La gestione dell'ossigeno disciolto da parte di un contattore a membrana a fibra cava in polipropilene influisce sull'invecchiamento del vino

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Sfondo: Numerose pratiche enologiche possono causare un eccesso di ossigeno disciolto nel vino, determinando quindi difetti sensoriali e cromatici a breve e lungo termine. È quindi necessario gestire l'eccesso di ossigeno prima dell'imbottigliamento. Metodi: In questo studio, la gestione del contenuto di ossigeno disciolto mediante un apparato di contattore a membrana a fibra cava di polipropilene è stata eseguita in due vini di diversi vitigni (Aglianico e Falanghina). I vini sono stati analizzati dopo 11-mesi di invecchiamento. Il contenuto di antociani e acetaldeide è stato valutato mediante HPLC. Inoltre, altrofenolicocomposti e caratteristiche cromatiche sono stati analizzati con metodi spettrofotometrici. Sono state condotte analisi NMR e HR ESIMS per valutare il numero di proantocianine e pigmenti polimerici. Risultati: Dopo 11 mesi di affinamento, in entrambi i vini, è stata rilevata una diminuzione della SO2 libera e totale rispetto ai valori iniziali. Nei vini con i più alti livelli di ossigeno disciolto si è osservata una perdita più notevole. Non sono state rilevate differenze significative in termini di parametri di colore. Nel vino rosso con il più alto contenuto di ossigeno, una massiccia formazione di polimeripigmentie sono stati osservati tannini reattivi alla BSA, al contrario dei vini con livelli di ossigeno più bassi. Conclusione: lo studio ha dimostrato che il contattore a membrana può rivelarsi uno strumento efficace per gestire l'ossigeno disciolto nei vini per prevenirne il deterioramento ossidativo.

Parole chiave: ossidazione; contattore a membrana; vino; pigmenti polimerici

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1. Introduzione

Il vino è un sistema chimicamente dinamico e anche dopo la fermentazione la sua composizione continua ad evolversi durante la conservazione. Questi cambiamenti post-fermentativi sono detti invecchiamento, ma occorre distinguere tra i cambiamenti che si verificano durante la fase di maturazione (es. conservazione del vino sfuso in vasca o botte), quando è ancora consentito l'intervento dell'enologo, e quelli che prendono posto durante la fase di invecchiamento una volta che il vino è stato sigillato in bottiglia e l'unico intervento possibile è limitato alla selezione delle condizioni di conservazione più idonee.

Tra i composti del vino, i fenolici sono quelli più colpiti dall'invecchiamento. Provengono dall'uva (flavonoidie non flavonoidi) e costituiscono uno dei parametri di qualità del vino più importanti. Durante la vinificazione e l'invecchiamento, subiscono principalmente i fenoliciossidazionereazioni, che non solo influiscono sulla composizione fenolica stessa ma determinano anche variazioni in termini di caratteristiche sensoriali, come colore e astringenza.

I composti fenolici sono i principali reagenti ad essere ossidati in presenza di ossigeno e metalli (Fe3 più Cu2 più), dando luogo ad una cascata di trasformazioni chimiche che possono determinare un eccessivo deterioramento del vino [1]. Vinoossidazioneconsiste in una serie di reazioni: in primo luogo, l'ossigeno viene ridotto a perossido di idrogeno interagendo con i metalli di transizione, inclusi gli ioni ferro e rame, in presenza di subunità catecoliche che vengono ossidate a chinoni [2]. I chinoni reagiscono fortemente con i composti nucleofili, come gli antiossidanti (anidride solforosa, glutatione, acido ascorbico), tioli volatili aromatici desiderabili

(ad esempio, 3-sulfanylhexanol), tioli aromatici indesiderati (ad esempio, acido solfidrico), aminoacidi (ad esempio, fenilalanina, metionina) e numerosi polifenoli (principalmente flavonoli). I prodotti di queste reazioni possono portare alla formazione di condensapigmenti polimerici—particolarmente importante nei vini rossi—o anche alla perdita di colore e caratteri varietali [3]. In una fase successiva, le specie ferrose o rameose reagiscono con il perossido di idrogeno mediante la reazione di Fenton per produrre il radicale idrossile, un forte ossidante, in grado di reagire con tutti i costituenti organici in proporzione alla concentrazione [4]. Il composto organico più abbondante nel vino è l'etanolo, che viene convertito in acetaldeide una volta ossidato dal radicale idrossile.

In conseguenza diossidazione, nel vino rosso i pigmenti antocianici nativi si trasformano rapidamente in pigmenti più stabili attraverso vari tipi di reazioni come reazioni di condensazione mediate da aldeide con tannini e reazioni di ciclo-addizione che portano alla formazione di proantocianine [5]. Le reazioni di ossidazione contribuiscono anche a modificare l'astringenza del vino modificando la struttura dei tannini in conseguenza di reazioni intra e intermolecolari mediate dall'ossigeno [6]. Questi "prodotti stabilizzati" antociani o tannini pigmentati persistono molto più a lungo nel vino che nelle loro forme iniziali [7]. Pertanto, basse quantità di ossigeno nel vino rosso sono importanti per stabilizzare il colore o l'astringenza. Lo stesso Pasteur, nei suoi studi sul vino, ha teorizzato che solo quando un vino è esposto all'ossigeno può sviluppare attributi che lo rendono un prodotto di alta qualità finemente invecchiato. Durante la vinificazione, l'ossigeno gioca un ruolo cruciale nel processo di fermentazione. Favorisce la sintesi della biomassa dei lieviti e favorisce una sana fermentazione. Diversi studi hanno dimostrato che il rischio di fermentazioni bloccate e lente si riduce dopo l'aggiunta di ossigeno di 10-20 mg/L [8].

