Immunità innata epiteliale gastrointestinale: regionalizzazione e organoidi come nuovo modello

Il tratto gastrointestinale umano è in costante contatto con stimoli microbici. Le sue barriere devono garantire la coesistenza con i batteri commensali consentendo al contempo la sorveglianza dei patogeni intrusi. Al centro dell'interazione si trova lo strato epiteliale, che segna i confini del corpo. È dotato di una moltitudine di diversi sensori immunitari innati, come i recettori Toll-like, per attivare le risposte infiammatorie ai microbi. La disfunzione di questo intricato sistema provoca patologie associate all'infiammazione, come la malattia infiammatoria intestinale. Tuttavia, la complessità delle interazioni cellulari, le loro basi molecolari e il loro sviluppo rimangono poco conosciute. Negli ultimi anni, gli organoidi derivati ​​dalle cellule staminali hanno guadagnato una crescente attenzione come modelli promettenti sia per lo sviluppo che per un'ampia gamma di patologie, comprese le malattie infettive. Inoltre, gli organoidi consentono lo studio dell'immunità innata epiteliale in vitro. In questa recensione, ci concentriamo sulla barriera epiteliale gastrointestinale e sulla sua organizzazione regionale per discutere il rilevamento e lo sviluppo immunitario innato.

L'esposizione a stimoli microbici può migliorare l'immunità, perché gli stimoli microbici possono stimolare il corpo a produrre cellule immunitarie e molecole immunitarie, stimolando così la risposta immunitaria del corpo. In particolare, l'esposizione a stimoli microbici può attivare cellule immunitarie come macrofagi, cellule dendritiche e cellule natural killer, accelerare la proliferazione e la differenziazione delle cellule immunitarie e migliorare la vitalità e la resistenza alle malattie delle cellule immunitarie. Inoltre, gli stimoli microbici possono anche promuovere risposte infiammatorie e regolazione immunitaria e migliorare la difesa immunitaria del corpo contro i patogeni. Pertanto, una ragionevole esposizione a stimoli microbici può promuovere il miglioramento dell'immunità umana. Si può vedere che dobbiamo migliorare l'immunità. Cistanche può migliorare significativamente l'immunità. La cenere di carne contiene vari ingredienti biologicamente attivi, come polisaccaridi, due funghi, Huang Li, ecc. Questi ingredienti possono stimolare vari tipi di carne nel sistema immunitario. cellule, aumentandone la vitalità immunitaria.

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Parole chiave

Tratto gastrointestinale. Immunità. Regionalizzazione e organoidi.

introduzione

Il tratto gastrointestinale (GI) è necessario per la digestione del cibo e si estende dalla cavità orale attraverso l'esofago, lo stomaco, l'intestino tenue e crasso fino all'ano. Il lume gastrointestinale è colonizzato da un'ampia varietà di commensali, simbionti e occasionalmente agenti patogeni. La colonizzazione microbica segue un gradiente con meno di 103 microbi/ml nello stomaco a 103-107 microbi/ml nell'intestino tenue e 1011-1012 microbi/ml nel colon (rivisto in [1-3]). Dallo stomaco ghiandolare in poi, il tratto gastrointestinale è rivestito da un singolo strato di cellule epiteliali colonnari. Questo strato epiteliale comprende diverse cellule specializzate, strettamente interconnesse da complessi proteici giunzionali, che rafforzano la barriera fisica (Fig. 1).

L'interazione tra il microbiota intestinale, i patogeni ingeriti e le cellule epiteliali è mediata dai recettori di riconoscimento del modello (PRR), inclusi i recettori Toll-like (TLR), i recettori del dominio di oligomerizzazione legante i nucleotidi (NOD)-like (NLR) e altri recettori citosolici (Fig. 2, rivisto in [7, 11]). Questi PRR svolgono un ruolo chiave nel riconoscimento dei pattern molecolari associati ai microbi (MAMP) e dei pattern molecolari associati ai danni (DAMP). Dopo l'attivazione del PRR nelle cellule epiteliali, le cascate di segnalazione a valle inducono l'espressione di diverse citochine e chemochine attraverso percorsi infiammatori, come il percorso NF-κB, per dirigere le cellule immunitarie professionali (riviste in [8, 12-16]). Oltre ai classici PRR, recentemente sono stati scoperti ulteriori sensori di attività batteriche, come l'alfa-chinasi 1 (ALPK1) [17-19]. Gli inflammasomi, complessi citoplasmatici composti da proteine ​​NLR, riconoscono modelli molecolari aggiuntivi, come i metaboliti batterici (rivisti in [7, 9]).

