Estratti di fiori come coloranti multifunzionali nell'industria cosmetica Parte 2

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Molti prodotti naturali sono utilizzati nei sistemi medici tradizionali per trattare il sollievo dei sintomi da dolore e infiammazione, [61] pertanto è stato studiato l'effetto degli estratti analizzati sull'inibizione dell'attività della lipossigenasi e della proteinasi. Nell'intervallo di concentrazioni analizzate (100-500 ug/mL), l'estratto di acqua CTE ha mostrato la più forte capacità di inibire la proteinasi (Figura 4) (al 57% per una concentrazione di 500 ug/mL). Questa attività è stata confrontata con il noto inibitore della proteinasi diclofenac, usato come controllo (inibizione di circa l'89% alla massima concentrazione testata). Tuttavia, risultati simili sono stati ottenuti per l'estratto di GGE e KTE (circa il 56% e il 53%, rispettivamente, per le concentrazioni più elevate). È stata osservata una minore inibizione della proteinasi per gli estratti PRE e PGE. In un ulteriore test che misura la capacità di inibire la lipossigenasi, gli estratti acquosi di KTE e CTE mostrano i valori più alti (circa 67% e 64% di inibizione, rispettivamente, per una concentrazione di 500 ug/mL). Diclofenac è ​​stato anche usato come controllo Anche gli estratti GGE, PGE e PRE presentano valori significativamente elevati (rispettivamente 60 percento, 57 percento e 54 percento). È stato inoltre notato che la capacità di inibire gli enzimi LOX e proteinasi dipende dalla concentrazione dell'estratto (Figura 5).

Precedenti studi hanno indicato che molti composti polifenolici hanno contribuito in modo significativo alle attività antinfiammatorie di molti estratti vegetali[62]. Gli studi hanno dimostrato il coinvolgimento dei ROS nel processo infiammatorio e composti fenolici come l'acido gallico e chinico possono bloccare il metabolismo dell'acido arachidonico inibendo l'attività della lipossigenasi, oppure possono fungere da scavenging dei radicali liberi reattivi, che sono prodotti durante l'acido arachidonico [63]. I risultati ottenuti da BenSaad et al. indicano che l'acido ellagico, l'acido gallico e la punicalagina A&B isolati da P. granatum hanno inibito la produzione di ossido nitrico (NO), prostaglandina E2 (PGE2) e interleuchina 6 (IL-6) in lipopolisaccaride (LPS)-indotta RAW 267.4 macrofagi. Se questi composti funzionino come agenti unici o abbiano un effetto sinergico rimane ancora una domanda [64]. Poiché molti flavonoidi mostrano proprietà antinfiammatorie, a causa del loro comportamento antiossidante intrinseco, sono stati implicati in vari disturbi infiammatori.metodo di estrazione dei flavonoidi pdf,In particolare, la quercetina è la molecola più interessante perché interferisce con specifiche vie biologiche. Inoltre, gli studi suggeriscono che può ridurre il processo infiammatorio coinvolto in diversi modelli attraverso diversi meccanismi[65]. In particolare, la protein chinasi attivata da AMP e la via dell'istone/proteina deacetilasi (AMPK/SIRT1) risultano in una gestione dell'infiammazione più interessante. Pertanto, gli attivatori di AMPK possono ridurre l'infiammazione dei macrofagi. La quercetina e altri flavonoidi, come attivatori di AMPK e SIRT1, possono ridurre l'infiammazione interferendo con questa via [66]. È stato anche dimostrato che la quercetina ei monoglucosidi della quercetina esercitano un maggiore potenziale di inibizione della LOX [67]Nair et al. hanno mostrato proprietà antinfiammatorie dell'estratto di KTE valutando la presenza di flavonoli con la parte quercetina come manghaslin Qu 3-[2G] rhamnosylrutinoside, Qu 3- O-dirhamnoside e rutina. Queste molecole hanno mostrato una forte inibizione dell'attività della COX-2 e una parziale soppressione dei ROS. In generale, i polifenoli presenti nel CTE hanno mostrato proprietà antinfiammatorie nell'infiammazione indotta da LPS nelle cellule macrofagiche RAW 264.7[68].

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2.5.Valutazione della citotossicità

Nella creazione di nuove materie prime cosmetiche, una delle proprietà più importanti è la loro sicurezza d'uso. Le sostanze dedicate all'uso in cosmesi devono essere atossiche, soprattutto in relazione alle cellule della pelle, come cheratinociti e fibroblasti. Sono stati utilizzati due tipi di test per determinare la tossicità degli estratti analizzati sulle cellule HaCaT e BJ.flavonoidiIl primo studio, utilizzando il saggio di assorbimento del rosso neutro, consente di valutare la vitalità delle cellule trattate con gli estratti analizzati. Questo colorante entra nei lisosomi di una cellula vivente e viene rilasciato nel citoplasma delle cellule morte. È stato osservato (Figura 6) che l'estratto CTE ha la più alta capacità di aumentare la proliferazione di entrambe le cellule HaCaT e BJ. Rispetto al controllo, questo estratto ha raggiunto valori di circa il 20% e il 40% superiori rispetto al parametro testato alla concentrazione di 250 μL/mL (HaCaT e B)) e 500 μL/mL (cellule BJ), rispettivamente. L'estratto GGE a concentrazioni di 100 e 250 μL/mL e l'estratto KTE alla concentrazione di 500 μL/mL sono stati caratterizzati da un piccolo effetto tossico sulle cellule BJ. Altri estratti hanno avuto un'influenza positiva sulla vitalità di queste cellule. Gli estratti PRE e PGE a una concentrazione di 100 μL/mL non differivano significativamente dal controllo e aumentavano la proliferazione delle cellule BJ di circa il 10-15 percento rispetto al controllo alla concentrazione di 250 e 500 μL/ ml. Nel caso dei cheratinociti non è stata osservata alcuna diminuzione della vitalità cellulare. Per gli estratti PGE, PRE e CTE, è stato notato un aumento della proliferazione all'aumentare della concentrazione, mentre è stata dimostrata una diminuzione della vitalità cellulare con l'aumento della concentrazione degli estratti KTE e GGE.

Il secondo test effettuato per determinare la citotossicità degli estratti testati è stato il test resazurina (Alamar Blue). È stato dimostrato (Figura 7) che la vitalità delle cellule dipende dalla concentrazione dell'estratto con cui le cellule sono state incubate. Nel caso dei fibroblasti, gli estratti PRE, PGE e CTE determinano una maggiore proliferazione cellulare con aumento della loro concentrazione. Alla concentrazione più alta analizzata （500 μL/mL）, è stata osservata una proliferazione superiore di circa il 20% rispetto al controllo.utilizza l'esperidinaNel caso degli estratti KTE e GGE, è stata osservata una diminuzione della vitalità cellulare con un aumento della concentrazione degli estratti. Questi estratti hanno mostrato un piccolo effetto tossico su BJ a concentrazioni di 250 e 500 μL/mL. Nel caso dei cheratinociti è stato osservato un effetto simile degli estratti analizzati sulle cellule della pelle, ma la loro capacità di proliferare non è stata così forte come nel caso dei fibroblasti. La più alta capacità di aumentare la proliferazione dei cheratinociti è stata osservata per l'estratto CTE nell'intero intervallo di concentrazioni analizzate. Valori simili sono stati ottenuti per l'estratto PRE ad una concentrazione di 250 μL/mL e per l'estratto PGE ad una concentrazione di 500 μL/mL. L'estratto KTE ha mostrato un effetto tossico significativamente maggiore sulle cellule HaCa rispetto all'estratto GGE.

Gli estratti analizzati non sono stati ampiamente testati per la loro tossicità per le cellule della pelle prima. Esistono solo pochi studi di citotossicità sugli estratti o sui loro principali principi attivi, in particolare nei confronti delle cellule tumorali. Gli autori di studi precedenti hanno indicato che questi estratti generalmente non hanno un effetto tossico sulle cellule della pelle e la loro capacità di aumentare la proliferazione cellulare è spesso attribuita all'alto contenuto di polifenoli, antociani e flavonoidi [45,69-73 ]. Alcuni autori hanno anche indicato che i singoli componenti contenuti negli estratti possono esibire un effetto tossico sulle cellule della pelle, mentre l'estratto nel suo insieme no. Ali Hijazi et al. [69] hanno mostrato che gli alcaloidi estratti dalla Punica granatum sono tossici per le linee cellulari normali e cancerose, mentre l'intero estratto è meno tossico. Lo studio di Nasiri et al. [70] indica che l'estratto di fiori di Punica granatum può essere utile per accelerare il processo di guarigione delle ferite grazie alla sua capacità di aumentare la proliferazione delle cellule della pelle. In una nostra precedente ricerca [45], è stato dimostrato che gli estratti idro-etanolici ottenuti dalle piante analizzate erano caratterizzati da una maggiore capacità di aumentare la proliferazione delle cellule BJ, e gli estratti KTE e GGE hanno mostrato un minore effetto tossico su queste cellule .perduta impero cistancheL'effetto degli estratti acqua-etanolo sulle cellule HaCaT era simile a quello degli estratti acquosi puri, ma nel caso degli estratti ottenuti con etanolo sono state osservate proprietà di proliferazione leggermente più favorevoli rispetto al caso degli estratti acquosi. Le differenze tra la composizione di entrambi i tipi di estratti analizzati possono causare differenze nella loro tossicità. Come mostrato, gli estratti di acqua non sono così ricchi di ingredienti bioattivi come gli estratti di acqua-etanolo. Le maggiori differenze si osservano nel contenuto di rutina e isoquercitrina.

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2.6.Determinazione del fattore di protezione solare

Gli effetti sfavorevoli delle radiazioni UV sulla pelle possono essere rivelati sia poco dopo l'esposizione che anche anni dopo. La radiazione solare ha un effetto immunosoppressivo che accelera il processo di invecchiamento della pelle con tutte le conseguenze ad esso associate, compreso l'aumento della cancerogenesi[74]. Le tendenze attualmente osservate indicano una crescente necessità di sviluppare prodotti caratterizzati non solo da un livello molto elevato di sicurezza nell'uso ma anche da multifunzionalità, nel senso che i prodotti saranno caratterizzati dalla protezione anti-radiazioni della pelle con un raggio d'azione più ampio rispetto a quello utilizzato finora. Alcune sostanze vegetali svolgono un ruolo inestimabile in questo aspetto, che è in grado non solo di fornire protezione solare ma anche di neutralizzare gli effetti negativi già esistenti delle radiazioni solari sulla pelle [75-77]. La ricerca condotta ha mostrato che gli estratti vegetali analizzati PRE, PGE, KTE, CTE e GGE sono caratterizzati da elevati coefficienti SPF.