Nei vini bianchi, l'ossidazione è solitamente associata a importanti variazioni di colore. Il colore bruno è normalmente indesiderato perché è un segno di ossidazione nel vino bianco da tavola. La colorazione marrone può essere indotta dall'ossidazione enzimatica o chimica mediata dall'ossigeno. Quest'ultimo è più lento dell'ossidazione indotta da enzimi. Il vino bianco è generalmente più sensibile all'O rispetto al vino rosso. Anche piccole aggiunte di O. al vino bianco possono portare alla perdita dell'aroma, in particolare del fruttato con la comparsa di aromi sgradevoli descritti come caramello, rancido, mangime d'allevamento, miele e verdure cotte. I chinoni generati dall'ossidazione possono reagire con i tioli mediante la reazione di addizione di Michael o generare H2O2, come riportato sopra. L'ambiente ossidativo in tutte le fasi della vinificazione è positivamente correlato alla formazione di questi prodotti. Durante l'invecchiamento del vino rosso in botti di rovere, il processo ossidativo induce anche la formazione di sotolone per ossidazione della treonina o per reazione dell'acetaldeide con acido -chetobutirrico. La degradazione ossidativa di fenilalanina e -feniletanolo in un barile porta anche a concentrazioni più elevate di fenilacetaldeide [9].

Come descritto sopra, l'ossigeno può avere effetti benefici o dannosi sulla qualità del vino. Il livello di esposizione all'ossigeno del vino durante la vinificazione o l'invecchiamento è fondamentale in quanto può influire sul prodotto finale. Singleton [10] ha stimato la quantità di ossigeno che il vino bianco o rosso potrebbe assorbire prima che emergano difetti ossidativi. Nel vino bianco, la tolleranza è di circa 10 saturazioni d'aria rispetto al vino rosso, che può tollerare più di 30 saturazioni d'aria (180 mLO2/L). Ha anche raccomandato circa 10 saturazioni per migliorare la qualità del vino rosso.

La gestione dell'ossigeno durante le fasi di vinificazione e conservazione è, quindi, importante e deve essere gestita secondo le conoscenze acquisite per evitare l'insorgere di caratteri ossidativi. Dopo la vinificazione, il vino subisce solitamente una serie di pratiche di stabilizzazione come travasi, refrigerazione e filtrazione che possono determinare un apporto di ossigeno incontrollato. Inoltre, sono ora comuni nuovi metodi di vinificazione che utilizzano serbatoi di acciaio inossidabile e sistemi che consentono una micro-fornitura controllata di ossigeno (micro-ossigenazione). Anche quando sono stati compiuti sforzi specifici per produrre vini il più possibile resistenti ad ulteriori apporti di ossigeno, tutto l'ossigeno disciolto incontrollato nel vino può determinare un ulteriore sviluppo di caratteri ossidanti una volta imbottigliato. In questo contesto, l'uso di un contattore a membrana per gestire l'ossigeno in un vino prima dell'imbottigliamento potrebbe essere una strategia vincente per ottenere i migliori vini possibili.

I contattori a membrana sono tra i sistemi industriali più utilizzati e questa tecnologia si è dimostrata utile in una gamma di applicazioni liquido/liquido e gas/liquido in fermentazione, prodotti farmaceutici, trattamento delle acque reflue, separazioni chirali, produzione di semiconduttori, carbonatazione di bevande, estrazione di ioni metallici , estrazione proteica, rimozione dei COV dai gas di scarico, distillazione osmotica e dealcolazione del vino [11,12]. È un dispositivo che realizza il trasferimento di massa gas/liquido o liquido/liquido senza dispersione di una fase nell'altra. Sebbene la tecnologia del contattore a membrana sia stata introdotta come strumento per la gestione del gas nei vini [13,14] fino ad ora pochi studi si sono occupati dell'efficacia della sua applicazione prima dell'imbottigliamento per regolare l'evoluzione del vino bianco e rosso durante l'affinamento in bottiglia.

In questo studio è stata eseguita una deossigenazione parziale su due vini monovarietali: Aglianico e Falanghina. L'effetto della rimozione dell'ossigeno su diversi parametri del vino come contenuto di SO2 libero e legato e contenuto di acetaldeide è stato valutato dopo 1l mesi di affinamento in bottiglia. Per il vino rosso è stato valutato anche l'effetto sulle caratteristiche cromatiche e sui principali composti fenolici.

2. Risultati e discussione

In questo studio, due vini commerciali (Aglianico (R) e Falanghina(W)) sono stati sottoposti a un processo di deossigenazione utilizzando la tecnologia del contattore a membrana per ottenere tre vini con livelli decrescenti di ossigeno disciolto (alto (H), medio (M), e basso (L) per ogni vino) prima della fase di imbottigliamento. Dopo 11 mesi di affinamento in bottiglia, gli effetti su anidride solforosa, acetaldeide, caratteri cromatici,pigmenti polimerici, VRF, BSA-tannini e S fenolico totale sono stati valutati.

2.1. Diossido di zolfo

La concentrazione di SO2 libera e totale è stata monitorata dopo 11 mesi di affinamento nel vino Aglianico (Tabella 1). Per tutti i campioni è stata osservata una perdita di SO2 rispetto al tempo di imbottigliamento (SO libera, 18 mg/L, SO tot, 43 mg/L) e la maggiore diminuzione dei valori di SO2 totale è stata osservata nei vini con contenuto di ossigeno all'imbottigliamento (RHO2 e RMO2), come previsto.

