Parte 1: 3-Acido idrossifenilacetico: un metabolita flavonoide che riduce la pressione sanguigna

Contatto:tina.xiang@wecistanche.com

Astratto: L'assunzione regolare di alimenti ricchi di polifenoli è stata associata a un'ampia varietà di effetti benefici sulla salute, inclusa la prevenzionemalattia cardiovascolare. Tuttavia, il genitoreflavonoidi hanno per lo più una bassa biodisponibilità e, quindi, è stato ipotizzato che i loro metaboliti siano bioattivi. Uno di questi metaboliti, l'3-acido idrossifenil acetico (3- HPAA), formato dal microbiota intestinale, è stato precedentemente segnalato per esercitare effetti vasorilassanti ex vivo. Lo scopo di questo studio era di fare più luce su questo effetto in vivo e di chiarire il meccanismo d'azione. 3-L'HPAA ha dato luogo a una diminuzione dose-dipendente della pressione arteriosa quando somministrato per via endovenosa sia come bolo che per infusione a ratti spontaneamente ipertesi. Al contrario, non sono state osservate variazioni significative della frequenza cardiaca. In esperimenti ex vivo, in cui i cuori di suini provenienti da un macello sono stati utilizzati per ridurre la necessità di animali da laboratorio, 3-l'HPAA ha rilassato i segmenti dell'arteria coronaria suina precontratta attraverso un meccanismo parzialmente dipendente dall'integrità dell'endotelio. Questo rilassamento è stato significativamente compromesso dopo l'inibizione endoteliale dell'ossido nitrico sintasi. Al contrario, il blocco dei canali SKCa o IKCa, o dei recettori muscarinici, non ha influenzato il 3-rilassamento dell'HPAA. Allo stesso modo, non sono stati osservati effetti di 3-HPAA sulla ciclossigenasi né sui canali del calcio di tipo L. Pertanto, 3-HPAA diminuiscepressione sanguignain vivo attraverso il rilassamento dei vasi e questo meccanismo potrebbe essere basato sul rilascio di ossido nitrico da parte dello strato endoteliale.

Parole chiave: flavonoidi; microbiota intestinale;metabolita;3-acido idrossifenilacetico;pressione sanguigna;vasorilassamento; coronarica; arteria; ratto; maiale

1. Introduzione

Le malattie cardiovascolari sono la principale causa di morte nel mondo, con un numero stimato di decessi che si avvicina a 18 milioni all'anno. La malattia coronarica e l'ictus contribuiscono a circa l'85% di questi eventi cardiovascolari fatali [1]. Mortalità e mortalità globali hanno spinto all'implementazione di linee guida per la prevenzione dei rischi cardiovascolari [2]. La rilevazione della pressione arteriosa alta persistente con il successivo trattamento è tra le strategie principali[34]. Infatti, l'ipertensione è classificata come un importante fattore di rischio per le malattie cardiovascolari. È principalmente causato da un aumento della resistenza vascolare sistemica e questo è spesso correlato a vari cambiamenti strutturali e funzionali nel sistema vascolare, che interrompono l'omeostasi vascolare. In particolare, la tunica intima dei vasi sanguigni, formata da un unico strato di cellule endoteliali, è disfunzionale. Inoltre, le cellule muscolari lisce vascolari appaiono spesso più contratte e meno reattive ai fattori rilassanti derivati ​​dall'endotelio [5].

