Gao-Zi-Yao migliora l'apprendimento e la funzione della memoria nei vecchi ratti ipertesi spontanei Parte 2
Feb 19, 2024
Animali sperimentali
Ratti maschi ipertesi spontanei (SHR) di dodici mesi e di otto settimane sono stati acquistati dal Nanjing Animal Model Center.
Esiste una forte relazione tra i maschi di 8-settimana e la memoria. Durante questo periodo, il cervello della creatura maschio si sviluppa rapidamente e le connessioni tra i suoi neuroni aumentano gradualmente, il che a sua volta influisce sullo sviluppo della sua memoria.
La ricerca mostra che la memoria delle creature maschili continua a migliorare con l'età. Ciò non solo ha un impatto significativo sulla loro sopravvivenza e riproduzione, ma li aiuta anche ad adattarsi meglio all’ambiente e ad affrontare le nuove sfide.
Pertanto, dovremmo incoraggiare attivamente i giovani maschi a partecipare a una serie di attività benefiche, come risolvere enigmi, apprendere nuove abilità ed esplorare nuove aree. Queste attività stimolano il loro cervello, permettendo loro di svilupparsi più velocemente e migliorare le loro capacità di memoria.
Allo stesso tempo, dovremmo anche fornire un ambiente e un’atmosfera adatti per le giovani creature maschili. Farli sentire sicuri e vicini può favorire lo sviluppo del loro cervello e migliorare la loro memoria.
In breve, dovremmo fare tutto il possibile per aiutare i giovani maschi a migliorare la loro memoria in modo che diventino creature più intelligenti, più sicure e capaci. Ciò non solo favorisce il loro sviluppo personale, ma anche la prosperità e la sopravvivenza dell’intera specie. Si può vedere che dobbiamo migliorare la memoria, e la Cistanche deserticola può migliorare significativamente la memoria, perché la Cistanche deserticola ha effetti antiossidanti, antinfiammatori e antinvecchiamento, che possono aiutare a ridurre le reazioni ossidative e infiammatorie nel cervello, proteggendo così il cervello. salute del sistema nervoso. Inoltre, Cistanche deserticola può anche promuovere la crescita e la riparazione delle cellule nervose, migliorando così la connettività e la funzione delle reti neurali. Questi effetti possono aiutare a migliorare la memoria, l’apprendimento e la velocità di pensiero e possono anche prevenire lo sviluppo di disfunzioni cognitive e malattie neurodegenerative.
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In questo modello, l’ipertensione inizia a svilupparsi entro i 4 mesi di età con la comparsa di cambiamenti correlati all’ipertensione nella microvascolarizzazione cerebrale entro i 6 mesi di età [37].
I ratti sono stati alloggiati in condizioni ottimali con igiene standard, mantenuti ad una temperatura di 25 gradi con un ciclo luce/buio 12/12 e alimentati con cibo standard per ratti e acqua ad libitum.
Tutte le procedure sono state approvate ed eseguite secondo le linee guida per la cura e l'uso degli animali stabilite dall'Università di Soochow, che è coerente con il nostro rapporto precedente[35].
Gli esperimenti sono stati eseguiti secondo le Linee guida per l'uso degli animali da laboratorio del National Institutes of Health (NIH, numero di pubblicazione 85–23, revisionato nel 1996). Il presente studio è riportato dalle linee guida ARRIVE.
È stato applicato SHR di otto settimane per il controllo dell'invecchiamento (SHR-Young, n=10). Ratti di dodici mesi sono stati trattati con o senza Gao-Zi-Yao per acqua distillata (Old SHR-C, n=10), dose bassa (Old SHR-L, n=10), dose media (Vecchio SHR-M, n=10), dose elevata (Vecchio SHR-H, n=10) mediante alimentazione gastrica.
Dosaggi di Gao-Zi-Yao basso, medio e alto pari a 1/2-, 1-, dosaggi tripli per l'applicazione clinica sul paziente calcolati in base alla superficie corporea. Gao-Zi-Yao è stato sciolto in 5 ml di acqua distillata prima dell'applicazione ed è stato somministrato una volta al latte per 4 settimane.
La pressione sanguigna e la frequenza cardiaca sono state monitorate ogni settimana con il metodo del tail-cuff e anche il peso corporeo è stato monitorato ogni settimana come da nostra osservazione precedente [35].
Dopo 4 settimane, è stato eseguito l'esperimento del labirinto acquatico di Morris e i ratti sono stati sacrificati sotto anestesia con sodio pentobarbital (50 mg/kg ip), il tessuto dell'ippocampo è stato raccolto per ulteriori analisi. Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dal comitato etico per le licenze dell'Università di Soochow.