Durante il processo di invecchiamento, la forma più abbondante di SO2 libera al pH del vino, lo ione bisolfito (HSO, in equilibrio con SO molecolare,), viene consumata dalla reazione con acqua ossigenata e diversi componenti elettrofili del vino, come quelli prodotto dalla cascata di ossidazione, inclusi chinone e acetaldeide [15]. Nelle aziende vinicole, è pratica comune misurare la cosiddetta "SO libera", ovvero la somma di SO molecolare e ione bisolfito. Quest'ultimo composto può formare addotti covalenti con elettrofili, detti leganti SO2, che possono essere classificati come deboli o forti in base alla costante di dissociazione degli addotti solfitici formati. Questi addotti solfitici sono chiamati SO legati e la somma

di SO libero e vincolato dà il "SO totale". Gli SO liberi e legati, sono in equilibrio tra loro nel vino. Inoltre, durante l'ossidazione, dall'equilibrio tra queste due forme di SO2 e dal consumo di SO2 libera, la forma combinata viene rilasciata per ristabilire l'equilibrio. In tutti i vini rossi trattati sono stati rilevati valori di SO2 libera inferiori a 3,84 mg/L dopo 11 mesi di affinamento in bottiglia. Questi valori sono ben al di sotto del limite di quantificazione dei metodi ufficiali di analisi della SO2 libera [16]; pertanto, è più corretto considerare trascurabile il valore di SO libera, mentre i valori di SO totale, sono risultati inferiori nei campioni imbottigliati con contenuto maggiore di ossigeno disciolto (RHO2). Il passaggio tra l'invecchiamento del vino libero e quello combinato potrebbe essere il motivo per cui nei vini sono stati rilevati livelli decrescenti di SO2 totale con l'aumento dell'ossigeno disciolto all'imbottigliamento. Oltre al consumo di SO2 per reazioni di ossidazione, una parte di essa può anche andare perduta durante l'invecchiamento a causa delle reazioni dell'anidride solforosa con i flavanoli. Il meccanismo di formazione dei prodotti 4/ß-solfonati è ancora incerto. Si ipotizza che derivati ​​monomerici 4ß-solfonati siano formati dalla depolimerizzazione catalizzata da acido delle proantocianidine [17].

Le concentrazioni di SO2 libera e totale (Tabella 1) sono state monitorate dopo 11 mesi di affinamento in vino bianco il cui comportamento è risultato uguale a quello del vino rosso. Inoltre, in questo caso, è stata rilevata una perdita di SO2 libera e totale rispetto ai valori iniziali (SO libera,26 mg/L e SO tot. 89 mg/L). l'imbottigliamento (OMS2) ha mostrato un contenuto inferiore di SO2 libera e totale.

L'acetaldeide, formata dall'ossidazione catalizzata da metalli dell'etanolo durante l'ossidazione del vino, era maggiore a 11 mesi di invecchiamento nel campione OMS, rispetto al campione WMO e WLO, come previsto dato il contenuto inferiore di SO libera e totale, in OMS, campioni (Tabella 2). Poiché il rapporto ponderale tra acetaldeide e anidride solforosa è 1,4/1 (1,4 mg di SO2 consumati per 1 mg di CH3CHO), potremmo valutare che la quantità di acetaldeide nel campione WHO è totalmente combinata con SO, (50 mg di acetaldeide combinata con 70 mg di SO2) e considerando i livelli trascurabili di anidride solforosa libera dopo 11 mesi di invecchiamento, si prevede che ulteriori esposizioni all'ossigeno possano portare alla comparsa di acetaldeide libera.

Nei vini rossi, la concentrazione di acetaldeide non differisce tra i campioni analizzati. Ciò è probabilmente dovuto al fatto che, in presenza di antociani e di una maggiore concentrazione di flavanoli, l'acetaldeide è coinvolta in numerose reazioni con questi fenolici durante l'invecchiamento. Come discusso di seguito, la reazione più importante che coinvolge acetaldeide, antociani e flavonoli è la formazione di composti a ponte etilico [18,19] e oligomeri legati a etile, che possono ulteriormente reagire con acetaldeide, antociani e flavanoli aggiuntivi per generare un pirano anello o altre strutture di tipo polimerico. In definitiva, questi prodotti possono alterare gli attributi sensoriali del vino [20] influendo su alcune caratteristiche chiave del vino come colore, sapore e astringenza.