Diversi studi hanno fornito prove degli effetti protettivi di una dieta ricca di polifenoli contro le malattie cardiovascolari. In effetti, una dieta ricca di frutta, verdura, noci, cioccolato o tè, che sono ricche fonti diflavonoidi, è stato associato a una riduzione del rischio di malattie cardiovascolari [6]. Oltre alle proprietà antiossidanti, antinfiammatorie, antipiastriniche e antimicrobiche,flavonoidipossiedono anche significative proprietà vasodilatatrici [7,8]. Tuttavia, l'assunzione di flavonoidi nel mondo è molto variabile e, una volta ingeriti, questi composti interagiscono in modo complesso con il tratto gastrointestinale. In breve, i flavonoidi si trovano nelle piante principalmente sotto forma diglicosidi. Dopo la somministrazione sotto forma di dieta, vengono idrolizzati durante la digestione e questo permette il rilascio della forma aglicone nell'intestino tenue. Gli agliconi, a loro volta, possono subire un metabolismo nell'epitelio dell'intestino tenue e successivamente nel fegato. Ciò si traduce in una biodisponibilità molto scarsa dei flavonoidi genitori, che è stata ripetutamente confermata [9,10]. Tuttavia, la frazione non assorbita passa dall'intestino tenue nell'intestino distale, dove viene scissa dal microbiota del colon portando alla produzione di piccoli composti fenolici, inclusi acidi fenilpropionico, fenilacetico, benzoico e idrossibenzeni, che vengono successivamente assorbiti [ 9]. È interessante notare che negli ultimi decenni è diventato chiaro che gli effetti protettivi dei flavonoidi alimentari sono attribuiti ai loro metaboliti piuttosto che alle loro forme madri [10-12]. Ciononostante, Booth e colleghi hanno documentato anche nei primi anni '50 la presenza di vari metaboliti flavonoidi, vale a dire 3,4-diidrossifenilacetico (DHPA), 3-idrossifenil acetico (3-HPAA) e omovanillico nelle urine di diverse specie animali dopo ingestione orale diquercetina[13]; molto più recente è la ricerca sull'effetto biologico dei piccoli metaboliti fenolici dei flavonoidi. In particolare, negli ultimi anni, la ricerca sul destino metabolico dei flavonoidi e gli studi che riportano le bioattività dei loro metaboliti derivati ​​​​da microbi sono diventati un argomento caldo e intensamente studiato nel campo. Il nostro gruppo di ricerca ha dimostrato che diversi metaboliti microbici, tra cui DHPA,4-metil catecolo e acido 3-(3-idrossifenil) propionico, rilassare l'aorta di ratto è probabilmente concentrazioni fisiologicamente ottenibili [14,15 ]. Per quanto ne sappiamo, 3-HPAA è uno dei metaboliti meno esplorati. È stato documentato che è un metabolita di numerosi composti fenolici comprese diverse classi di flavonoidi come flavonoli (quercetina con il suo glicoside rutina, kaempferolo), isoflavoni e flavanoli (sia procianidine oligomeriche che le loro unità monomeriche, catechina ed epicatechina) (Figura 1) [16-20].

Poiché 3-l'HPAA rilassa le cellule muscolari lisce ex vivo [14], questo studio mirava a verificare se questo metabolita è in grado di causare una diminuzione della pressione arteriosa in vivo e a rilevarne il meccanismo d'azione in una serie di esperimenti meccanicistici .

2. Materiali e metodi

2.1. Animali

Gli esperimenti in vivo sono stati condotti su ratti spontaneamente ipertesi (SHR) ottenuti dall'Accademia delle scienze ceca, Praga, Repubblica Ceca. Gli animali sono stati allevati nella struttura zootecnica della Facoltà di Farmacia e mantenuti ad una temperatura costante di 23-25 gradi con un ciclo buio/luce di 12 h. Ai ratti è stata fornita una dieta standard e acqua del rubinetto ad libitum. Lo studio (reg. n.4937 2019-9) è stato approvato dal Ministero dell'Istruzione, della Gioventù e dello Sport, in conformità alla Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio pubblicata dal National Institutes of Health degli Stati Uniti (8a edizione, rivista 2011, ISBN-13:978-0-309-15400-0).

2.2.Prodotti chimici

Pentobarbital, nitroprussiato di sodio, dimetilsolfossido (DMSO), L-Nw-nitro arginina metil estere (L-NAME), atropina, TRAM-34/1-[(2-clorofenil)difenilmetile] -1H-pirazolo, indometacina, nifedipina, bradichinina, KCl, CaCl e UCL-1684/6,12,19, 20,25,26-esaidro-5,27 :13,18:21,24-trietheno-11,7-metheno-7H-dibenzo[b,m][1,5,12,16]tetraazaciclotricosina{{ 29}},{30}}di trifluoroacetato idrato sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (Steinheim, Germania). Bay K8644 è stato ottenuto da Axon Medchem BV(Groningen, Paesi Bassi). Il metabolita testato 3-HPAA è stato acquistato da Toronto Research Chemicals (Toronto, ON, Canada). NaCl, NaHCO3 e D-glucosio sono stati forniti da PENTA sro (Praga, Repubblica Ceca). MgSO4.7H2O è stato acquistato da Erba Lachema sro (Brno, Repubblica Ceca) e KH2PO4 dal Dr. Kulich Pharma sro (Hradec Kralové, Repubblica Ceca). Repubblica). Saline è stata acquistata da Baxter Czech spol. sro(Praga, Repubblica Ceca) ed eparina di Zentiva (Praga, Repubblica Ceca).