Esperimento del labirinto acquatico di Morris
L'esperimento del labirinto acquatico di Morris (BW-MWM101, Shanghai Bio-will Co., Ltd., Shanghai, Cina) è stato eseguito come descritto in precedenza con alcune modifiche [38]. Il test è stato pianificato per 6 giorni, i giorni da 1 a 5 erano per il periodo di formazione e il giorno 6 per testare i risultati.
I ratti sono stati addestrati per 2 minuti, registrando il tempo di salita sulla piattaforma come tempo di latenza. Il sesto giorno la piattaforma è stata rimossa. I ratti sono stati posti nel quadrante della distanza più lontana e la traiettoria del nuoto è stata registrata per 2 minuti.
I parametri per l'apprendimento e la funzione della memoria sono stati calcolati dal software.
Misurazione dei livelli sierici di NO e fattori infiammatori mediante ELISA
Livelli sierici di NO (numero di catalogo: S0023), IL-1 (numero di catalogo: A301BH80153), IL-2 (numero di catalogo: A31038348), IL-6 (numero di catalogo: A30681042), eTNF- (Numero di catalogo: A38280855) sono stati misurati utilizzando kit ELISA disponibili in commercio (Biotechnology Co., Ltd. Shanghai Enzyme Research. Shanghai, Cina). Tutti i passaggi sono stati eseguiti secondo le istruzioni del produttore.
Colorazione di Nissl
Il tessuto dell'ippocampo di ratto è stato isolato, fissato, incluso in paraffina, quindi incubato in una soluzione colorante con blu di toluidina all'1% per 5-10 minuti a temperatura ambiente. Dieci sezioni sono state sciacquate in acqua distillata, immerse in etanolo al 95% per 5-30 minuti e disidratate in etanolo al 100%.
Dopo la disidratazione, la fetta è stata posta in xilene e coperta con vetrino utilizzando un mezzo di resina. Il numero di neuroni nelle regioni CA1, CA2 e del giro dentato (DG) dell'ippocampo è stato osservato e analizzato utilizzando il programma di analisi ImageJ.
Western blot per le proteine legate all'apprendimento e alla memoria
Il Western blot per le proteine legate all'apprendimento e alla memoria è stato effettuato come descritto nel nostro precedente rapporto con alcune modifiche [39].
I tessuti dell'ippocampo sono stati omogeneizzati con tampone RIPA (50 mmTris, 150 mM NaCl, 1% Triton-X-100, pH 7,0) contenente fenilmentanosulfonil fluoruro (R&D Systems Inc., Minneapolis, USA). Gli omogenati sono stati centrifugati a 12,000 × g per 10 minuti a 4 gradi.
Le proteine cellulari sono state separate mediante SDS-PAGE e trasferite su membrane PVDF (Hybond TM-ECL; Amersham Pharmacia Biotech, Inc.). Le membrane sono state bloccate nel latte scremato al 5% in PBS e nello 00,1% Tween-20a temperatura ambiente.
Le macchie sono state quindi incubate con l'anticorpo primario: recettore anti-glutammato 1 (1:1000, Abcam, Inc., numero di catalogo: ab183797), anticorpo antiNMDAR2B (1:1000, Abcam, Inc., numero di catalogo: ab28373), anti-fosfo -Anticorpo CaMKII (1:1000, Abcam, Inc., n. di catalogo: ab171095), anticorpo antifosfo-CREB (1:1000, Abcam, Inc., n. di catalogo: 32096) o anti-GAPDH (Santa Cruz Biotech, Inc., N. catalogo: sc-47724).
Successivamente, le membrane sono state incubate per 1 ora con un anticorpo secondario (Ig-G anti-coniglio coniugato con HRP, 1:2000, Abcam, Inc. N. catalogo: ab205718). Le membrane sono state quindi lavate tre volte per 15 minuti utilizzando TBS-T per rimuovere gli anticorpi in eccesso prima dell'incubazione per 1 minuto con reagenti chemiluminescenti (ECL, R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA).
Inoltre, le bande immunoreattive sono state rilevate da un sistema di analisi del gel per elettroforesi (GL2200 Pro, Crestream Inc. USA). L'intensità delle bande è stata analizzata dal software Image J. La quantità di proteine bersaglio è stata normalizzata dall'espressione GAPDH [39].
analisi statistica
Per l'analisi statistica è stato utilizzato il software SPSS 18.0. I dati sono presentati come media ± SEM I dati raggruppati sono stati analizzati utilizzando un'analisi della varianza unidirezionale seguita dal test di Student-Newman-Keuls. Un valore P < 0.05 è stato considerato statisticamente significativo come nel nostro precedente rapporto [35].