Le risposte immunitarie innate gastrointestinali, compreso il rilevamento del PRR, devono bilanciare la necessità di protezione da agenti patogeni potenzialmente dannosi con la capacità di tollerare l'esposizione al diverso microbioma luminale. Pertanto, si prevede che l'espressione e la funzione della segnalazione PRR abbiano un impatto importante non solo sul rilevamento dei patogeni, ma anche sull'omeostasi tissutale (riquadro 1) e sulle malattie infiammatorie tra cui gastroenterite acuta, gastrite e malattie infiammatorie intestinali (IBD) (riviste in 12, 13, 20, 21]). Sebbene ciascuna di queste malattie mostri patogenesi completamente diverse, condividono una caratteristica fondamentale: l'interfaccia tra l'ambiente e il corpo è notevolmente disturbata. Tuttavia, è in corso un dibattito sul fatto che i cambiamenti nello strato epiteliale intestinale, in particolare quelli che influenzano la sua funzione immunitaria innata, siano una causa o una conseguenza delle suddette malattie.

La maggior parte delle conoscenze sulla segnalazione PRR è stata raccolta dalla ricerca sulle cellule ematopoietiche. È stata una sfida discriminare le funzioni della segnalazione PRR nelle cellule epiteliali da quelle delle cellule immunitarie infiltranti. I principali ostacoli includono le difficoltà nell'isolare cellule epiteliali pure e nell'innalzare anticorpi affidabili contro i PRR. Con il progresso degli organoidi che derivano dalle cellule staminali epiteliali intestinali, è ora disponibile un modello sperimentale riduzionista che consente indagini sulla risposta immunitaria innata delle cellule epiteliali primarie. Gli organoidi sono definiti come colture cellulari 3- dimensionali derivate da cellule staminali che hanno la capacità di auto-organizzarsi e conservano alcune delle funzioni dell'organo originale (ad es. secrezione, filtrazione, assorbimento, contrazione). Poiché gli organoidi possono essere coltivati ​​da cellule staminali adulte residenti nei tessuti (ASC) o da cellule staminali pluripotenti (PSC), le cellule non vengono trasformate. Insieme, i due tipi di organoidi coprono un vasto repertorio di organi che possono essere imitati (rivisto in [4, 22, 23]). Entrambe le tecnologie hanno i loro vantaggi (esaminati in [4, 22, 23]). Ad esempio, le colture di organoidi derivati ​​da ASC hanno un enorme potenziale di espansione e sono relativamente omogenee, mentre gli organoidi derivati ​​da PSC sono più complessi nel senso che combinano cellule di origini evolutive molto diverse (ad esempio cellule epiteliali e mesenchimali). Gli organoidi derivati ​​​​dal PSC consentono l'analisi delle fasi di sviluppo ma potrebbero non raggiungere il livello completo di differenziazione nello strato epiteliale come si trova in vivo [24]. Gli organoidi derivati ​​​​da ASC generati da tessuti fetali possono anche consentire lo studio della maturazione degli epiteli fetali poiché invecchiano in coltura [24, 25].

Questa recensione evidenzierà le intuizioni degli studi che utilizzano organoidi e discuterà il potenziale di questa tecnologia per lo studio dell'immunità innata epiteliale. Ci concentriamo sull'organizzazione regionale nel tratto gastrointestinale.

Identità regionale e segnalazione immunitaria innata nel tratto gastrointestinale

Quando si esaminano le malattie gastrointestinali è importante notare che alcune di esse sono limitate a una sezione specifica del tratto gastrointestinale. L'IBD include la malattia di Crohn (MC) e la colite ulcerosa (UC), che mostrano un modello di infiammazione differenziale e specifico per la malattia: mentre l'UC inizia nel retto e si trova nel colon, la MC può interessare tutte le parti del tratto gastrointestinale da la cavità orale all'ano. Inoltre, il CD è caratterizzato da un'infiammazione segmentaria e discontinua all'interno del tratto gastrointestinale, mentre l'UC è solitamente descritta come un'infiammazione continua del colon (revisionata in [26, 27]). Nell'esofago, nello stomaco e nel colon, l'incidenza del cancro è elevata e l'infezione e l'infiammazione possono promuovere lo sviluppo e la progressione di questi tumori (rivisto in [28, 29]). Al contrario, la trasformazione maligna nell'intestino tenue è molto rara (esaminata in [30]). L'apparente specificità di segmento di queste malattie nel tratto gastrointestinale rimane enigmatica, ma si è tentati di ipotizzare che la loro origine specifica per regione sia radicata in disturbi specifici per regione del sistema strettamente bilanciato della funzione di barriera epiteliale, dell'immunità innata e della rigenerazione della mucosa. . Pertanto, è interessante evidenziare le differenze nei segmenti all'interno del tratto gastrointestinale.

Il tratto gastrointestinale comprende diversi segmenti anatomicamente definiti con funzioni fisiche ampiamente distinte (esaminati in [31]). La funzione principale dello stomaco è la digestione del cibo e l'eliminazione dei patogeni in entrata da parte dell'acido gastrico. I nutrienti non devono raggiungere lo strato epiteliale dello stomaco; pertanto, il corpo investe pesantemente in una barriera protettiva del muco, proteggendo le cellule epiteliali non solo dal suo contenuto acido ma anche dal contenuto luminale (rivisto in [32, 33]). Al contrario, la funzione principale dell'intestino tenue non è solo la digestione ma anche l'assorbimento dei nutrienti. In linea con questo, l'intestino tenue ha una superficie notevolmente allargata a causa dei villi che sporgono nel lume intestinale, dove le superfici cellulari entrano in stretto contatto con i nutrienti. La maggior parte della digestione avviene nell'intestino tenue prossimale, nel duodeno e nel digiuno, dove i villi sono lunghi e sottili. Il digiuno ha il più alto rapporto di cellule Paneth che secernono peptidi antimicrobici [34], che decorano il muco piuttosto sciolto, proteggendo così lo strato epiteliale e mantenendo sterili le cripte (rivisto in [35]).

I villi diventano progressivamente più corti e più larghi verso l'ileo (rivisto in [36]), dove ancora una volta il muco assume una parte importante della protezione: con il più alto rapporto di cellule caliciformi, l'ileo ha uno strato mucoso più spesso e una velocità di digestione e assorbimento rispetto al digiuno [34] (rivisto in [31]). Infine, il colon riassorbe l'acqua e investe in una copertura mucosa estesa, spessa ea doppio strato per poter ospitare in sicurezza trilioni di batteri commensali. Il colon non ha villi e le cripte sono più piccole di quelle dell'intestino tenue. Non ci sono cellule di Paneth e il rapporto tra cellule caliciformi può raggiungere il 25% dello strato epiteliale [37]. Pertanto, i tre segmenti intestinali hanno strategie diverse per mantenere una distanza di sicurezza tra le cellule epiteliali e il microbiota. Il riconoscimento e l'attivazione delle MAMP delle vie immunitarie è un altro strato di questa interazione e, pertanto, è ragionevole che siano strutturate anche lungo il tratto gastrointestinale (rivisto in [38]). Tuttavia, rimane un affascinante enigma su cosa modella esattamente la struttura dell'organizzazione PRR.

Sebbene sia intuitivo che i geni importanti per le funzioni regionali, come la digestione e l'assorbimento dei nutrienti, seguano la compartimentazione spaziale lungo l'asse cefalocaudale (rivisto in [39]), tale organizzazione non era prevista per la segnalazione immunitaria innata epiteliale. Precedenti studi avevano riportato la regolazione della segnalazione PRR in risposta alla stimolazione con MAMP. Ad esempio, la reattività TLR4 diminuisce dopo la nascita, presumibilmente a causa dell'esposizione a LPS durante il parto e la successiva colonizzazione dell'intestino [40]. Inoltre, la stimolazione di TLR9 con il suo ligando CpG-DNA porta a una diminuzione dell'espressione di TLR4 e inibisce la segnalazione di TLR4 [41]. Pertanto, ci si aspettava che il contatto con i microrganismi, le loro molecole e i metaboliti nel tratto gastrointestinale portasse al silenziamento dell'espressione del PRR verso il lume intestinale (rivisto in [14]). Tuttavia, risultati contraddittori, causati da difficoltà tecniche come anticorpi inaffidabili mirati ai TLR, hanno portato a confusione nel campo e non era chiaro se un particolare PRR fosse espresso o meno (rivisto in [42]). I primi Northern blot per l'mRNA di Tlr2 e Tlr4 in cellule epiteliali isolate ex vivo indicavano che i livelli di espressione di queste due molecole Tlr erano specifici del segmento: Tlr2 era espresso principalmente nel colon, mentre Tlr4 era espresso principalmente nello stomaco e nel colon. Gli autori lo definirono " compartimentazione strategica" di questi TLR [43]. Studi recenti hanno ora scoperto che questo principio di espressione specifica per segmento si estende oltre questi due TLR e ha svelato un'organizzazione regionale altamente complessa della segnalazione PRR che non sempre segue la carica microbica [44, 45].