L'analisi dei coefficienti (SPF) è stata effettuata per gli estratti d'acqua ottenuti dalle piante sopra citate a concentrazioni di 10 e 50 mg/mL. Per ciascuna pianta studiata una maggiore concentrazione dell'estratto ha comportato un valore significativamente più alto di SPF.frazione flavonoide purificata micronizzata 1000 mg utilizzaIl confronto tra estratti mostra che i valori più alti dell'SPF sono stati osservati per l'estratto KTE, che vale per entrambe le concentrazioni studiate. Un'altra osservazione interessante è che anche nelle concentrazioni più basse studiate l'estratto di KTE mostrava ancora un SPF elevato, mentre i valori per altri estratti diminuivano notevolmente. Questo è chiaro quando analizziamo quanto il risultato per KTE fosse superiore rispetto ad altri estratti. Per la concentrazione di 50 mg/mL, l'SPF era maggiore del fattore 1,2 (rispetto a PGE, CTE) al fattore di quasi 1,9 (rispetto a PRE, GE). Lo stesso calcolo per la concentrazione di 10 mg/mL darà fattori da 1,4 (rispetto a PGE) a fattori dell'intervallo 2-3 (rispetto a CTE, GGE), anche fino a fattori come 10 rispetto a PRE. Quando ci si concentra sull'estratto KTE, si può notare che una concentrazione decrescente dell'estratto di un fattore 5 (da un valore di 50 mg/mL al valore di 10 mL/mL) comporta una diminuzione del valore SPF di un fattore 3,4 , il che significa che l'SPF diminuisce più lentamente della concentrazione. Quanto sopra mostra che l'estratto di KTE può essere efficiente anche se applicato a basse concentrazioni (Figura 8).

2.7. Misurazioni della perdita d'acqua transepidermica (TEWL) e dell'idratazione cutanea

A causa dell'ampia gamma di attività biologica e farmacologica delle materie prime vegetali, le sostanze vegetali contenute negli estratti hanno un impatto significativo sulla condizione della pelle. In particolare, stiamo parlando dell'influenza dei metaboliti secondari sulla condizione della nostra pelle [78,79].

Nella fase successiva della ricerca sono state effettuate le analisi di idratazione e TEWL. È stato valutato l'effetto degli estratti testati sulla pelle. Le misurazioni sono state effettuate a intervalli di due volte di 60 e 360 ​​minuti per la concentrazione di estratto di 10 mg/mL. Per la misurazione TEWL, la diminuzione percentuale maggiore è stata mostrata per l'estratto PGE, dove il valore di controllo di 13,9 è sceso a 8,71, determinando una diminuzione percentuale del 37 percento. Vale anche la pena analizzare l'estratto KTE da quella prospettiva, poiché questo era quello che mostrava i valori SPF più alti. Per l'estratto KTE, il valore di controllo TEWL è sceso al valore di 10,22, il che significa una diminuzione del 26 percento (Figura 9A).

Tuttavia, nel caso della seconda misura strumentale, è stato dimostrato che gli estratti analizzati provocano un aumento dell'idratazione rispetto al campione di controllo, sia dopo 60 che dopo 360 min.

Come risultato delle analisi, è stato riscontrato che gli estratti analizzati di PRE, PGE, KTE, CTE e GGE aumentano l'idratazione della pelle (Figura 9B). È stato osservato un aumento delle proprietà idratanti insieme ad un aumento della concentrazione dell'estratto nei preparati. Le proprietà idratanti più forti sono state osservate per gli estratti PRE e PGE pari al 32 percento e al 29 percento dopo 60 minuti e pari al 21 percento e 22 percento dopo 360 minuti. Il livello più basso di idratazione della pelle, tuttavia, è stato riscontrato per l'estratto di KTE pari al 18 percento dopo 60 minuti e vicino al 3 percento dopo 360 minuti.

2.8. Analisi dell'applicazione

2.8.1. Determinazione dei parametri di colore degli estratti

Grazie al loro colore naturale, i principi attivi dei fiori delle piante possono essere utilizzati come coloranti naturali in molti prodotti commerciali, come cosmetici e alimenti. L'analisi del colore è stata eseguita per gli estratti ottenuti (Tabella 5).

È stato riscontrato che gli estratti PRE, KTE e CTE hanno il più alto potenziale come pigmenti cosmetici naturali. Tuttavia, i valori di crominanza più elevati (C*) sono stati osservati per CTE. Sulla base del valore del parametro del grado h, si è riscontrato che è il colore giallo di questo estratto che si osserva e si vede ad occhio nudo. Nel caso degli estratti KTE e PRE, nonostante il basso valore di C* (2,8), il colore di questi estratti è chiaramente visibile ad occhio nudo ed è stato specificato come rosso-viola per PRE e blu-viola per l'estratto KTE. Gli estratti acquosi di PGE e GGE erano rossastri e di colore leggermente arancione, e i valori di crominanza ottenuti erano al livello di 1,3. Per questo colore, questi valori non erano significativamente distinguibili ad occhio nudo.

