolatori dell'interferone (IRF) e NF-kB. L'attivazione di NF-kB e IRF porta all'impegno della difesa antivirale cellulare mediante l'induzione di interferoni di tipo I e I e la secrezione di chemochine [110].

Chiou et al. hanno studiato gli effetti del8-prenylkaempferol(8-PK) nelle cellule A549 infettate dal virus dell'influenza A (H1N1). I risultati hanno mostrato che l'interferenza con la via PI3K-Akt è il meccanismo principale della 8-PK che porta a effetti protettivi contro il virus dell'influenza A.8-La PK ha ridotto la traslocazione nucleare di NF-kB e IRF-3 attraverso l'attenuazione della fosforilazione di Akt e dell'attività di PI3K. Infine, con una ridotta produzione di attivazione regolata, le cellule T normali espresse e secrete (RANTES) attraverso le cellule A549 infettate da H1N1-[111]. Zhu et al. rappresentava l'autofagia indotta dal virus dell'influenza A (H3N2) nelle cellule infettate da A549 e Ana-1 sopprimendo la via di segnalazione mTOR. La baicalina potrebbe aumentare la fosforilazione di mTOR e salvare gli effetti del virus H3N2 in modo dose-dipendente [112]. In un altro studio, è stato scoperto che la baicalina esercita l'attività del virus dell'influenza (H1N1-pdm09) mediante la downregulation della via PI3k/Akt causata dalla modulazione dell'espressione 55 della proteina virale NS1]. Inoltre, la biocanina A, un isoflavone O-metilato, ha indicato effetti protettivi sulle cellule infettate dal virus dell'influenza A H5N1 attraverso la diminuzione della fosforilazione di AKT, ERK1/2, JNK e p38. Potrebbe anche modulare le vie di segnalazione cellulare, diminuire IL-6, IL{40}}, CXCL10(IP-10), TNF- e migliorare i livelli di IkB [53].

CST ha rappresentato effetti inibitori sul modello in vitro dell'infezione da virus dell'influenza A attraverso l'inibizione della via del segnale NF-kB/p65, con conseguente downregulation delle citochine pro-infiammatorie. CST ha anche ridotto i livelli di fosfo-p38 MAPK e fosfo-JNK [59]. In un altro studio di Ding et al., la somministrazione di esperidina alle dosi giornaliere di 200 e 500 mg/kg per cinque giorni potrebbe inibire l'infiammazione polmonare nel danno polmonare indotto dal virus dell'influenza A (H1N1) nei ratti. Questo effetto è stato mediato attraverso l'attenuazione della produzione di citochine pro-infiammatorie, tra cui IL-6 e TNF-. L'esperidina ha anche ridotto l'espressione di IL-6 e di TNF nelle cellule endoteliali microvascolari polmonari infettate da H1N1 attraverso l'inibizione delle vie di segnalazione MAPK [94]. Inoltre, gli studi hanno suggerito la via di segnalazione ERK come modulatore principale della via di segnalazione MAPK. Isorham-netin (50 μM), un monometossi flavone, ha ridotto la fosforilazione di ERK nelle cellule MDCK dopo l'infezione da virus dell'influenza A(H1N1) [113]. Jeong e colleghi hanno studiato gli effetti citotossici della pirossilina A e della tectorigenina nelle cellule CHME5 e nei macrofagi umani primari infettati da HIV-1-D3. Questi flavonoidi esercitano i loro effetti riducendo la fosforilazione di PI3K, Akt, mTOR, PDK1, GSK-3 e Bad nelle cellule trattate con lipopolisaccaride/cicloesimmide Santin ha soppresso la replicazione del virus dell'influenza A nell'MDCK e THP-1 cellule infette [114]. Alla concentrazione di 60 uM, Santin ha attenuato la fosforilazione di p38 MAPK, ERK, JNK/SAPK e NF-kB[61].