Il primo dei due studi proveniva dal gruppo Barton e ha rivelato diversi livelli di organizzazione dell'espressione TLR. Il gruppo ha generato cinque ceppi di topi reporter, consentendo l'analisi dell'espressione di TLR2, 4, 5, 7 e 9, rispettivamente. TLR2 e 5 sono stati espressi nell'intestino tenue e nel colon prossimale, TLR4 è stato espresso nel colon e TLR7 e 9 non sono stati espressi. L'espressione del reporter negli organoidi di questi topi imitava da vicino l'espressione in vivo, indicando che l'espressione è indipendente dal contatto con il microbiota o con le cellule immunitarie [45].

Il secondo studio ha utilizzato una biobanca di organoidi umani e murini appena generati che coprono i diversi segmenti del tratto gastrointestinale: corpo, piloro, duodeno, digiuno, ileo e colon. L'analisi trascrizionale degli organoidi ha confermato i modelli di espressione per i TLR riportati dal gruppo Barton, ma ha inoltre rivelato una vasta estensione di espressione differenziale di TLR, NLR, componenti dell'inflammasoma e altri geni correlati all'immunità innata (Fig. 3 e [44 ]). Ad esempio, Nod2 era espresso principalmente nello stomaco, mentre le espressioni di diversi componenti del percorso dell'inflammasoma come Nlrp1b, Nlrp6 e Aim2 erano limitate all'intestino. Vari recettori sono stati espressi in modo uniforme; per esempio, l'espressione di Tlr3 è stata rilevata in ogni segmento del tratto gastrointestinale murino in quantità elevate, mentre Tlr5 è stata espressa in ogni segmento ma in quantità basse [44]. Di conseguenza, ogni segmento sembra avere il proprio complemento specifico di recettori immunitari innati e componenti di segnalazione.

Il confronto tra il murino e gli organoidi gastrointestinali umani ha dimostrato che in entrambe le specie il principio della complessa organizzazione dei componenti di segnalazione del PRR era lo stesso, ma i singoli profili di espressione del PRR potevano differire. Alcuni PRR, come TLR4 e NLRP6, erano modellati in modo simile lungo il tratto gastrointestinale di entrambe le specie. TLR4 è stato espresso prevalentemente nello stomaco e nel colon e l'espressione di NLRP6 è stata limitata ai segmenti dell'intestino. D'altra parte, diversi PRR come TLR1 e TLR2 hanno mostrato modelli che differivano tra le due specie. Mentre negli organoidi murini, l'espressione di entrambi aumentava lungo il tratto gastrointestinale ed era più alta nel colon, negli organoidi umani l'espressione era più alta nello stomaco e diminuiva lungo il tratto gastrointestinale [44]. Inoltre, l'espressione di TLR5 era più alta negli organoidi umani, con i livelli più alti osservati nello stomaco [44].

Come accennato in precedenza, gli organoidi consentono anche di verificare se un particolare percorso è funzionale mediante l'aggiunta del ligando e la successiva analisi dell'espressione genica bersaglio a valle. A complemento dell'analisi dell'espressione specifica della regione, lo studio ha anche scoperto che gli organoidi umani e murini mostrano una funzione specifica della regione: lo stomaco murino ha risposto al ligando TLR4 LPS, ma non al ligando TLR2 PAM3CSK4 o alla flagellina del ligando TLR5, sovraregolando l'NF- κB gene bersaglio Cxcl2. Il digiuno murino ha sovraregolato Cxcl2 in risposta a PAM3CSK4 e flagellina, ma non in risposta a LPS. Inoltre, il colon ha espresso Cxcl2 in risposta a tutti questi 3 ligandi testati [44]. Al contrario, gli organoidi umani di tutte le regioni hanno espresso l'analogo IL -8 umano di Cxcl2 in risposta alla flagellina, ma non in risposta a LPS e PAM3CSK [44]. Pertanto, non solo l'espressione ma anche la funzione dei PRR nell'intestino è altamente organizzata e specifica per segmento. Questi esperimenti sono stati condotti aggiungendo lo stimolo al mezzo organoide, stimolando così solo il lato basale, poiché il lato apicale è rivolto verso il lume sigillato degli organoidi. Altri esperimenti hanno dimostrato che esiste un livello di organizzazione ancora più elevato poiché l'espressione di PRR all'interno di un segmento può essere limitata a specifici tipi di cellule o persino a posizioni subcellulari, come solo il compartimento basale. Questi sono descritti più dettagliatamente di seguito.

Ogni regione del tratto gastrointestinale esprime il proprio insieme specifico di geni immunitari innati. Sebbene una generalizzazione sia difficile, i dati attuali suggeriscono che i TLR sono espressi maggiormente nello stomaco e nel colon, mentre l'intestino tenue è caratterizzato dall'espressione dei componenti dell'inflammasoma. Attualmente, il meccanismo molecolare sottostante e il vantaggio evolutivo non sono chiari.

Sospettiamo che le barriere fisiche e chimiche che coprono gli strati epiteliali nei diversi segmenti intestinali richiedano ciascuna il monitoraggio di minacce specifiche. Ad esempio, lo stomaco e il colon hanno entrambi uno strato di muco spesso a doppio strato con lo strato di muco interno saldamente attaccato allo strato epiteliale, mentre l'intestino tenue è coperto da uno strato di muco sottile e viscoso [46]. Le diverse costituzioni degli strati di muco a loro volta sono probabilmente dovute alle diverse funzioni dei rispettivi segmenti intestinali (digestione vs assorbimento di nutrienti vs riassorbimento di acqua). È ipotizzabile che lo spessore del muco influenzi il tipo di PRR necessari in siti specifici.

Cellule specializzate con funzione immunitaria nell'epitelio

Un concetto di vecchia data nell'immunità innata epiteliale è l'esistenza del riconoscimento immunitario innato specifico del tipo di cellula. I prototipi delle cellule epiteliali specializzate con funzione di difesa sono le cellule microfold (M) e le cellule Paneth, recentemente integrate da una cellula calice specializzata, la cellula calice sentinella. L'esistenza di tali cellule specializzate evidenzia i sistemi intricati e ridondanti che assicurano l'equilibrio dell'assorbimento dei nutrienti, la coesistenza con il microbiota e il monitoraggio di possibili invasori. La differenziazione diretta degli organoidi ora consente anche lo studio di queste cellule nella coltura cellulare.

Le cellule M si trovano nell'epitelio associato al follicolo che copre le placche di Peyer. Hanno una morfologia unica con bordi a pennello irregolari e strutture a microvilli ridotte. Il loro ruolo è quello di trasportare gli antigeni nel lume intestinale attraverso lo strato epiteliale fino al tessuto linfoide sottostante per la regolazione delle risposte immunitarie [47]. È stato dimostrato che le cellule M stesse e l'epitelio associato al follicolo esprimono diversi TLR [48] (rivisto in [14]). Tuttavia, le cellule M sono state difficili da studiare poiché non ce ne sono molte nel tessuto epiteliale e si trovano solo vicino alla complessa struttura delle placche di Peyer [47]. Tuttavia, le cellule M possono essere generate in colture organoidi utilizzando la differenziazione diretta. Per questo, l'attivatore del recettore del ligando NF-κB (RANKL) viene aggiunto al mezzo, che sovraregola il fattore di trascrizione SpiB, che è caratteristico della differenziazione delle cellule M [49]. Gli organoidi generati da topi geneticamente deficienti per la subunità NF-κB RelB non sono in grado di produrre cellule M dopo la stimolazione con RANKL, indicando che l'attivazione di NF-κB è essenziale per lo sviluppo delle cellule M [50]. Nella coltura di organoidi umani, oltre al RANKL, la linfotossina e l'acido retinoico sono cruciali per indurre la differenziazione verso le cellule M. Queste cellule M captano specificamente virus enterici come rotavirus e reovirus, indicando una corretta fenocopia della funzione naturale delle cellule M anche nelle colture di organoidi [51]. Il futuro lavoro sugli organoidi dovrà continuare a svelare l'interconnessione della segnalazione epiteliale NF-κB, lo sviluppo delle cellule M e la comunicazione con le cellule immunitarie.

Le cellule di Paneth sono mescolate con le cellule staminali intestinali alla base della cripta e sono state a lungo considerate le guardiane del compartimento delle cellule staminali perché secernono peptidi antimicrobici. Ad esempio, le cellule di Paneth secernono alfa-defensine, un processo che ha dimostrato di essere regolato da modelli microbici e meccanismi immunitari innati [52, 53]. Inoltre, NOD2, che è stato rilevato per la prima volta nella regione della cripta dell'intestino tenue murino [54], regola la secrezione di diverse alfa-defensine da parte delle cellule di Paneth, che a sua volta porta all'attivazione dell'immunità adattativa. Le cellule Paneth esprimono anche TLR5 e gli organoidi arricchiti con cellule Paneth esprimono livelli particolarmente elevati di TLR5. Il sequenziamento dell'RNA dopo la stimolazione rivela che mentre i normali organoidi intestinali piccoli esprimono solo livelli moderati dei geni bersaglio a valle TLR5 in risposta alla stimolazione con flagellina, come le citochine indotte da NF-kB, gli organoidi diretti a contenere un numero elevato di cellule Paneth montano un molto più forte risposta, indicando che le cellule di Paneth sono i principali responder alla flagellina nell'intestino tenue [44, 45]. Contrariamente all'espressione genica bersaglio, la risposta più drammatica delle cellule Paneth (degranulazione, estrusione e morte cellulare) non è innescata dalla stimolazione con ligandi TLR, ma richiede piuttosto la stimolazione con la citochina interferone-gamma derivata dalle cellule immunitarie professionali [55]. Questi risultati degli organoidi sono in accordo con le osservazioni che mostrano la degranulazione e l'estrusione delle cellule di Paneth dopo stimolazione con interferone-gamma in vivo [55]. Questo sottolinea elegantemente il sistema di controlli ed equilibri nello strato epiteliale.

Le cellule caliciformi sono importanti per la difesa epiteliale perché producono le mucine glicosilate cruciali per la formazione di una barriera di muco sullo strato epiteliale (rivisto in [56]). Nei topi, la carenza di MUC2 provoca infiammazione spontanea e aumenta la suscettibilità alle infezioni [57, 58]. Recentemente, nel colon del topo è stato descritto un sottoinsieme di cellule caliciformi denominate cellule caliciformi sentinella. Utilizzando espianti di tessuto, lo studio ha identificato l'ispessimento dello strato di muco in risposta all'esposizione ai ligandi TLR1/2, 4 e 5, ma non ai ligandi TLR9, NOD1 e NOD2 [59], in congruenza con un precedente rapporto di Tlr 2 ,4 e 5 essendo espressi in cellule caliciformi [60]. Gli autori hanno determinato che la risposta dipendeva anche dalla presenza dell'inflammasoma Nlrp6 ed era indipendente dai linfociti della mucosa utilizzando tessuti di una serie di topi knockout [59]. Inoltre, un precedente rapporto ha dimostrato l'importanza dell'inflammasoma NLRP6 per la secrezione di muco da parte delle cellule caliciformi [61]. L'imaging ha rivelato che specifiche cellule caliciformi situate nelle regioni apicali della cripta endocitavano l'LPS marcato in modo fluorescente [59]. Queste nuove cellule caliciformi sentinella non solo subiscono una rapida degranulazione ed espulsione epiteliale dopo il trattamento con i ligandi TLR, ma trasmettono anche un segnale di calcio alle cellule vicine attraverso ponti citoplasmatici intercellulari formati da giunzioni gap, probabilmente stimolando altre cellule caliciformi ad aumentare la secrezione di muco [59]. . Entrambe le cellule caliciformi e le cellule di Paneth appartengono al lignaggio secretorio. Gli organoidi consentono una differenziazione diretta verso entrambe le identità cellulari, producendo organoidi fortemente arricchiti in cellule caliciformi o cellule di Paneth [62]. Il confronto dei trascrittomi di questi organoidi distorti ha aiutato a identificare i regolatori chiave del percorso di differenziazione [63]. Un'ulteriore analisi dei dati omici e l'analisi funzionale di questi organoidi consentiranno una migliore comprensione del ruolo di entrambi i tipi di cellule nella difesa immunitaria innata.

Infine, è stato anche riportato che le stesse cellule staminali esprimono PRR specifici come TLR4 [64, 65], che non si trovano sui piccoli villi intestinali murini o sulle cellule di Paneth [66]. Inoltre, la maggior parte dell'espressione di Nod2 nella cripta murina sembra essere limitata alle cellule staminali [67]. La stimolazione con il ligando NOD2 ha aumentato la sopravvivenza delle cellule staminali e la formazione di organoidi, indicando che la stimolazione dei PRR può anche regolare direttamente la rigenerazione epiteliale intestinale.

Senza dubbio, gli attuali sforzi per generare atlanti di espressione genica che coprano ogni tipo di cellula in modo sempre più dettagliato forniranno presto un quadro più completo dell'organizzazione cellulare della segnalazione immunitaria innata nell'intestino così come in tutto il corpo [68-71 ].

Polarità cellulare e risposte immunitarie innate lato-specifiche

Infine, è anche rilevante considerare che le cellule epiteliali gastrointestinali sono altamente polarizzate, con un lato apicale specializzato rivolto verso il lume dell'intestino con il suo microbiota e un lato basolaterale rivolto verso il tessuto. In condizioni di omeostasi, i MAMP raggiungono solo il lato apicale. Tuttavia, quando la barriera epiteliale viene violata, i microrganismi possono anche sfidare il lato basolaterale. È stato quindi ipotizzato che le cellule epiteliali possano attivare selettivamente una risposta pro-infiammatoria solo quando stimolate dal lato basolaterale, per corrispondere alla minaccia rappresentata dal segnale. Ad esempio, è stato dimostrato che TLR9 induce percorsi di segnalazione distinti quando stimolato dal lato apicale o basolaterale nelle linee cellulari tumorali [72] e TLR5 ha indotto solo il gene di risposta NF-κB IL-8 quando stimolato dal lato basale [73 ].
Mentre studi precedenti che utilizzavano l'etichettatura di anticorpi contro i TLR hanno riportato un'espressione specifica solo su un lato (rivisto in [14, 16]), l'analisi dei topi reporter TLR utilizzando la colorazione di un tag HA non lo ha confermato ma ha invece dimostrato TLR2, 4 e 5 recettori su entrambi i lati apicale e basale del colon prossimale così come alcuni TLR4 intracellulari [45]. Queste apparenti differenze sono probabilmente dovute ai diversi approcci tecnici.

Gli organoidi ora consentono test funzionali diretti delle risposte immunitarie specifiche del lato, poiché la polarizzazione cellulare viene mantenuta negli organoidi. In condizioni standard, quando gli organoidi crescono in una matrice extracellulare, il lato apicale è rivolto verso il lume dell'organoide e il lato basale è rivolto verso la matrice extracellulare [74-76]. Quando cresciuto al di fuori di una matrice extracellulare, la polarità può invertirsi [77, 78]. Quando le cellule degli organoidi vengono seminate su superfici di coltura cellulare standard, come piastre di coltura o pozzetti transpozzetti, il lato apicale è rivolto verso il lume del pozzetto [44, 79-82].

Diversi studi hanno utilizzato organoidi per testare la funzione generale di particolari PRR senza affrontare differenze specifiche tra stimolazione apicale e basale. Questi studi includevano lo stimolo nel mezzo degli organoidi, che, in condizioni standard, stimola il lato basale della cellula. Usando questa tecnica, la sovraregolazione dei geni bersaglio a valle di NF-κB è stata identificata dopo stimolazione basale con ligandi di TLR4 nello stomaco, TLR2 e 3 nell'intestino tenue e TLR2, 3, 4 e 5 nel colon dei topi [44, 45, 83] e ai ligandi di TLR2 e 5 nello stomaco e TLR5 nell'intestino tenue e nel colon umano [44]. Inoltre, la stimolazione basale degli organoidi del colon murino con agonisti TLR4 ha indotto la differenziazione cellulare, in particolare verso il lignaggio secretorio [64], mentre gli agonisti NOD2 hanno indotto una maggiore sopravvivenza delle cellule staminali [67, 84] e la taurina ha stimolato la sovraregolazione dipendente da NLRP6- del gene bersaglio a valle dell'inflammasoma IL-18 [85]. In tutti questi studi, la stimolazione apicale non è stata testata.

Solo pochi studi hanno affrontato le funzioni collaterali specifiche dei PRR. È interessante notare che, contrariamente agli studi che utilizzano linee cellulari tumorali polarizzate, finora nessuno degli studi che utilizzano organoidi ha identificato un'attivazione specifica del lato di un tipico gene proinfiammatorio dipendente da NF-κB. I monostrati transwell derivati ​​da organoidi del colon umano esprimono livelli simili del gene bersaglio NF-κB IL-6 quando stimolati dal lato apicale o basale con ligandi di TLR1/2, 3, 4, 5, 7/8 e 9 [82]. Gli organoidi gastrici murini hanno anche risposto a una stimolazione apicale con il ligando TLR4 LPS in diversi saggi, inclusi i transwell e la microiniezione di LPS nel lume degli organoidi [44]. Le cellule epiteliali dell'intestino tenue murino non esprimevano il gene bersaglio NF-κB icam1 in risposta a una gamma di ligandi, indipendentemente dal fatto che fossero aggiunti a organoidi intatti, stimolando così il lato basale, o aggiunti a singole cellule dissociate, stimolando così tutto laterali [55].

Tuttavia, guardando oltre la risposta NF-κB, uno studio recente ha identificato una funzione specifica del TLR3 e la sua importanza nell'infezione virale [82]. I risultati degli esperimenti con monostrati derivati ​​da organoidi del colon umano hanno mostrato che l'espressione dei geni critici di difesa del virus di tipo I e interferone di tipo III era sovraregolata dopo la stimolazione basale con l'agonista TLR3, ma non dopo la stimolazione con altri agonisti TLR. Allo stesso modo, quando infettati da un virus, la risposta all'interferone degli organoidi era molto più forte se infettati dal lato basale rispetto all'infezione dal lato apicale. Questo era visibile nei monostrati derivati ​​da organoidi così come negli organoidi microiniettati con il virus. Lo studio ha inoltre identificato l'adattatore di classificazione della clatrina AP-1B come la molecola responsabile dell'espressione polarizzata di TLR3. Di conseguenza, i topi carenti di Ap-1b hanno mostrato risposte immunitarie esacerbate dopo l'infezione virale [82]. Ciò conferma la funzione polarizzata dei PRR e sottolinea l'importanza di questo livello di regolazione nell'ulteriore modulazione del riconoscimento e della difesa dei patogeni.

Finora, non esiste una risposta "taglia unica" alla domanda sulla polarità e risolvere la natura specifica del sito della segnalazione PRR rimane un compito tecnicamente impegnativo per il futuro.

La tolleranza come risposta alla colonizzazione e come programma di sviluppo predefinito

I meccanismi che contribuiscono all'organizzazione dell'immunità innata epiteliale non sono ancora chiari. Il concetto principale a questo proposito è stato l'induzione della tolleranza dopo la colonizzazione dell'intestino sterile durante il parto, la cosiddetta finestra di opportunità (rivista in [86–88]). Questo concetto postula un periodo di innesco del sistema immunitario innato e adattivo dopo la nascita, che pone le basi per l'omeostasi immunitaria e le successive interazioni ospite-microbica.

Il sistema immunitario neonatale e l'immunità innata epiteliale sono attrezzati in modo univoco per padroneggiare questa transizione dalla sterilità alla coesistenza con il microbiota. Alla nascita, l'intestino neonatale umano è completamente maturo con villi intestinali e cripte contenenti cellule di Paneth. Lo strato epiteliale intestinale del neonato murino è più immaturo e subisce un drastico cambiamento misurabile a livello del trascrittoma confrontando i diversi stadi di sviluppo [89] e visibile nell'architettura del tessuto e nella differenziazione cellulare: l'asse cripta-villo non è ancora formato e la proliferazione cellulare è inferiore, senza migrazione cellulare o esfoliazione. Non contiene cellule di Paneth mature; tuttavia, gli enterociti producono il peptide antimicrobico simile alla catelicidina (CRAMP) [90]. Le cellule di Paneth compaiono quando si formano le cripte 2 settimane dopo la nascita [91]. