Effetti protettivi della quercetina sul danno epiteliale tubulare indotto da stress ossidativo nel modello sperimentale di iperossaluria di ratto

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Astratto: Background e obiettivi: i più comunicalcoli renalisono calcoli di calcio e calcoli di ossalato di calcio (CaOx) sono il tipo più comune di calcoli di calcio. L'iperossaluria è un fattore di rischio essenziale per la formazione di questi calcoli.Quercetinaè un polifenolo con effetti fisiologici antiossidanti, antinfiammatori e molti altri. Lo scopo di questo studio era di indagare l'effetto protettivo della quercetina nella nefrolitiasi indotta da iperossaluria. Materiali e metodi: ratti maschi Wistar-Albino del peso di 250-300 g (n=24) sono stati randomizzati in tre gruppi: controllo (n=8), glicole etilenico (EG)(n{{6 }}) e EG più quercetina (n=8). Una soluzione di acqua EG all'1% è stata somministrata a tutti i ratti ad eccezione del gruppo di controllo come acqua potabile per cinque settimane. La soluzione di quercetina-acqua è stata somministrata al gruppo EG più quercetina mediante sonda gastrica alla dose di 10 mg/kg/giorno. Nei campioni di sangue e urina sono stati analizzati i livelli di malondialdeide (MDA), catalasi (CAT), urea, calcio e ossalato. Valutazioni istopatologiche e analisi immunoistochimiche perlo stress ossidativoeinfiammazioneindicatori p38 proteina chinasi attivata dal mitogeno (p38-MAPK) e fattore nucleare kappa B (NF-kB) sono stati eseguiti sui tessuti renali. Risultati: i livelli di MDA erano significativamente più bassi nel gruppo trattato con quercetina rispetto al gruppo trattato con EG (p=0.001). Sebbene i livelli di CAT fossero più alti nel gruppo trattato con quercetina rispetto al gruppo somministrato con EG, non erano significativamente diversi tra questi gruppi. L'espressione di p38 MAPK era significativamente inferiore nel gruppo trattato con quercetina rispetto al gruppo EG (p<0.004). there="" was="" no="" statistically="" significant="" difference="" between="" the="" quercetin="" and="" eg="" groups="" in="" terms="" of="" nf-kb="" expression.="" conclusions:="" we="" conclude="" that="" hyperoxaluria="" activated="" the="" signaling="" pathways,="" which="" facilitate="" the="" oxidative="" processes="" leading="" to="" oxalate="" stone="" formation="" in="" the="" kidneys.="" our="" findings="" indicated="" that="" quercetin="" reduced="" damage="" due="" to="" hyperoxaluria.="" these="" results="" imply="" that="" quercetin="" can="" be="" considered="" a="" therapeutic="" agent="" for="" decreasing="" oxalate="" stone="" formation,="" especially="" in="" patients="" with="" recurrent="" stones="" due="" to="">

Parole chiave: ossalato di calcio; iperossaluria; lo stress ossidativo; quercetina

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1. Introduzione

La formazione di calcoli urinari coinvolge diversi fattori, tra cui la concentrazione di ioni che causano la formazione di calcoli, il pH delle urine, i flussi urinari e l'anatomia del tratto urinario[l]. Circa il 75 percento dei calcoli renali sono calcoli di calcio e i calcoli di ossalato di calcio (CaOx) sono i calcoli di calcio più comunemente riscontrati [2,3]. È noto che l'iperossaluria è un fattore di rischio essenziale per la formazione di questi calcoli. Il conseguente aumento della concentrazione di ossalato urinario induce la formazione di calcoli attraverso ioni calcio e ossalato per formare cristalli di CaOx a pH fisiologico. È stato dimostrato che l'eccessiva concentrazione di ossalato danneggia le cellule dei tubuli renali attraverso i radicali liberi dell'ossigeno e aumenta la perossidazione lipidica e questo processo facilita sia la formazione di cristalli di CaOx che il loro attaccamento all'epitelio tubulare renale [4,5].