Nitroprussiato di sodio, L-NAME e atropina sono stati sciolti in acqua distillata. Le soluzioni madre di TRAM-34（1 mM） e UCL-1684（100 μM） sono state preparate come soluzioni acquose integrate rispettivamente con il 20% e il 10% di DMSO. È stata anche preparata una soluzione madre di indometacina (1 mM) in DMSO al 10 percento/acqua e Bay K8644 (10 mM) e nifedipina (10 mM) sono state sciolte in DMSO puro. La concentrazione finale di DMSO nella camera dei tessuti era sempre<0.2%.the krebs="" solution="" contains="" the="" following="" (mm):="" nacl119,="" kcl4.7,="" cacl2="" 1.25,kh2po41.18,="" mgso4.7h2o1.17,="" nahco325,="" and="" d-glucose="">

2.3. Esperimenti in vivo

Dodici ratti SHR (peso medio 356 ± 21 g, pressione sanguigna in anestesia 211 ± 64/152 ± 45 mmHg, frequenza cardiaca 381 ± 37 bpm) sono stati anestetizzati ip con pentobarbital (50 mg. kg-). Il trasduttore di pressione MLTO380/D è stato collegato all'arteria carotide comune sinistra e la pressione arteriosa con la frequenza cardiaca è stata registrata utilizzando un dispositivo Power Lab collegato al software LabChart 7 (ADInstruments, Sydney, Australia). La vena safena sinistra è stata incannulata per la somministrazione di un bolo o di un'infusione. Dopo l'intervento chirurgico, ogni ratto è stato lasciato stabilizzare per 15 minuti prima dell'esperimento. 3-L'HPAA è stato sciolto in soluzione fisiologica e somministrato secondo due protocolli:(1) come dose singola in bolo compresa tra 0.001 e 10 mg kg{{18 }}(il volume applicato era sempre 0,1 ml, n=8); o (2) come quattro successive infusioni della durata di 5 minuti alle dosi di 0,05, 0,25,1 e 5 mg.kg-1.min-1 （n=4） alla velocità di infusione di 50μL al minuto utilizzando la pompa a siringa Kent "Genie" (Kent Scientific Corporation, Torrington, CT, USA) (Figura 2a). In entrambi i protocolli, la dose successiva veniva sempre somministrata dopo che la pressione sanguigna era rimasta stabile per almeno 5 minuti. Come controllo, ogni animale è stato trattato con soluzione fisiologica nelle stesse condizioni prima che fosse effettuata la prima somministrazione di 3-HPAA. Dopo la misurazione, ogni ratto è stato sacrificato da iv KCl(1 mL, 1 mol·L-). La temperatura corporea durante l'esperimento è stata mantenuta a 36,5 ± 0,5 gradi utilizzando una piastra riscaldante.

2.4 Esperimenti ex vivo

2.4.1.Preparazione dei tessuti

Gli esperimenti ex vivo sono stati eseguiti su segmenti dell'anello arterioso coronarico suino (Figura 2b). I cuori di suino (n= 11) sono stati ottenuti da un macello locale. I maiali erano animali sani di entrambi i sessi, da allevamento standard e sotto controllo veterinario, destinati al consumo. I cuori sono stati elaborati per l'esperimento circa 4 ore dopo la macellazione dell'animale. I cuori sono stati immersi nella soluzione di Krebs e l'arteria coronaria circonflessa sinistra è stata immediatamente asportata, nuovamente immersa nella soluzione di Krebs e pulita da grasso aderente, tessuto connettivo e sangue. Successivamente, l'arteria coronaria purificata è stata tagliata in anelli cilindrici di circa 3 mm di lunghezza. Per alcuni esperimenti meccanicistici, lo strato endoteliale è stato interrotto meccanicamente strofinando delicatamente la superficie luminale con una pinza. Gli anelli sono stati mantenuti in bagni di tessuto riempiti con la soluzione di Krebs in condizioni ossigenate (95% O e 5% CO2) a 37 gradi. Ciascun anello dell'arteria è stato appeso tra due ganci in filo di acciaio inossidabile, uno dei quali fissato a un supporto e il secondo collegato a un trasduttore e un computer dotato di SPEL Advanced Kymograph Software, v3.2(Experimetria Ltd., Budapest, Ungheria). Questa disposizione consente la misurazione della tensione isometrica. Le preparazioni sono state equilibrate a una tensione di 2 g per 40 minuti, durante i quali la soluzione di Krebs è stata sostituita ogni 10 minuti. Successivamente, la tensione è stata impostata a 1 g (baseline), ogni bagno di tessuto è stato riempito con 5 ml della soluzione di Krebs e è stato eseguito il seguente test di vitalità: gli anelli coronarici sono stati contratti con KCl (la concentrazione finale all'interno del bagno era di 40 mM) e quando è stato raggiunto il plateau è stata aggiunta bradichinina (300 nM) per confermare l'endotelio intatto o gli anelli nudi. Quindi, gli anelli coronarici sono stati lavati più volte con la soluzione di Krebs.

2.4.2. Conferma dell'attività vasodilatatoria di 3-HPAA sull'arteria coronaria suina

L'attività vasorilassante è stata misurata su anelli arteriosi precontratti con KCl (40 mM) (Figura 2b). Una volta raggiunto il plateau,3-l'HPAA è stato aggiunto cumulativamente al bagno in concentrazioni comprese tra 100 μM e 1 mM.3-L'HPAA è stato preparato nella soluzione di Krebs. La soluzione di Krebs senza il composto testato è stata aggiunta ad alcuni anelli coronarici come controllo utilizzando la stessa procedura. Ciascuna dose è stata applicata dopo la stabilizzazione della risposta rilassante causata dalla dose precedente e il nitroprussiato di sodio (100 μM) è stato utilizzato per indurre il massimo rilassamento in tutti gli esperimenti al termine della procedura.

2.4.3. Esperimenti meccanicistici

Nei seguenti esperimenti, il meccanismo dell'azione vasodilatatrice dell'{0}}HPAA è stato studiato su anelli coronarici dell'endotelio intatti utilizzando l'inibitore della sintasi dell'ossido nitrico (NO), L-NAME（100 μM）; un antagonista del recettore muscarinico, l'atropina （50 μM）; un inibitore della ciclossigenasi （COX）, indometacina （10 μM）; o gli inibitori dei canali Kt attivati ​​con Ca2 più a conduttanza intermedia e piccola, rispettivamente TRAM-34（10 μM） e UCL-1684 （1 μM） (Figura 2b). Atropina o inibitori venivano sempre aggiunti 30 minuti prima dell'aggiunta di KCl (40 mM). Successivamente, in un esperimento separato, è stato studiato il coinvolgimento dei canali vascolari Cay1.2 Ca2 plus (tipo L) su 3- vasorilassamento indotto da HPAA pretrattando anelli coronarici privi di endotelio con KCl 15 mM seguito da incubazione con 3-HPAA a una concentrazione di 1 mM per 30 min. Quindi, un attivatore del canale del calcio di tipo L, Bay K8644, è stato applicato cumulativamente (100 pM-10μM) al buio, per indurre una risposta contrattile. KCl(80 mM) è stato utilizzato per indurre la massima contrazione. Come controlli negativi sono stati utilizzati anelli incubati con il volume corrispondente del veicolo (la soluzione di Krebs). Inoltre, gli anelli incubati con il noto inibitore del canale del calcio di tipo L nifedipina (150 nM) sono stati usati come controlli positivi. Le proteine ​​bersaglio studiate e i ligandi utilizzati negli esperimenti meccanicistici sono riassunti nella Tabella 1.

2.5. Analisi dei dati

GraphPad Prism 7.03 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) è stato utilizzato per l'analisi dei dati. Per gli esperimenti in vivo, le differenze tra le dosi individuali in bolo di 3-HPAA e il controllo (soluzione salina) sono state confrontate utilizzando un'ANOVA unidirezionale, seguita dal test post hoc di Dunnett. Per le infusioni è stata utilizzata un'ANOVA a due vie seguita dal test post hoc di Dunnett. Per gli esperimenti meccanicistici ex vivo, i risultati sono stati confrontati utilizzando un test t spaiato. Per gli esperimenti con Bay K8644, è stata utilizzata l'ANOVA a due vie seguita da un test di Dunnett per confronti multipli. I dati sono mostrati come media ± SEM.

3. Risultati

3.1.Effetto di 3-HPAA sulla pressione sanguigna e sulla frequenza cardiaca in vivo in SHR

3.1.1. Somministrazione in bolo singolo

È stata osservata una significativa diminuzione della pressione arteriosa media, sistolica e diastolica dopo la somministrazione in bolo di {{0}} HPAA a dosi comprese tra 0.01 e 10 mg.kg-' (Figure 3 e S1). La diminuzione della pressione arteriosa sistolica era evidente da una dose di 0,1 mg. kg-I (Figura 3a), mentre la pressione sanguigna diastolica è diminuita in modo significativo anche da una dose 10 volte inferiore (0,01 mg. kg-') (Figura 3b). Nello stesso esperimento, non è stato riscontrato alcun effetto sulla frequenza cardiaca in nessuno dei 3-Dosi di HPAA (figura S2).

3.1.2. Somministrazione per infusione

Le infusioni della durata di 5 minuti di 3-HPAA hanno comportato una diminuzione della pressione sanguigna media, sistolica e diastolica (risultati completi nella Figura S3). L'effetto era dose-dipendente, raggiungendo al massimo ca. 50 percento . Cambiamenti significativi sono stati prodotti dalle due dosi più alte, 1 e 5 mg·kg-1.min-I (Figura 4). Inoltre, in questo caso, non sono state riscontrate variazioni significative della frequenza cardiaca (Figura S4).

3.2. Conferma delle proprietà vasodilatatorie di 3-HPAA sull'arteria coronaria suina

In esperimenti ex vivo, 3-HPAA ha indotto la vasodilatazione dell'arteria coronaria di maiale in modo dose-dipendente (Figura 5). Fatta eccezione per la prima dose, è stata osservata vasodilatazione. I risultati sono stati, tuttavia, significativi solo per la concentrazione più alta (1 mM). La stessa concentrazione è stata utilizzata per ulteriori test meccanicistici ex vivo.

3.3. Meccanismo degli effetti vascolari di 3-HPAA studiato ex vivo sull'arteria coronaria suina

Per studiare i meccanismi alla base della 3-vasodilatazione indotta da HPAA, abbiamo confrontato i suoi effetti sugli anelli arteriosi coronarici suini intatti e privi di endotelio precontratti con KCl. La rimozione dell'endotelio ha ridotto l'effetto vasodilatatore (Figura 6b). In seguito a questo risultato, è stato testato il coinvolgimento dell'NO endoteliale. Anche il pretrattamento con un inibitore di eNOS, L-NAME (100 uM), ha comportato una diminuzione significativa della 3- vasodilatazione indotta da HPAA (Figura 6c). Al contrario, analogo pretrattamento degli anelli coronarici con atropina antagonista del recettore muscarinico (50 μM) o con bloccanti dei canali IKCa o SKCa, TRAM-34（10 μM） e UCL-1684（1 μM）, rispettivamente, o con l'inibitore della COX, l'indometacina (10 μM) non ha causato alcun cambiamento nella vasodilatazione prodotta da 3- HPAA (Figura 6d-g). Infine, abbiamo deciso di indagare se 3-HPAA può agire attraverso l'inibizione dei canali del calcio Cay1.2 (tipo L) sulle cellule muscolari lisce vascolari. Il pretrattamento degli anelli con 3-HIPAA(1 mM) non ha avuto effetti significativi sulla contrazione indotta da dosi cumulative di Bay K8644（100 pM-10 μM）（Figura 7）, mentre l'incubazione con il noto inibitore del canale del calcio Cav1.2 (tipo L) nifedipina (150 nM) ha ridotto significativamente le contrazioni (controllo positivo).

Fare clic sul collegamento per ulteriori informazioni sulla parte 2
https://www.xjcistanche.com/news/part2-3-idrossifenilacetico-acido-sangue-pre-54725696.html