2.2. Effetto su pigmenti e caratteri cromatici

I dati sul contenuto di antociani monomerici nei vini rossi trattati dopo 11 mesi di affinamento in bottiglia hanno mostrato (Tabella 3 e Materiali Supplementari Figura S1)una perdita di malvidina-3-glucoside nel campione RHO2 con una concentrazione di ossigeno maggiore rispetto a RMO2 e RLO2. Coerentemente, sono state rilevate differenze in termini di antociani totali tra i vini (Figura 1). I vini con una bassa concentrazione di ossigeno all'imbottigliamento hanno mostrato una maggiore concentrazione di antociani autoctoni totali rispetto a quelli con maggiori concentrazioni di ossigeno disciolto. L'effetto del trattamento con contattore di membrana su varie classi di pigmenti, determinato dal metodo Harbertson, includeva una bassa concentrazione prevista di SPP (pigmenti polimerici corti) nei campioni RLO, rispetto ai campioni RHO2 e RMO2 che mostravano il più alto aumento di questi importanti composti stabili (Tabella 4). LPP (pigmenti polimerici lunghi) non erano significativamente differenti in tutti i campioni. I pigmenti polimerici (SPP e LPP) sono definiti come pigmenti resistenti allo sbiancamento del bisolfito. Sono formati dalla reazione tra antociani e tannini durante l'affinamento del vino [21], portando ad una stabilizzazione del colore nel tempo. La principale differenza tra queste due classi di pigmenti è che, a differenza dell'SPP, l'LPP tende a precipitare con le proteine ​​[22]. Con l'invecchiamento del vino rosso, di solito si osserva una maggiore formazione di LPP rispetto a SPP. Pertanto, le variazioni rilevate per SPP e non per LPP possono riflettere uno stato ossidativo precoce dei vini Aglianico dopo 11 mesi di invecchiamento. Il coinvolgimento degli antociani nativi nelle reazioni che producono nuovi pigmenti polimerici è coerente con la diminuzione degli antociani nativi totali mostrata in (Tabella 4), e con effetti simili osservati nei vini rossi durante la micro-ossigenazione [23].

Con l'invecchiamento del vino e attraverso diverse esposizioni all'ossigeno, questi pigmenti polimerici diventano di importanza cruciale per il colore del vino e piccole quantità di acetaldeide possono reagire con gli antociani per produrre nuovi pigmenti rossi stabili [19,24]. Il fatto che non siano state rilevate differenze significative in termini di intensità del colore e tonalità (Tabella 5) potrebbe essere probabilmente dovuto, come già osservato per LPP, al tempo di invecchiamento relativamente breve.

2.3. Effetto sui pigmenti del vino rosso: analisi NMR e HR ESIMS

Allo scopo di comprendere le basi molecolari dei cambiamenti osservati nei vini trattati con diversi livelli di ossigeno, i campioni di RHO2, RMO2 e RLO, sono stati sottoposti ad analisi NMR, come descritto nella Sezione 3. Un'attenta ispezione del gli spettri H-NMR ottenuti dei tre campioni non hanno portato alla luce alcuna differenza distinguibile tra i tre vini confrontati (Materiali supplementari Figura S2). Pertanto, abbiamo deciso di studiare gli stessi vini mediante HR ESIMS data la maggiore sensibilità intrinseca della tecnica rispetto alla spettroscopia NMR. I tre vini sono stati frazionati mediante HPLC/Vis utilizzando una colonna C-18. Per ogni vino sono state ottenute tre frazioni: la prima frazione è stata raccolta da 15 a 25 min (frazione 1), la seconda da 25 a 30 min (frazione 2) e, infine, una terza frazione (frazione 3) da 30 min fino alla fine della corsa cromatografica. Coerentemente con i dati riportati in letteratura [25], nella prima frazione si prevedeva la presenza di antociani non acetilati, mentre nella seconda frazione sarebbero state raccolte potenziali piranoantocianine. Le tre frazioni ottenute (1-3) per ciascuno dei tre vini analizzati (RHO,, RMO e RLO) sono state tutte sottoposte all'analisi ESIMS HR a scansione completa in modalità a ioni positivi. Nell'infrazione 1 di tutti i vini, abbiamo rilevato un picco ionico assegnato alla malvidina-3-O-glucoside (493.1332;△=-1.648; corrispondente a C23H2sO12 plus ), mentre i picchi ionici erano correlati all'altro comune le antocianine del vino, quando rilevate, presentavano errori superiori a 10 ppm e non erano considerate affidabili (Materiali supplementari Figura S3). Per quanto riguarda le frazioni 2 e 3 di RMO2 e RLO, si sono rivelate sostanzialmente sovrapponibili tra loro, mentre gli spettri di massa delle frazioni 2 e 3 della RHO, il vino ha mostrato alcune interessanti peculiarità. Più specificamente, in RHO, nella frazione 2 è stato osservato un picco ionico centrato a m/z517.1317(△{39}}.569; corrispondente a C25H25O12). Questo picco è stato attribuito alla vitesina B (materiali supplementari, figura S4)[26]. Nello spettro di massa della frazione 3 di RHO, due picchi ionici a m/z809.2294(△=0.827; corrispondente a Ca0H4O18)(Materiali supplementari Figura S5) e 1029.2871(△=-0.065 ; corrispondenti a CsH53O25)(Materiali Supplementari Figura S6), rispettivamente, erano contenuti. Questi picchi ionici erano indicativi della presenza di pigmenti polimerici. Il picco a m/z 809 è stato attribuito a dimeri a ponte con etilidene costituiti da un'unità di malvidina-3-O-glucoside e una frazione (epi)catechina[27I, e il picco a m/z1029 è stato assegnato all'etilidene- dimero a ponte costituito da due unità di malvidina-3-O-glucoside, di cui una si presentava nella sua forma flavylium e l'altra nella sua forma pseudo-base [28,29].

Vitis in B e pigmenti a ponte con etilidene (m/z 809 e 1029) sono il risultato della reazione chimica tra acetaldeide e antociani o flavan-3-oli. L'acetaldeide può agire sia come nucleofilo nella sua posizione alfa che come elettrofilo nella funzionalità carbonilica. La reazione tra l'acetaldeide nucleofila e la posizione elettrofila C4 degli antociani porta alla formazione della vitisina B, un composto abbastanza stabile classificato come piranoantocianina. Al contrario, quando l'acetaldeide agisce come un elettrofilo subendo un attacco nucleofilo da parte del C8 e, in misura minore, anche dalle posizioni C6 di flavan-3-oli o antociani, si formano dimeri a ponte di etilidene. Non sorprende che abbiamo osservato la vitesina B e i pigmenti rossi solo nel vino RHO2, poiché tali prodotti, come discusso sopra, sono formati dalla reazione dell'acetaldeide con antociani e flavan-3-oli e l'acetaldeide è una molecola principalmente derivante dal processo ossidativo che i vini subiscono nel tempo per esposizione all'ossigeno atmosferico. Quindi, in RHO sono certamente presenti quantità di acetaldeide maggiori rispetto a RMO e RLO, vini che sembrano essere stati protetti dall'ossigeno ad un

2.4. Effetto su VRF, BSA-tannini e fenoli totali

Sebbene subito dopo il trattamento con contattore a membrana, i livelli di fenoli totali fossero simili tra i vini trattati, dopo 11 mesi di affinamento in bottiglia, il numero di fenoli totali era più alto nel campione con concentrazioni più elevate di ossigeno all'imbottigliamento, come mostrato in Tabella 6. Ciò potrebbe essere probabilmente dovuto al ruolo svolto dall'ossigeno nella formazione di composti fenolici più reattivi al ferro e in una variazione della struttura molecolare delle strutture fenoliche monomeriche e polimeriche, come già mostrato nei vini sottoposti a differenti assorbimenti di ossigeno durante l'invecchiamento [6]. Ciò è confermato dalla tendenza osservata in Tabella 6 per BSA-reattivi ai tannini e flavani reattivi alla vanillina e in Tabella 4 per SPP che mostrava una differenza statistica dopo gli 11 mesi di invecchiamento.

in misura maggiore di RHO2.

Le concentrazioni di tannini reattivi alle proteine ​​BSA sono state determinate con il metodo Habertson in RHO, RMO e RLO. Durante l'invecchiamento è stato osservato un aumento del livello di tannini reattivi alla BSA in RHO2, coerente con una possibile polimerizzazione delle strutture tanniche [27] ]. Infatti, Harbertson [30] ha mostrato che la precipitazione della BSA aumenta in funzione del grado crescente di polimerizzazione (o dimensione) dai trimeri agli ottameri. Di conseguenza, ogni cambiamento nella composizione e dimensione dei tannini può influenzare la loro capacità di reagire con la BSA. L'ossidazione dei tannini provoca la formazione di legami intramolecolari e intermolecolari tra i flavonoidi. Quest'ultimo fa sì che i polimeri si allunghino e diventino più reattivi alle proteine ​​salivari [31]. Questi tipi di reazioni possono infatti modificare la struttura dei tannini e, quindi, i legami idrogeno e le interazioni idrofobiche con le proteine ​​[32].

Poiché l'astringenza è causata dall'aggregazione indotta dai tannini e dalla precipitazione delle proteine ​​salivari [33], l'aumento dei tannini BSA in RHO2 suggerisce che i cambiamenti

subiti dai tannini per mezzo di queste reazioni durante l'invecchiamento potrebbero contribuire a modificare la percezione dell'astringenza.

I flavani reattivi alla vanillina (VRF) possono invece fornire ulteriori informazioni relative alla dimensione dei tannini condensati. Infatti, la vanillina reagisce con l'anello A dei flavanoli in entrambe le posizioni 6 o 8, ma anche l'acetaldeide reagisce con le stesse posizioni dell'anello A dei flavanoli. Pertanto, una diminuzione di VRF può essere considerata come una misura indiretta della polimerizzazione ossidativa dei flavanoli legata a reazioni innescate dall'acetaldeide e che coinvolgono tannini e antociani [34].

Nel nostro studio, è stata osservata una concentrazione leggermente inferiore di VRF nel campione RMO2. La mancanza di un chiaro andamento in funzione della quantità di ossigeno potrebbe essere dovuta al fatto che queste molecole possono subire anche scissione idrolitica in presenza di ossigeno mediante nuovi riarrangiamenti molecolari con formazione di nuovi legami intra ed intermolecolari [6].

3. Materiali e metodi

3.1. Vini

Sono stati utilizzati due vini commerciali Aglianico rossi e bianchi Falanghina prodotti nel sud Italia dalla cantina Cantina del Taburno. I dettagli dei campioni insieme ad alcuni parametri di base sono mostrati nella Tabella 7. I parametri di base sono stati determinati secondo il compendio dell'OIV sui metodi internazionali di analisi del vino e del mosto (2007).

3.2. Gestione dell'ossigeno nel vino

Un impianto industriale ISIOX(Tebaldi srl) dotato di un contattore a membrana gas-liquido (Liqui-Cel9, Transverse-flow, South Lakes Dr. Charlotte, NC, USA, cut off 50 g/mol) e una pompa centrifuga in acciaio inox è stato Usato. La membrana fornisce un'interfaccia fissa e ben determinata per il trasferimento di massa gas/liquido senza disperdere una fase nell'altra. La struttura del contattore a membrana (fibra cava idrofobica) è realizzata in polipropilene (PP) e offre un'area di contatto molto ampia (gas/liquido) di 20 m²2.

Il processo di deossigenazione consiste in cicli continui in cui N, sottovuoto, o una combinazione dei primi due processi (mix) che circola su una superficie della membrana in polipropilene viene gradualmente arricchito dall'ossigeno derivante dal vino che circola sull'altro lato della membrana. La forza trainante del processo è la differenza di pressione parziale dell'ossigeno attraverso la membrana. Durante il processo, il vino circola continuamente da un serbatoio chiuso all'apparato di deossigenazione.

Per raggiungere il livello di ossigeno richiesto, il contenuto di ossigeno nel vino è stato monitorato attraverso tutti i processi fino al raggiungimento del livello target.

Il controllo di processo è stato effettuato monitorando il livello di O, nei vini, utilizzando un PC incorporato con logiche di programmazione molto semplici e sensori specifici, che monitorano la temperatura e il contenuto di ossigeno (sistema di luminescenza, Hach Lange, range di misura {{{{2} }}} a 20 mg/LO, risoluzione: 0,01 mg/L O2, precisione:0-5mg/LO2±0,1). Per controllare la pressione di ingresso e di uscita, sono stati utilizzati pressostati elettronici, così come la pressione del gas nel processo e il livello di eventuale vuoto.

Diversi trattamenti di deossigenazione sono stati applicati al vino al fine di ottenere campioni diversi a diverso contenuto di ossigeno. La quantità di ossigeno nel vino bianco era rispettivamente bianco alto O2, OMS2=2,7 mg/L, bianco medio O2, WMO2=1 mg/L, bianco basso O2, WLO2= 0. 25 mg/l.

La quantità di ossigeno nel vino rosso era rispettivamente rosso alto O, RHO,=1 mg/L, rosso medio O2, RMO2=0.5 mg/L, rosso basso O2, RLO2=0 .2 mg/L. Entrambi i gruppi di vini sono stati filtrati a 1 μm prima di essere iniettati nella macchina, allo scopo di evitare fenomeni di incrostazione e bagnatura della membrana [35].

3.3. Campioni Imbottigliamento e Affinamento

Dopo i trattamenti, i vini sono stati imbottigliati e tutte le bottiglie sono state sigillate utilizzando tappi sintetici coestrusi Nomacorc (Nomacorc SA, Thimister Clermont, Belgio)select green 100, che consentono all'ossigeno di passare attraverso il tappo in un modo controllato (0,4 mg O2 dopo 3 mesi, 0,7 mg O, dopo 6 mesi, 1,2 mg O, dopo 12 mesi e 1,1 mg O, anno dopo il primo anno di invecchiamento). Le bottiglie sono state affinate per 11 mesi a 15 gradi.

3.4. Metodi di analisi

3.4.1. Determinazione della cromatografia liquida ad alte prestazioni dell'acetaldeide

Le analisi dell'acetaldeide sono state eseguite derivatizzando il vino campione sperimentale e l'HPLC.

L'analisi di derivatizzazione è stata la seguente: 100 μL di campione di vino sono stati dispensati in una fiala, seguiti dall'aggiunta di 20 μL di soluzione appena preparata 1,120 mg/L SO, 20 μL di acido solforico al 25 percento (reagente Carlo Erba 96 percento) e 140 μL di 2 g /L2,{10}}reagente dinitrofenilidrazina. Dopo la miscelazione, la soluzione è stata lasciata reagire per 15 minuti a 65°C e poi subito raffreddata a temperatura ambiente [36].

L'HPLC utilizzato era un apparato Shimadzu LC10 ADVP (Shimadzu Italia, Milano, Italia) dotato di un controller di sistema SCL-10AVP, due pompe LC-10ADVP per creare il gradiente di solvente necessario , un rilevatore AVP SPD-M 10 e un sistema di iniezione completo Rheodyne modello 7725 (Rheodyne, Cotati, CA, USA). La separazione è stata effettuata su una colonna Waters Spherisorb (C 18, substrato di particelle di silice, ODS2 250×4,6 mm, diametro delle particelle di 5 um, dimensione dei pori di 80 A) dotata di una colonna di guardia. L'efficienza ottimale della separazione è stata ottenuta utilizzando una portata di 0,75 mL/min, una temperatura della colonna di 35 gradi; i solventi in fase mobile erano: (A) 0,5 percento di acido formico (Sigma Aldrich maggiore o uguale al 95 percento) in acqua milli-Q (Sigma Aldrich) e (B) acetonitrile (Sigma Aldrich maggiore o uguale al 99,9 percento) ; il protocollo di eluizione del gradiente era: dal 35% B al 60% B(t=8min), dal 60% B al 90% B(t=13min), dal 90% B al 95% B(t{{29 }} min,{30}}min mantenimento), dal 95% B al 35% B（t=17 min, 4-min mantenimento）, tempo di esecuzione totale,21 min, campioni iniezioni 50μL e il il rilevamento è stato eseguito monitorando i segnali di assorbanza a 365 nm.

The calibration curves were made up by injecting 5 solutions(in triplicate) containing their respective standards covering the range of linearity 10-120mg/L and were characterized by a correlation coefficient (R7)>0.976. Sono state eseguite tre repliche analitiche per ciascuna replica sperimentale.

3.4.2. Analisi cromatografiche liquide ad alte prestazioni di antociani

Le analisi degli antociani nativi sono state eseguite da un apparato HPLC Shimadzu LC10 ADVP (Shimadzu Italia, Milano, Italia) dotato di un controller di sistema SCL-10AVP, due pompe LC-10ADVP per creare il gradiente di solvente necessario, un rivelatore SPD-M 10 AVP e un sistema di iniezione completo Rheodyne modello 7725 (Rheodyne, Cotati, CA, USA). Secondo il metodo descritto nel Compendio dei metodi internazionali di analisi del vino e dei mosti dell'OIV [37].

I solventi HPLC erano i seguenti: solvente A: acqua milli-O(Sigma-Aldrich, Milano, Italia)/acido formico (Sigma-Aldrich maggiore o uguale al 95 percento)/acetonitrile (SigmaAldrich maggiore o uguale al 99,9 percento) (87:10:3)/v; solvente B: acqua/acido formico/acetonitrile(40:10:50)o/v. Il gradiente era: condizioni di tempo zero 94 percento A e 6 percento B; dopo 15 minuti, le pompe sono state regolate al 70 percento di A e al 30 percento di B, a 30 minuti al 50 percento di A e al 50 percento di B, a 35 minuti al 40 percento di A e al 60 percento di B, a 41 minuti, fine dell'analisi, per 94 percento A e 6 percento B. Prima dell'analisi successiva è stato applicato un tempo di riequilibrio di 5 minuti, come riportato da [38]. La colonna utilizzata per le analisi era un'acqua

colonna a sfera （C 18, substrato di particelle di silice, ODS2 250 × 4,6 mm, diametro delle particelle di 5 μm, 80 È stata utilizzata una dimensione dei pori） con una precolonna. Nella colonna è stata iniettata una quantità di 5{10}} μL di standard di calibrazione o vino. Sono stati rilevati i segnali di assorbanza a 520 nm. La sensibilità del rivelatore era 0,01 unità di assorbanza fondo scala (AUFS). Tutti i campioni sono stati filtrati attraverso filtri a membrana Durapore da 0,45 um (Millipore-Irlanda) in fiale di vetro e iniettati immediatamente nel sistema HPLC.

La curva di calibrazione è stata ottenuta iniettando 5 soluzioni (in triplicato) contenenti concentrazioni crescenti di malvidina-3-monoglucoside (Extrasynthese, Lione, Francia). La calibrazione è stata caratterizzata da un coefficiente di correlazione (R')=0.996. L'intervallo di linearità della curva di calibrazione era 2-200 mg/L. La precisione del metodo utilizzato è stata verificata mediante sei analisi replicate di un campione di vino rosso contenente 118,4 mg/L di antociani monomerici totali. Il coefficiente di variazione era compreso tra l'1,1% (per la malvidina 3-monoglucoside) e il 9,1% (per la malvidina 3-(6II-cumaroil)-glucoside) e ha dimostrato la buona riproducibilità dell'analisi HPLC. Le concentrazioni di antociani monomerici sono state espresse come mg/L di malvidina-3-monoglucoside.

Il frazionamento dei vini RLO2, RMO2 e RHO2 è stato eseguito secondo il metodo di analisi OIV utilizzando lo stesso HPLC Shimadzu LC10 ADVP come riportato sopra. Sono state eseguite tre repliche analitiche per ciascuna replica sperimentale.

3.4.3. Analisi di spettrometria di massa a ionizzazione elettrospray ad alta risoluzione (HR ESIMS) di vini rossi

La separazione HPLC dei vini rossi condotta come sopra descritto ha fornito tre frazioni per ciascun vino. La prima frazione è stata raccolta da 15 a 25 min (frazione 1), la seconda da 25 a 30 min (frazione 2) e la terza frazione (frazione 3) da 30 min fino alla fine della cromatografia corsa (45 min). Ciascuna frazione raccolta è stata essiccata, solubilizzata in metanolo e analizzata mediante HR-ESIMS in iniezione di flusso continuo nella modalità di ioni positivi. Gli esperimenti HR ESIMS sono stati eseguiti su un sistema quaternario Agilent 1260 Infinity IⅡ HPLC accoppiato a uno strumento ibrido a trasformata di Fourier MS (FTMS) ibrido a trappola ionica LTQOrbitrap XL dotato di una sorgente ESI ION MAX (Thermo-Fisher). Sono state utilizzate le seguenti impostazioni della sorgente (gamma di massa m/z 100-2000): tensione di spruzzatura 4,5 kV, temperatura capillare 300 gradi, tensione capillare 15 V, gas guaina 20 e gas ausiliario 21 (unità arbitrarie), tensione della lente del tubo 140 V e il 25 percento di energia di collisione. Il calcolo delle formule elementari è stato condotto utilizzando il software Xcalibur v 2.0.7 con un vincolo di tolleranza di massa di 5 ppm.

3.4.4. Esperimenti NMR

Una quantità di 2 mL di ciascun campione di vino (RHO2, RMO2 e RLO2) è stata liofilizzata e solubilizzata in 700 μL di CDOD (6H 3,31;5c49,0ppm). Gli esperimenti NMR sono stati eseguiti su uno spettrometro Varian Unity Inova 700 dotato di una sonda a freddo HCN Enhanced 13C e utilizzando tubi NMR Shigemi da 5 mm. È stata impiegata la sequenza di impulsi Varian standard H-NMR.

3.4.5 Analisi chimiche standard e misurazioni spettrofotometriche

Secondo "OIV Compendium of International Wine and Must Analysis of Wine and Musts Analysis 2007"[37], analisi chimica standard (titolo alcolico calcolato in volume, zucchero riducente, acidità totale, pH, acidità volatile, acidità malica e sostanza secca totale ) era misurato.

Le analisi spettrofotometriche sono state eseguite da uno spettrofotometro Jenway 7305. Le caratteristiche cromatiche, l'intensità del colore e la tonalità sono state determinate secondo i metodi dell'OIV [37]. L'intensità del colore è stata determinata come somma di abs 420 nm, abs 520 nm e abs 620 nm e tonalità come rapporto abs 420 nm/abs 520 nm.

I tannini reattivi alla BSA, i pigmenti polimerici corti (SPP), i pigmenti polimerici grandi (LPP) e i fenoli totali sono stati determinati da Harbertson et al. saggio [22]. Pigmenti polimerici corti (SPP) e pigmenti polimerici grandi (LPP) sono stati ottenuti combinando l'analisi del supernatante ottenuto dopo precipitazione proteica utilizzando BSA di sieroalbumina bovina

(Sigma-Aldrich) con lo sbiancamento con bisolfito di pigmenti nel vino. Il complesso BSA-tannino nel pellet è stato ridisciolto, aggiunto con cloruro ferrico e letto a 510 nm. I fenoli totali sono stati quantificati leggendo a 510 nm il campione come segue∶ 50 μL di vino sono stati aggiunti a 825 μL di tampone C e letti allo spettrofotometro come soluzione in bianco. Dopo l'aggiunta di 125 μL di cloruro ferrico, il campione è stato riletto per quantificare la quantità di fenoli ferro-reattivi.

I flavani reattivi alla vanillina (VRF) sono stati determinati secondo Gambuti et al. [39]. In breve, 750 μL di una soluzione di vanillina (4 percento in metanolo) sono stati aggiunti a 125 μL di vino diluito e, dopo 5 minuti, sono stati aggiunti 375 μL di acido cloridrico concentrato. Dopo un 15-min di incubazione della miscela a 20 gradi, l'assorbanza è stata determinata a 500 nm e letta contro una soluzione in bianco in cui è stato utilizzato metanolo puro invece della soluzione di vanillina. Le concentrazioni sono state calcolate come (più)-catechina (mg/L).

3.4.6. Analisi statistica

I dati quantitativi sono stati confrontati utilizzando la procedura delle differenze meno significative di Tukey, tutta la varianza è risultata omogenea. Quando le varianze non erano omogenee, i dati sono stati analizzati utilizzando il test di Kruskal-Wallis. Quando i risultati del test di Kruskal-Wallis sono stati significativi (p<0.05), the="" significance="" of="" between-group="" differences="" was="" determined="" by="" the="" bonferroni-dunn="" test="" (5%="" significance="" level).="" these="" analyses="" were="" performed="" using="" xlstat(version="" 2013.6.04;="" addinsoft,="" paris,="" france).="" all="" data="" are="" means="" of="" three="">

4. Conclusioni

I risultati ottenuti in questo studio hanno confermato che diversi contenuti di ossigeno nel vino in bottiglia hanno un impatto sull'invecchiamento e sull'ossidazione del vino.

La gestione dell'ossigeno nel vino Aglianico per mezzo di una membrana in polipropilene a fibra cava contractor ha determinato, dopo 11 mesi di affinamento, un minor contenuto di SO2 libera e totale nel campione con un più alto livello di ossigeno disciolto. Lo stesso comportamento è stato osservato nel vino Falanghina con un aumento in termini di acetaldeide nel campione con livelli di ossigeno più elevati.

Per quanto riguarda i composti fenolici, nei vini rossi è stata osservata una maggiore perdita di antociani autoctoni totali. Il loro contenuto era maggiore nel vino con una minore concentrazione di ossigeno. Tuttavia, la perdita di antociani autoctoni totali non ha influito sui parametri cromatici dei vini, come l'intensità del colore e la tonalità.

I tannini reattivi alla BSA e i flavani reattivi alla vanillina erano inferiori nei campioni contenenti livelli medi e bassi di ossigeno rispetto ai campioni con contenuti più elevati di ossigeno. Ciò è dovuto al fatto che l'ossigeno, partecipando alle reazioni di ossidazione, concorre alla formazione dei pigmenti polimerici. Come previsto, nei vini rossi con il più alto contenuto di ossigeno disciolto dopo il trattamento con contattore a membrana, la vitesina B, i dimeri a ponte di etilidene e l'acetaldeide erano più abbondanti rispetto ai vini trattati in modo da avere un contenuto di ossigeno inferiore nella fase di pre-imbottigliamento .

In conclusione, la deossigenazione del vino da parte delle ditte appaltatrici di membrane potrebbe essere una tecnica idonea per l'industria vinicola per prevenire tutti quei fenomeni ossidativi che potrebbero alterare la qualità finale dei vini rossi e bianchi influendo sul contenuto di anidride solforosa e acetaldeide (soprattutto nei vini bianchi). . Tuttavia, gli enologi devono considerare che la diminuzione del contenuto di ossigeno può influenzare la stabilità del colore nei vini rossi.

Materiali supplementari: I seguenti sono disponibili online. Figura S1: Ingrandimenti degli spettri H-NMR dei vini RHO, RMO2 e RLO, registrati in CD: OD. Figura S2: Struttura della malvidina 3-O-glucoside e relativo HR ESIMS nella modalità di ioni positivi. Figura S3: Struttura della vitesina B e relativi HR ESIMS nella modalità di ioni positivi. Figura S4: Struttura del dimero a ponte con etilidene costituito da un'unità di malvidina 3- O-glucoside (in basso) e un'unità di (epi)catechina (in alto) con il relativo HR ESIMS in modalità ionica positiva. Figura S5: Struttura del dimero a ponte di etilidene costituito da due unità di malvidina 3-O-glucoside, di cui quella in basso è nella sua forma flavylium e quella in alto nella sua forma pseudo base, insieme a il relativo HR ESIMS in modalità a ioni positivi.

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