Nonostante i miglioramenti nel trattamento dei calcoli renali, sono stati riportati tassi di recidiva del 10% in un anno, del 35% in cinque anni e del 50% in dieci anni per i calcoli di ossalato di calcio [6,7]. Questi alti tassi di recidiva hanno portato i ricercatori a esplorare potenziali metodi preventivi per la recidiva dei calcoli di CaOx [6-8].

Quercetinaè un flavanolo presente in vari alimenti, tra cui noci, vino, semi e alcuni frutti e verdure [8]. Oltre alle sue potenti attività antiossidanti, scavenging radicali e antinfiammatorie, ha anche attività antibatteriche, antivirali, gastroprotettive e immunomodulanti [8-10].

Un aumento dello stress ossidativo è stato mostrato nei pazienti con calcoli renali [11]. In quanto tale, è stato riportato un minor rischio di nefrolitiasi nei pazienti con alti livelli di antiossidanti rispetto a quelli con bassi livelli di antiossidanti [12]. È stato dimostrato che le placche di Randall, che si pensa si siano formate a causa dello stress ossidativo, hanno un ruolo essenziale nella recidiva del calcolo CaOx [13]. Pertanto, l'inibizione della formazione della placca di Randall e lo stress ossidativo possono essere utili per prevenire la recidiva dei calcoli.

Questo studio ha studiato il possibile effetto protettivo della quercetina nella nefrolitiasi e nella nefrocalcinosi determinando il suo impatto sullo stress ossidativo e sull'infiammazione in un modello di iperossaluria di ratto.

2. Materiali e metodi

2.1.Animali

In questo studio sperimentale, condotto presso il laboratorio sperimentale sugli animali della Süleyman Demirel University, sono stati utilizzati ratti maschi Wistar-Albino del peso di 250-300 g (n =24). I ratti sono stati alloggiati in una stanza mantenuta a 25±1 grado con il 55% di umidità relativa. Furono dati cibo e acqua ad libitum. Lo studio è stato condotto dopo aver ottenuto l'approvazione dal Comitato di revisione etica degli esperimenti sugli animali della Süleyman Demirel University (numero di approvazione: 33/01). Tutti gli esperimenti sono stati condotti sulla base dei principi etici riportati nella Direttiva dell'Unione Europea 2010/63/UE per la sperimentazione animale.

2.2. Sostanze chimiche

Il glicole etilenico (EG) è stato acquistato da Merck Chemicals (Darmstadt, Germania), mentre la quercetina è stata acquistata da Sigma Chemicals (St. Louis, MO, USA).

2.3. Modello di nefrolitiasi indotta da iperossaluria e somministrazione di quercetina

I ratti sono stati divisi casualmente in tre gruppi; gruppi di controllo (n{{{{10}}}}), EG(n =8) ed EG più quercetina (n =8). A tutti i ratti, ad eccezione del gruppo di controllo, è stata somministrata una soluzione di acqua EG all'1% come acqua potabile per cinque settimane[14]. Una dose di 10 mg/kg/die della soluzione di quercetina-acqua è stata somministrata ai ratti nel gruppo EG più quercetina mediante sonda gastrica. Campioni di urina di ventiquattro ore sono stati raccolti dagli animali il giorno 0 prima della somministrazione di EG o quercetina e nei giorni 15 e 30. I ratti sono stati anestetizzati alla fine del periodo di cinque settimane dell'esperimento e sono stati raccolti campioni di sangue dalla cava inferiore vena. Quindi, i topi sono stati sacrificati ed entrambi i reni sono stati rapidamente asportati. I reni destro erano incorporati nel 10% di formaldeide tamponata neutra. I reni sinistri sono stati lavati con una soluzione fredda di cloruro di sodio allo 0,9% e conservati a -80 gradi fino all'omogeneizzazione.

2.4.Analisi biochimiche

L'analisi dei livelli di ossalato plasmatico è stata eseguita con la tecnica precedentemente descritta da Ladwig et al. [15]. Il livello di ossalato urinario è stato determinato dal kit enzimatico Trinity Biotech Oxalate (Pic di Trinity Biotech, St. Louis, MO, USA). La catalasi (CAT) è un enzima antiossidante [10,16]. L'attività della catalasi è stata misurata con il metodo Aebi [16]. I livelli di proteine ​​surnatanti sono stati analizzati mediante sieroalbumina bovina utilizzando il metodo Lowry come descritto nel protocollo standard[17]. Sono stati analizzati anche i livelli di malondialdeide (MDA) poiché l'MDA è considerato un biomarcatore dello stress ossidativo [9]. I livelli di malondialdeide sono stati misurati spettrofotometricamente secondo il metodo proposto da Ohkawa et al. [18]Il rilevamento delle proteine ​​è stato eseguito utilizzando il metodo descritto da Lowry et al. [17]. I livelli di creatinina nel plasma e nelle urine sono stati misurati mediante colorimetria secondo il metodo Jaffe; le concentrazioni plasmatiche di urea sono state analizzate con metodi cinetico-colorimetrici e reazioni di ureasi e glutammato deidrogenasi. Al contrario, i livelli di calcio nelle urine sono stati misurati da un autoanalizzatore tramite Schwarzenbach e il metodo del complesso o-Cresolftaleina. Sono stati raccolti campioni di sangue e urina a tempo per il calcolo della clearance della creatinina. Il volume urinario (V) è stato espresso in ml, mentre i livelli di creatinina sierica e urinaria sono stati espressi in mg/dl. La clearance della creatinina è stata calcolata secondo la formula:

Clearance della creatinina (mL/min)=U(mg/dL)× V(mL/min)/S (mg/dL)[V:Volume urinario (mL/min), U:Creatinina urinaria (mg/ dL), S: creatinina sierica (mg/dL)]

2.5. Analisi istopatologiche

I reni di destra sono stati incorporati nel 10% di formaldeide tamponata neutra (Merck-KGaA, Darmstadt, Germania). L'elaborazione del tessuto è stata avviata dopo un periodo di fissazione di 24-48 h.Renei tessuti sono stati colorati con ematossilina ed eosina (H&E) ed esaminati al microscopio ottico. Gli esami istopatologici sono stati eseguiti con ingrandimenti 10×, 20× e 40×, in particolare per valutare la congestione vascolare sia nel midollo che nei glomeruli corticali, l'intensità dell'infiltrazione di cellule mononucleate e le dimensioni e le forme del lumina tubulare.

2.6. Analisi immunoistochimiche

Il fattore di trascrizione nucleare-kB(NF-kB) e la proteina chinasi attivata dal mitogeno p38 (p38-MAPK) sono le due principali vie di segnalazione a livello proteico nella biosintesi delle citochine proinfiammatorie [19]. Inoltre, l'ossalato attiva selettivamente la via di segnalazione p38-MAPK [20]. I vetrini sono stati portati nel contenitore di incubazione dopo il blocco. L'anticorpo NF-kB/p65 (Santa Cruz, sc-109) è stato aggiunto alla prima sezione, l'anticorpo MAPK/p38 (Santa Cruz, sc-7149) alla seconda e un anticorpo secondario( Capra anti-polivalente, Thermo) è stato aggiunto alle sezioni successive per scopi di controllo e mantenuto a più 4 gradi durante la notte. L'ABCStaining Kit (Santa Cruz, sc-2018) è stato utilizzato per il resto del protocollo di colorazione. Il tessuto ricoperto di lamella con Entella è stato conservato ed asciugato per essere esaminato al microscopio ottico. Le sezioni sono state classificate come segue, a seconda dell'intensità della colorazione al microscopio ottico, come nello studio di Liu HS et al. [19]:（一）punteggio （punteggio negativo）∶ nessuna colorazione;

(più) punteggio (1 punteggio positivo): lieve;

(più più)punteggio (2 punteggi positivi): moderato;

(più più più più) punteggio (3 punteggi positivi): è presente la colorazione completa.

2.7.Statistiche

L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il software Statistical Package for Social Sciences 11.0 (SPSS 11.0). I valori sono stati indicati come medie ± deviazioni standard. La distribuzione normale delle variabili è stata verificata mediante un singolo test di Kolmogorov-Smirnov. È stata condotta un'ANOVA unidirezionale e, se risultata significativa, è stato utilizzato il test post hoc di Duncan per valutare e determinare le differenze tra i gruppi. Il valore p è stato considerato significativo quando era inferiore<>

3. Risultati

3.1. Risultati biochimici

I dati del gruppo di studio sono mostrati nella Tabella 1. Il livello medio di MDA del gruppo EG era superiore rispetto al gruppo di controllo, mentre il livello medio di MDA del gruppo quercetina era significativamente inferiore rispetto al gruppo EG(p= 0.001) . Non vi era alcuna differenza statisticamente significativa tra i gruppi in termini di attività CAT. Nel nostro studio, i livelli di MDA sono stati ridotti dalla quercetina, mentre l'attività CAT non è stata influenzata dalla quercetina. I livelli di ossalato urinario erano significativamente più alti nel gruppo EG rispetto agli altri gruppi (p<0.001). however,="" the="" urinary="" oxalate="" levels="" of="" the="" quercetin="" group="" were="" significantly="" lower="" than="" the="" eg="" group=""><0.001). these="" results="" indicated="" that="" quercetin="" reduced="" the="" urinary="" oxalate="" levels,="" which="" were="" increased="" by="" eg="" administration.="" while="" the="" plasma="" urea="" concentration="" increased="" significantly="" in="" the="" eg="" group="" compared="" to="" in="" the="" control="" group,="" a="" statistically="" significant="" decrease="" was="" observed="" in="" the="" quercetin="" group="" compared="" to="" the="" eg="" group=""><0.05). there="" was="" no="" statistically="" significant="" difference="" between="" the="" groups="" in="" terms="" of="" creatinine="" clearance="" and="" plasma="" oxalate="" levels="" (p="">0.05). Sebbene la quercetina diminuisse il livello di ossalato plasmatico, ciò non era statisticamente significativo. La concentrazione urinaria di calcio era significativamente inferiore negli altri gruppi rispetto al gruppo di controllo (p<0.05). however,="" there="" was="" no="" statistically="" significant="" difference="" between="" eg="" and="" quercetin="" groups="" in="" terms="" of="" mean="" urinary="" calcium="" concentrations.="" altogether="" these="" findings="" indicate="" that="" eg="" increased="" urinary="" oxalate="" excretion="" and="" plasma="" urea="" concentration="" and="" decreased="" urinary="" calcium="">

3.2. Risultati istopatologici

Gli esami istopatologici dei reni di ratto del gruppo di controllo al microscopio ottico hanno rivelato risultati normali (Figura 1-controllo). I risultati, inclusa la congestione nei vasi glomerulari, l'infiltrazione di cellule mononucleate e il restringimento dei lumi tubulari, specialmente nei tubuli prossimali, sono stati rilevati nel gruppo EG (Figura 1-EG). Reperti istopatologici simili sono stati osservati nel gruppo della quercetina, ma erano tutti più lievi (Figura 1-EG più quercetina). Tuttavia, non è stato utilizzato alcun sistema di punteggio per valutare se questa differenza fosse statisticamente significativa.

3.3. Risultati immunoistochimici

L'impatto della quercetina sulla proteina chinasi attivata dal mitogeno p38 (p38-MAPK) e sul fattore nucleare kappa B(NF-kB) è stato studiato mediante colorazione immunoistochimica dei tessuti renali (Figura 2). Il confronto dei gruppi in termini di p38-MAPK ha chiarito che i tessuti renali dei ratti del gruppo EG erano colorati in modo significativamente più intenso rispetto a quelli dei ratti del gruppo di controllo(p<0.001). on="" the="" other="" hand,="" p38-mapkstaining="" was="" significantly="" less="" intense="" in="" the="" quercetin="" group="" than="" in="" the="" eg="" group.="" the="" statistical="" analysis="" revealed="" that="" quercetin="" reduced="" p38-mapk="" activity="" significantly="" compared="" to="" the="" eg="" group=""><>

Un confronto tra i gruppi relativi all'immunocolorazione NF-kB ha rivelato che i tessuti renali dei ratti nel gruppo EG erano colorati in modo significativamente più intenso rispetto a quelli dei ratti nel gruppo di controllo (p<0.001). there="" was="" no="" statistically="" significant="" difference="" between="" the="" other="" groups="" in="" terms="" of="" the="" intensity="" of="" nf-kb="" staining.="" altogether,="" these="" findings="" pointed="" out="" that="" eginduced="" the="" p38-mapk="" and="" nf-kb="" activities="" in="" renal="" tissues.="" additionally,="" quercetin="" significantly="" reduced="" p38-mapk="" activity="" while="" it="" had="" no="" significant="" effect="" on="" nf-kb="" activity.="" the="" relevant="" data="" are="" displayed="" in="" table="">

4. Discussione

Nonostante i progressi nei metodi minimamente invasivi per il trattamento della nefrolitiasi, alti tassi di calcolosi residua e recidive costituiscono ancora gravi problemi per i pazienti e gli urologi [21]. Pertanto, sono necessarie strategie di trattamento medico efficaci.

Gli esatti meccanismi di formazione dei calcoli non sono stati identificati; tuttavia, è noto che circa l'80% dei calcoli renali contiene CaOx e una delle cause più comuni di calcoli di CaOx è l'iperossaluria [1,22]. L'ossalato è un sottoprodotto del normale metabolismo, eliminato dall'organismo in condizioni normali [20]. Nell'iperossaluria. l'eccesso di ossalato urinario si combina con il calcio a pH fisiologico e forma CaOxcristalli, accumulandosi nei reni. È stato dimostrato che i cristalli di CaOx danneggiano le cellule epiteliali tubulari renali e portano a calcoli renali [14,20]. Pertanto, i modelli di ratto di iperossaluria sono stati ampiamente utilizzati per imitare la formazione di calcoli renali negli esseri umani. In questi studi, l'EG è stato utilizzato come agente che induce iperossaluria, come nel nostro studio [14,20].

È stato riportato che la concentrazione di ossalato nelle urine è aumentata entro due giorni, l'iperossaluria si è sviluppata entro tre giorni, la cristalluria da CaOx si è sviluppata entro due settimane e la nefrolitiasi da CaOx è stata osservata entro {{0}} settimane quando 0.{{2} } percento EG è stato somministrato per indurre iperossaluria [14,22]. Al termine di questo processo, altri fattori urinari e la clearance della creatinina sono rimasti entro i limiti normali, mentre il pH urinario e l'escrezione di citrato sono stati significativamente ridotti [14,22]. Nel nostro studio, abbiamo indotto l'iperossaluria somministrando l'1% di EG, che successivamente ha portato a danni cellulari nelle cellule tubulari.

Nell'iperossaluria, l'accumulo dei cristalli di CaOx nel dotto collettore della papilla renale e i conseguenti depositi simili a pietre portano all'ostruzione, che apre la strada al deterioramento renale. Come risultato di questo processo, i livelli ematici di prodotti di scarto azotati, come acido urico, azoto ureico e creatinina, possono aumentare [22,23]. Nel nostro studio, la disfunzione renale è stata dimostrata da un marcato aumento dei livelli sierici di urea negli animali trattati con EG. Tuttavia, il trattamento con quercetina ha ridotto significativamente i livelli di urea sierica.

La quercetina è una molecola con potenti effetti antiossidanti e antinfiammatori [24]. Si trova nella verdura, nella frutta, nel tè e in numerosi tipi di alimenti. Oltre ad essere il forte scavenger di specie reattive dell'ossigeno (ROS), la quercetina aumenta la capacità antiossidante plasmatica totale [25,26]. È stato riportato in alcuni studi che i flavonoidi riducono lo stress ossidativo nelle cellule tubulari renali, prevengono l'accumulo di cristalli di CaOx e riducono la perossidazione lipidica indotta dall'ossalato nelle colture cellulari [27,28].

È ampiamente accettato che lo stress ossidativo svolga un ruolo significativo nella formazione di calcoli renali [12,22]. I cristalli di CaOx si accumulano nel tessuto renale portando alla sintesi di diverse macromolecole che avviano processi infiammatori e fibrogenici. Le specie reattive dell'ossigeno sono molto probabilmente coinvolte in vari eventi di segnalazione durante questo periodo [14]. In studi di colture cellulari epiteliali sia animali che renali, la formazione di radicali liberi è stata mostrata in risposta all'iperossaluria e alla formazione di cristalli di CaOx [20,22]. Poiché i lipidi sono le biomolecole più sensibili nella membrana cellulare contro i radicali liberi, la perossidazione lipidica si verifica nelle membrane cellulari [27,28]. La perossidazione lipidica è l'evento principale del danno cellulare poiché distrugge la struttura della membrana e successivamente provoca danni cellulari. L'MDA è un indicatore della perossidazione lipidica; indica anche che i ROS sono sovraprodotti [22,29]. Pertanto viene utilizzato nella valutazione della perossidazione lipidica. È noto che il danno causato dalla deposizione di CaOxcrystal e dalla formazione di ROS può essere prevenuto o ridotto da antiossidanti endogeni come la superossido dismutasi (SOD), CAT e la glutatione perossidasi (GSH-Px) [20,22,29]. Nel presente studio, è stato riscontrato che i livelli di MDA aumentano in un modello animale sperimentale di nefrolitiasi iperossalurica, che è stato creato con successo dalla somministrazione di glicole etilenico. Il nostro studio ha anche dimostrato che la quercetina riduce l'effetto di potenziamento dello stress ossidativo dell'iperossaluria, come dimostrato da parametri sia biochimici che istopatologici.

È noto che i ROS attivano molecole segnale come la protein chinasi C (PKC), c-Jun N-terminal chinasi (JNK) e p38- MAPK [21]. L'attivazione di queste molecole segnale porta all'induzione di NF-kB e fattori di trascrizione della proteina attiva-1(AP-1). Come risultato di questi eventi, l'espressione delle proteine ​​come la proteina chemioattrattiva dei monociti-1 (MCP-1), l'osteopontina (OPN), la fibronectina e il fattore di crescita trasformante-beta 1 (TGF{{11} }) aumento [20]. Queste proteine ​​facilitano l'adesione dei cristalli di CaOx e i relativi processi infiammatori [20]. Peerapen et al. ha riferito che le vie di segnalazione p38-MAPK mediavano l'interruzione delle strette connessioni tra le cellule epiteliali [30]. Hanno anche dimostrato che l'espressione delle proteine ​​coinvolte nella via di segnalazione p38-MAPK è aumentata durante la formazione di calcoli di ossalato di calcio. È stato anche dimostrato che l'ossalato ha attivato selettivamente la via di segnalazione p38-MAPK, che ha avuto un ruolo essenziale nella nefrotossicità dell'ossalato nelle cellule epiteliali renali umane [31]. Shiyong Qi et al. ha dimostrato che i cristalli di CaOx inducono il potenziamento delle molecole di adesione nelle cellule epiteliali tubulari prossimali e questo processo è stato mediato dalla via di segnalazione p38-MAPK [31]. Il nostro studio ha mostrato che l'ossalato induceva l'attivazione di p38-MAPK e NF-kB. Inoltre, abbiamo dimostrato che la quercetina riduce significativamente l'attività di p38-MAPK. Sulla base di queste informazioni, si può suggerire che la quercetina può prevenire il ripetersi di calcoli di CaOx.

Lo studio ha alcune limitazioni. Il primo è che nessun gruppo di controllo ha somministrato quercetina da sola, pertanto l'effetto della quercetina somministrata per via orale sulla produzione e sull'assorbimento intestinale di ossalato non è stato chiaramente valutato. In secondo luogo, non è stato valutato anche l'effetto della quercetina sull'assorbimento del glicole etilenico. Di conseguenza, sono necessarie ulteriori ricerche per chiarire il meccanismo d'azione della quercetina sull'iperossaluria.

5. Conclusioni

Concludiamo che la quercetina ha inibito i processi infiammatori e ossidativi innescati dall'iperossaluria nei tessuti renali. Poiché questi processi portano alla formazione di calcoli di CaOx, la quercetina può essere considerata nel trattamento medico preventivo dei calcoli di CaOx ricorrenti. Tuttavia, sono necessarie ulteriori ricerche sperimentali e cliniche per convalidare i nostri risultati.

Riferimenti

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