2.8.2. Determinazione dei parametri di colore dei cosmetici in base agli estratti

Negli ultimi anni c'è stata una forte necessità di sviluppare nuovi coloranti di origine naturale, soprattutto nell'industria alimentare e cosmetica. Rispetto ai coloranti ottenuti sinteticamente, possono avere un minore impatto negativo sulla salute umana e sull'ambiente [80]. Gli estratti ottenuti sono stati utilizzati nella formulazione di un liquido struccante micellare modello. In ciascuna formulazione, sono stati utilizzati in una concentrazione dell'1 percento. I risultati dei parametri di colore dei cosmetici modello sono presentati nella Tabella 6.

È stato osservato che l'aggiunta dell'1% di estratti di acqua da PRE, PGE, CTE e GGE ha influenzato significativamente il colore dello struccante. Ogni campione era chiaramente visibile ad occhio nudo a colori. L'estratto PRE ha cambiato il colore del cosmetico in arancione e l'estratto PGE, CTE e GGE lo ha cambiato in giallo.

La possibilità di utilizzare gli estratti analizzati come potenziali coloranti è confermata dai valori relativamente elevati di △Struccante con estratto/struccante base, che indica un cambiamento significativo nel colore dei cosmetici modello con l'aggiunta dell'estratto confrontato al campione di base (senza aggiunta degli estratti). I dati di letteratura [73] mostrano che se i valori di AE sono superiori a 5, il colore viene percepito alla vigilia nuda e percepito come un effetto di colore. Per gli struccanti contenenti estratti PRE, KTE e CTE sono stati ottenuti i valori di AE rispettivamente di 8.83,9.17 e 8.14. Nel caso di prodotti con estratti di PGE e GGE, non è stata osservata alcuna influenza significativa nell'estratto sul colore del preparato. I valori di AE sono compresi nell'intervallo 2.51-2.82. Ciò significa che la differenza di colore è distinguibile solo da un osservatore esperto [80,81].

3. Materiali e metodi

3.1. Materiale vegetale e procedura di estrazione

Il materiale vegetale utilizzato nella ricerca erano fiori secchi di P. rhoeas L., P.granatum L., C.ternatea L., C.tinctorius L. e G.globosa L., ottenuti dall'erboristeria locale . Il processo di estrazione è stato eseguito in un bagno ad ultrasuoni (Digital Mgtrasonic Cleaner, Berlino, Germania), che è stato eseguito utilizzando il metodo descritto da Yang et al.[82]. 10 grammi di fiori secchi e 100 g di acqua sono stati utilizzati per preparare estratti d'acqua delle piante testate. Il processo è stato condotto per 20 minuti a temperatura ambiente. Gli estratti ottenuti sono stati quindi raccolti e filtrati tre volte attraverso carta da filtro Whatman n. 1. Dopo filtrazione, gli estratti sono stati evaporati a pressione ridotta a 40 gradi. Una soluzione madre alla concentrazione di 100 mg/mL è stata preparata dagli estratti secchi ed è stata conservata al buio a 4 gradi fino a ulteriori analisi. Vengono utilizzate le seguenti abbreviazioni: PRE—estratto di Papaver rhoeas, PGE—estratto di Punica granatum, GGE—estratto di Gomphrena globosa, CTE—estratto di Carthamus tinctorius, KTE—estratto di Clitoria ternatea.

3.2. Determinazione dei Composti Bioattivi mediante HPLC-UV-ESI-MS

Gli estratti ottenuti sono stati analizzati per determinare i loro principali composti bioattivi utilizzando un HPLC(DionexUltiMate 300{{2{24}}}} RS Thermo Fisher Scientific, Sunnyvale, CA, USA), accoppiato con uno spettrometro di massa (4000 QTRAP, AB Sciex, Concord, ON, Canada), dotato di una sorgente di ionizzazione elettrospray (ESI) e di una trappola ionica a triplo quadrupolo di massa analizzatore. La separazione cromatografica è stata ottenuta con un sistema a fase inversa a gradiente. Inoltre, la colonna cromatografica da 100 × 4,6 mm Kinetex 3,5 μm XB-C18 100 A con catene laterali isobutiliche e con fase stazionaria di terminazione TMS utilizzata con una colonna di guardia di composizione simile è stata acquistata da Phenomenex e mantenuta a 30 gradi . Un sistema binario di solventi comprendente 0,1 percento (o/v) di acido formico acquoso come solvente A e metanolo come solvente B è stato utilizzato in modalità gradiente durante 19,1 minuti del tempo di esecuzione. Le condizioni di eluizione applicate erano le seguenti:0.0-15.0 min 25-100 percento B,15.0-17.0 min 100 percento B,17.0-17.1 min 100-25 percento B,17.1-19.1 min 25 percento B. La velocità di flusso della fase mobile era di 0,6 mL/min e il volume di iniezione era di 10 μL. L'eluente è stato monitorato mediante spettrometro di massa a ioni elettrospray (ESI-MS) in modalità ioni negativi e scansionato da m/z 20 a 1000 Da. Per l'analisi di quantificazione, il rivelatore MS a triplo quadrupolo funzionava in modalità di scansione di monitoraggio delle reazioni multiple (MRM). Le condizioni ottimali dell'analizzatore di massa e la selezione degli ioni prodotto per i singoli composti sono state determinate sperimentalmente. A tale scopo, sono state introdotte soluzioni standard dei composti studiati (1 ng/mL) in composizione in fase mobile utilizzando una pompa di infusione operante in erogazione costante del campione. Dopo essersi assicurati che fosse selezionato lo ione precursore corretto, il potenziale di declustering (DP), il potenziale di ingresso (EP), il potenziale di uscita della cella di collisione (CXP) e l'energia di collisione (CE) sono stati ottimizzati per ciascuna transizione MRM (Tabella S1). Sono state monitorate due transizioni MRM, una per la quantificazione e una per la conferma. I parametri MS sono stati impostati come segue: temperatura capillare di 600 C, gas curtain a 35 psi, gas nebulizzatore a 60 psi e gas di essiccazione a 50 psi. La tensione della sorgente in modalità di ionizzazione negativa -4500 V è stata applicata per la determinazione dei composti bioattivi. L'azoto è stato utilizzato come gas di cortina e di collisione. L'analisi dei dati è stata elaborata con il software Analyst 1.5.1. L'identificazione dei composti selezionati è stata effettuata mediante massa molecolare e frammento di anioni di ogni singolo composto e confermata dalla frammentazione di MS2. Le identità di nove composti sono state determinate insieme alla loro formula chimica, agli ioni molecolari deprotonati e agli ioni frammento caratteristici per ogni singolo picco. Sei composti sono stati quantificati in base alla curva di calibrazione generata utilizzando le aree di picco delle transizioni MRM più intense degli standard analitici. La linearità della risposta del rivelatore per i composti quantificati è stata dimostrata mediante l'iniezione di standard di calibrazione a otto livelli di concentrazione che vanno da 0,01 ug/mL a 2 ug/mL. Le curve di calibrazione erano lineari con i coefficienti di correlazione (R) maggiori di 0,99. Nel caso in cui i campioni non rientrassero nell'intervallo lineare del rivelatore CMS, i campioni sono stati diluiti.

Gli standard analitici di acido chinico, acido gallico, acido caffeico, acidi caffeilchinici (CQA, due isomeri:3- e 5-CQA) e quercetina sono stati acquistati da Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA ). Tutti gli standard utilizzati erano di grado analitico (2 Maggiore o uguale al 99 percento di purezza).

Le soluzioni stock standard sono state preparate pesando e sciogliendo accuratamente 20 mg di ciascuno standard in 10 ml di metanolo di grado LC-MS per ottenere una concentrazione di 2 mg/mL. Diluizioni seriali di 2.{{10}} ug/mL, 1,5 ug/mL,1.0 ug/mL, 0,5 ug/mL,0 Sono stati quindi prodotti 0,1 ug/mL, 0 0,05 ug/mL, 0,02 ug/mL e 0,01 ug/mL utilizzando una soluzione di metanolo di grado LC-MS. Il limite di quantificazione (LOQ) è stato definito come 0,01 ug/ml.

Il test LC-MS/MS è stato eseguito in triplicato. I dati ottenuti sono stati presentati come medie ± deviazioni standard.

3.3. Determinazione delle proprietà antiossidanti

3.3.1.ABTS· più saggio di scavenging

Innanzitutto, la soluzione ABTS è stata preparata miscelando 19,5 mg di ABTS e 3,3 mg di persolfato di potassio con 7 ml di tampone fosfato (pH{5}}.4) e sciolta per 16 ore al buio. Quindi, la soluzione è stata diluita fino all'assorbanza a un livello di circa 1.0. Le assorbanze sono state misurate alla lunghezza d'onda 入{10}} nm. Successivamente, 20 mL di estratti di KTE, PGE, PRE, CTE e GGE (10.100.250.500 ug/mL) sono stati miscelati con 980 mL di soluzione diluita di ABTSe ​​plus e quindi incubati per 10 minuti al buio. Nella fase successiva, l'assorbanza dei campioni preparati è stata misurata a 入=734 nm utilizzando uno spettrofotometro UV/VIS Aquamate Helion (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). L'acqua distillata è stata utilizzata come bianco. L'ABTS plus scavenging è stato calcolato dall'equazione (1):

dove: As—assorbanza del campione; Ac: assorbimento del campione di controllo. Le misurazioni sono state effettuate in triplicato per ogni campione estratto. La procedura è stata descritta da Gawel-Beben et al. [83].

3.3.2.Saggio di scavenging radicale DPPH

La capacità degli estratti di eliminare i radicali liberi è stata effettuata utilizzando il metodo descritto da Brand-Williams et al. [84]. Si basa sull'uso del radicale 1,1-difenile-2-picrylidrazyl (DPPH). In primo luogo, 33 μL di soluzioni acquose di estratti a concentrazioni di 100 ug/mL sono stati miscelati con 167 μL di soluzione di metanolo di DPPH (4 mM) e trasferiti in una piastra a pozzetti 96-, quindi miscelati agitando. Successivamente, l'assorbanza dei campioni è stata misurata ad una lunghezza d'onda di 517 nm. Le misurazioni sono state effettuate ogni5 minuti per 30 minuti su uno spettrofotometro con filtro UV-VIS Max入{14}} (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Per ciascun estratto sono state eseguite tre repliche indipendenti. Come controllo è stata utilizzata acqua con una soluzione di DPPH. La capacità antiossidante è stata espressa come percentuale dell'inibizione della DPPH utilizzando l'equazione (2):

dove: As—assorbanza del campione; Ac: assorbimento del campione di controllo. Le misurazioni sono state effettuate in triplicato per ogni campione estratto.

3.3.3.Rilevamento dei livelli intracellulari di specie reattive dell'ossigeno (ROS)

Per determinare la capacità degli estratti analizzati di generare la produzione intracellulare di specie reattive dell'ossigeno nelle cellule HaCaT e BJ, è stato utilizzato un colorante fluorogenico H, DCFDA. Questo composto ha la capacità di entrare nelle cellule per diffusione passiva, dove viene deacetilato dalle esterasi intracellulari in un composto non fluorescente. Se nella cellula sono presenti specie reattive dell'ossigeno, questo composto si trasforma in DCF altamente fluorescente. Per determinare il livello intracellulare di ROS in HaCaT e BJ, le cellule sono state seminate in 96-piastre a pozzetti. Quindi, le cellule sono state coltivate in un'incubatrice per 24 ore. Il mezzo DMEM è stato rimosso e sostituito con 10 μM di H2DCFDA (Sigma Aldrich, St.Louis, MO, USA) sciolto in un mezzo DMEM privo di siero. Le cellule HaCaT e BJ sono state incubate in H, DCFDA per 45 minuti e quindi incubate con gli estratti alle concentrazioni∶ di 100, 250 e 500 ug/mL. Le cellule trattate con perossido di idrogeno 1 mM (H2O2) sono state utilizzate come controlli positivi. I campioni di controllo erano cellule non trattate con gli estratti testati. La fluorescenza DCF è stata misurata ogni 90 minuti utilizzando un lettore di micropiastre FilterMax F5 (Thermo Fisher Scientific) a un'eccitazione massima di 485 nm e spettri di emissione di 530 nm [85].

3.4. Valutazione dell'inibizione delle metallopeptidasi della matrice

3.4.1.Determinazione dell'Attività Antielastasi

Per determinare la possibilità di inibire la metalloproteinasi della matrice, l'elastasi neutrofila (NE), è stato applicato un kit fluorimetrico (Abcam, ab118971). Il test è stato eseguito secondo le istruzioni allegate al kit e con la procedura descritta da Niziol-Lukaszewska et al. [86]. Le analisi sono state eseguite in una 96-piastra a pozzetti standard con fondo piatto trasparente. Per l'analisi sono stati utilizzati estratti vegetali in una concentrazione di 100 e 250 ug/mL. Inizialmente, sono state preparate soluzioni enzimatiche NE, un substrato NE e un controllo inibitore (SPCK) secondo le istruzioni. La soluzione diluita di NE è stata aggiunta a tutti i pozzetti e quindi i campioni del test, il controllo dell'inibitore e il controllo enzimatico (tampone del test) sono stati aggiunti ai pozzetti successivi. Successivamente, i campioni sono stati miscelati e incubati a 37 gradi per 5 minuti. Nel frattempo, è stata preparata una miscela di reazione mescolando il tampone di analisi e il substrato NE. La miscela è stata aggiunta a ciascun pozzetto e mescolata accuratamente. La fluorescenza è stata misurata immediatamente alla lunghezza d'onda di eccitazione 入=400 nm e all'emissione 入=505 nm utilizzando un lettore di micropiastre (FilterMax F5, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) La capacità di inibire l'attività NE dell'analizzato campioni è stato calcolato dall'equazione (3):

Il risultato finale è stata la media aritmetica di tre misurazioni indipendenti.

3.4.2. Determinazione dell'attività anti-collagenasi

Per valutare la capacità degli estratti ottenuti di inibire l'attività della collagenasi, è stato applicato un kit fluorometrico (Abcam, Cambridge, UK, ab211108). Il test è stato eseguito secondo le istruzioni allegate al kit e con la procedura descritta da Niziol-Lukaszewska et al. [86]. Le analisi sono state eseguite in una 96-piastra a pozzetti standard con fondo piatto trasparente. Per l'analisi sono stati utilizzati estratti vegetali in una concentrazione di 100 e 250 ug/mL. In primo luogo, la collagenasi (COL) è stata disciolta in un tampone di analisi della collagenasi (CAB). Quindi, i campioni analizzati sono stati aggiunti a COL e CAB. I campioni di controllo dell'inibitore sono stati preparati miscelando l'inibitore della collagenasi(1,{8}}fenantrolina(80 mM) con collagenasi e tampone CAB. I pozzetti di controllo enzimatico sono stati preparati mescolando COL diluito con CAB. Il tampone CAB è stato utilizzato come controllo di fondo . Quindi, i campioni sono stati incubati a temperatura ambiente per 15 minuti. È stata preparata una miscela di reazione mescolando il substrato di collagenasi con CAB. La miscela di reazione così preparata è stata aggiunta a tutti i campioni analizzati e miscelata accuratamente. Successivamente, è stata misurata la fluorescenza ad un lunghezza d'onda di eccitazione di 490 nm ed emissione di 520 nm La misurazione è stata eseguita in modalità cinetica per 60 minuti a 37 C. La capacità di inibire l'attività COL degli estratti ottenuti è stata calcolata dall'equazione (4):

3.5. Determinazione delle proprietà antinfiammatorie

3.5.1. Inibizione della denaturazione delle proteine

L'attività inibitoria della proteinasi degli estratti PRE, PGE, KTE, CTE e GGE è stata eseguita secondo il metodo di Sakat et al.[87], che è stato modificato da Gunathilake et al.[88]. In breve, la soluzione di reazione (2 ml) consisteva in 1 ml di tripsina all'1% in tampone Tris-HCl 2{{10}} mM (pH7,4) e 1 ml di campione di prova ({{17} },02 ml estrarre 0,980 ml di acqua). La soluzione è stata incubata (37 gradi per 5 minuti), quindi è stato aggiunto 1 ml di caseina allo 0,8 percento (p/v) e la miscela è stata ulteriormente incubata per 20 minuti. Al termine dell'incubazione, sono stati aggiunti 2 mL di acido perclorico al 70% per completare la reazione. La miscela è stata centrifugata e l'assorbanza del surnatante è stata misurata a 210 nm rispetto al tampone come bianco. La soluzione tampone fosfato è stata utilizzata come controllo. La percentuale di inibizione della denaturazione proteica è stata calcolata utilizzando la seguente formula:

dove A{0}} assorbimento del campione di controllo e A2= assorbimento del campione di prova.

3.5.2. Inibizione dell'attività lipossigenasi

La capacità degli estratti ottenuti di inibire l'attività della lipossigenasi è stata determinata utilizzando il metodo descritto da Sarvesvaran et al. 【89】. Innanzitutto, 10 μL di estratti vegetali in diverse concentrazioni (100, 250 e 500 ug/mL) sono stati miscelati in una 96-piastra a pozzetti con 160 μL di PBS 100 mM e 20 μL di soluzione di lipossigenasi di semi di soia (167 U/ ml）. I campioni sono stati incubati a 25 gradi per 10 minuti e dopo questo tempo sono stati aggiunti 10 μL di acido linoleico di sodio per avviare la reazione. Quindi, l'assorbanza dei campioni è stata misurata a 234 nm per un periodo di 3 minuti ogni minuto utilizzando un lettore di micropiastre FilterMax F5 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Diclofenac è ​​stato utilizzato come controllo positivo. La percentuale di inibizione dell'attività della lipossigenasi è stata calcolata dall'equazione (6):

dove: come è l'assorbanza del campione testato, Ac è l'assorbanza del controllo negativo.

Il risultato finale è stata la media aritmetica di tre misurazioni indipendenti.

3.6. Analisi di citotossicità

3.6.1. Coltura cellulare

In questo studio sono state utilizzate due linee cellulari della pelle: cheratinociti umani normali (HaCaT) e fibroblasti (BJ). Gli HaCaT sono stati ottenuti da CLSCell Lines Service (CLS Cell Lines Service GmbH, Eppelheim, Germania) e BJ dall'American Type Culture Collection ( Manassas, Virginia, USA). Le cellule sono state coltivate in Modification of Eagle's Medium di Dulbecco (DMEM, Biological Industries, Cromwell, CO, USA) con piruvato di sodio, L-glutammina e alto contenuto di glucosio (4,5 g/L). Il terreno è stato inoltre arricchito con il 10% di siero bovino fetale (Gibco, Waltham, MA, USA) e l'1% con antibiotici (100 U/mL di penicillina e 1000 ug/mL di streptomicina, Gibco) per prevenire la contaminazione microbica. Le cellule sono state coltivate in un'incubatrice a 37 gradi in un'atmosfera umidificata con il 95% di aria e il 5% di anidride carbonica.

3.6.2.Saggio Alamar Blue

Dopo che le cellule in coltura (HaCaT e BJ) hanno raggiunto la confluenza desiderata, il mezzo DMEM è stato aspirato nei flaconi di coltura. Le cellule attaccate al fondo sono state lavate due volte con soluzione salina sterile tamponata con fosfato. Lo strato cellulare è stato staccato con tripsina e quindi le cellule sono state poste in un mezzo DMEM fresco. Le cellule sono state piastrate in 96-piastre a fondo piatto (VWR, Radnor, PE, USA) e dopo essersi attaccate al fondo delle piastre, le cellule sono state trattate con estratti (100, 250 e 500 ug/mL). Le cellule sono state incubate per 24 h.

Il test di citotossicità è stato eseguito con il test Alamar Blue (Sigma, R7017, Life Technologies, Bleiswijk, Paesi Bassi). Dopo l'incubazione, ai pozzetti è stata aggiunta una soluzione di resazurina ad una concentrazione di 60 uM, quindi le piastre sono state poste in un'incubatrice a 37 gradi per 2 ore. Trascorso questo tempo, è stata misurata la fluorescenza（入{4}}nm）. Ciascuna concentrazione di estratto è stata eseguita in tre repliche.

3.6.3. Saggio di assorbimento del rosso neutro

Il Neutral Red Uptake Assay è il secondo test utilizzato per determinare la citotossicità di PRE, PGE, KTE, CTE e GGE. Innanzitutto,{0}}sono state preparate piastre a fondo piatto come descritto nella sezione precedente. Dopo 24 h di esposizione delle cellule agli estratti, sono state aspirate e sostituite con colorante rosso neutro (40 ug/mL) e incubate per 2 h. Dopo questo tempo, le cellule sono state lavate con soluzione salina tamponata con fosfato. Nella fase successiva, ai pozzetti è stato aggiunto un tampone decolorante (150 μL). Quindi, l'assorbimento di dve rosso neutro è stato determinato misurando la densità ottica (OD) a 540 nm. Ciascuna concentrazione di estratto è stata eseguita in tre repliche.

3.7. Determinazione del fattore di protezione solare (in vitro)

Il fattore di protezione solare (SPF) è stato determinato misurando l'assorbanza di una soluzione acquosa di estratti in concentrazioni di 10 ug/mL e 50 ug/mL, nell'intervallo di lunghezze d'onda da 290 a 320 nm a intervalli di 5- nm. Dai risultati ottenuti, l'SPF è stato calcolato dall'equazione di Mansur [90]: dove∶ EE（λ）—spettro dell'effetto eritematoso, I（入）—spettro dell'intensità solare, ABS（入）—assorbanza del prodotto solare, CF— fattore di correzione（=10）, E（N）×I（λ）: sono stati utilizzati i valori determinati da Sayre [91].

3.8. Misurazioni della perdita d'acqua transepidermica (TEWL) e dell'idratazione cutanea

Le misurazioni TEWL e di idratazione cutanea sono state condotte utilizzando una sonda TEWAmeter TM 300 e una sonda Corneometer CM 825 collegata a un adattatore MPA (Courage plus Khazaka Electronic, Köln, Germania). Cinque volontari hanno partecipato allo studio. Sul loro avambraccio pelle, sono state contrassegnate sei aree (2 × 2 cm di dimensione). Una quantità di 0,2 ml degli estratti vegetali testati è stata applicata in cinque punti, il sesto posto era il controllo (non trattato con alcun campione). Dopo 60 e 360 ​​min , sono state effettuate le misurazioni del livello di idratazione e del TEWL.Il risultato finale è stato la media aritmetica (di ciascun volontario) di cinque misurazioni indipendenti (idratazione cutanea) e 20 misurazioni (TEWL).

3.9.Preparazione di cosmetici modello (struccante) contenenti estratti

È stato preparato un cosmetico modello (struccante). Tutti i componenti utilizzati erano in linea con i requisiti EcoCert e COSMOS. La formulazione è mostrata in Tabella 7.

Il prodotto è stato ottenuto miscelando gli ingredienti (dal punto 1 al punto 6) a temperatura ambiente fino ad ottenere un liquido omogeneo. Nell'ultima fase, il pH della formulazione è stato regolato. Lo struccante è stato diviso in porzioni. Una quantità dell'1% delle soluzioni madre dell'estratto è stata aggiunta a ciascuna porzione e miscelata accuratamente.

3.10.Determinazione dei parametri di colore di estratti e cosmetici (struccanti) contenenti estratti

Campioni di estratti e cosmetici con estratti sono stati testati a temperatura ambiente, 48 h dopo la loro preparazione. È stato utilizzato un CHROMA METER CR-400(Konica Minolta, Sensing Inc., Tokyo, Giappone) per valutare i parametri del colore (coordinate CIELAB). Il sistema CIELAB è stato definito dalla Commissione Internazionale sull'Illuminazione nel 1978. Si basa su tre attributi di colore: L*, a*,b, dove L* è una variabile di luminosità proporzionale al valore nel sistema Munsell, e a* e b* sono coordinate cromatiche. Le coordinate a* e b* indicano rispettivamente le posizioni sugli assi rosso/verde e giallo/blu ( più un=rosso, -a=verde; più b=giallo, - b =blu).

Sulla base dei dati ottenuti: L*, a* e b*, sono stati calcolati i seguenti parametri di colore: croma (C*) e tonalità (h). Sono state utilizzate le seguenti equazioni:

4. Conclusioni

Sulla base dei risultati ottenuti, si può concludere che gli estratti vegetali testati mostrano diverse caratteristiche positive, grazie alle quali possono essere utilizzati nella produzione di cosmetici come ingrediente sicuro e bioattivo. È stato dimostrato che queste piante sono una ricca fonte di polifenoli, che conferisce loro proprietà antiossidanti. PRE ha mostrato la migliore capacità di eliminare i radicali liberi, probabilmente perché contiene la maggior parte dei polifenoli rispetto ad altre piante. PGE e PRE hanno mostrato la migliore capacità di ridurre la produzione di ROS nelle cellule. Inoltre, le piante non mostrano alcuna attività citotossica. Tutti gli estratti testati hanno mostrato un effetto inibitorio sugli enzimi elastasi e collagenasi, con P. granatum e GGE che hanno il maggiore effetto inibitorio. Questo può indicare che queste piante possono essere utilizzate in cosmesi come sostanze che rallentano i processi di invecchiamento. Inoltre, i risultati ottenuti indicano che queste piante hanno proprietà antinfiammatorie. In questo caso, CTE e KTE sembravano essere i migliori. KTE e PGE hanno mostrato un effetto protettivo contro i raggi UV, anche a basse concentrazioni. A concentrazioni più elevate, tutte le piante avevano un effetto protettivo dai raggi UV. Inoltre, le piante hanno un effetto positivo sull'idratazione della pelle e riducono la perdita di acqua transepidermica. Gli estratti PRE, KTE e CTE possono essere utilizzati come coloranti efficaci nei prodotti cosmetici. Il liquido modello struccante contenente i suddetti estratti era caratterizzato da un colore intenso e stabile nel tempo. Il colore dei cosmetici con estratti PGE e GGE può essere notato solo da osservatori esperti e non differiscono in modo significativo dal campione cosmetico bianco, senza l'aggiunta dell'estratto. Considerando tutti i risultati ottenuti, si può concludere che Papaver rhoeas, Clitoria ternatea e Carthamus tinctorius possono essere utilizzati con successo come fonti di coloranti gialli, arancioni, blu e viola nella produzione di cosmetici che saranno sicuri da usare e, inoltre, avrà un effetto positivo sulla pelle.

Questo articolo è estratto da Molecules 2022, 27, 922. https://doi.org/10.3390/molecules27030922 https://www.mdpi.com/journal/molecules