Risultati
Pressione arteriosa sistolica (SBP), frequenza cardiaca e peso corporeo tra SHR giovane e SHR vecchio
Yong SHR ha mostrato una pressione sistolica inferiore nelle prime due settimane rispetto alla vecchia SHR, per poi aumentare senza alcuna differenza tra i due gruppi nelle tre settimane successive (Fig. 2A).
Al contrario, la frequenza cardiaca non presentava alcuna differenza tra i due gruppi nelle prime due settimane, poi il giovane SHR è aumentato notevolmente rispetto al vecchio SHR nelle ultime tre settimane (Fig. 2B). Il giovane SHR ha mostrato un peso corporeo inferiore rispetto al vecchio SHR durante l'intero periodo di osservazione (Fig. 2C).
Parametri del labirinto d'acqua di Morris tra il giovane SHR e il vecchio SHR
Per determinare l'apprendimento e la memoria dipendenti dall'ippocampo, è stato eseguito l'esperimento del labirinto acquatico di Morris. Il vecchio SHR ha mostrato una latenza di fuga più lunga nei primi quattro giorni rispetto al giovane SHR (Fig. 3A).
I tempi di attraversamento del quadrante target erano inferiori nel vecchio SHR rispetto al giovane SHR (Fig. 3B).
La percentuale di tempo nel quadrante della piattaforma target era più breve nel vecchio SHR rispetto al giovane SHR (Fig. 3C). Anche la percentuale della lunghezza del percorso nel quadrante era più breve nel vecchio SHR rispetto al vecchio SHR (Fig. 3D). Questi risultati suggeriscono che il vecchio SHR ha un deterioramento della funzione cognitiva.
Numero di neuroni nell'ippocampo tra SHR giovane e SHR vecchio
Il numero di neuroni nelle diverse aree dell'ippocampo è stato contato mediante colorazione di Nissl. I risultati hanno mostrato che esiste un numero minore di neuroni nelle regioni CA1, CA2 e DG del vecchio SHR rispetto al giovane SHR (Fig. 4).
Espressioni proteiche legate all'apprendimento e alla memoria nell'ippocampo tra il giovane SHR e il vecchio SHR
I risultati del Western blot hanno mostrato che l'espressione delle proteine correlate all'apprendimento e alla memoria (GluR1, NMDAR 2B, fosforilata-CaMK II e fosforilata-CREB) nell'ippocampo vecchio SHR era inferiore a quella nel giovane ippocampo SHR (Fig. 5).
Effetto di Gao‑Zi‑Yao su SBP, frequenza cardiaca e peso corporeo nei vecchi SHR
È stato analizzato l'effetto di Gao-Zi-Yao sulla SBP. Il trattamento con un basso dosaggio di Gao-Zi-Yao ha notevolmente ridotto la SBP nei vecchi SHR dalla seconda settimana alla quarta settimana rispetto al gruppo di controllo del vecchio SHR, i dosaggi medi e alti di Gao-Zi-Yao hanno marcatamente ridotto la SBP nei vecchi SHR dalla prima settimana alla quarta settimana rispetto al vecchio SHR di controllo (Fig. 6A). Questi risultati indicano che Gao-Zi-Yao esercita un effetto antipertensivo nei vecchi SHR.
Abbiamo anche confrontato i dati sugli effetti della frequenza cardiaca Gao-Zi-Yaoon e del peso corporeo. I nostri dati hanno dimostrato che non vi era alcuna differenza significativa nella frequenza cardiaca e nel peso corporeo tra tutti i gruppi durante l'intero periodo di osservazione (Fig. 6B, C).
Effetto di Gao‑Zi‑Yao sui livelli sierici di NO, IL‑1, IL‑2 e TNF‑ nei vecchi SHR
Il trattamento con dosaggi medi e alti di GAO-ZIYAO ha aumentato i livelli sierici di NO rispetto ai livelli del gruppo di controllo SHR (Fig. 7A). Il trattamento con tutti i dosaggi testati di GAO-ZI-YAO ha ridotto i livelli sierici di IL-1, IL-2 rispetto ai livelli nel gruppo di controllo SHR (Fig. 7B, C); tuttavia, solo l'alto dosaggio di GAO-ZI-YAO ha soppresso i livelli sierici di TNF- (Fig. 7D).
Questi risultati dimostrano che GAO-ZI-YAO potrebbe regolare lo stress ossidativo e l'infiammazione.
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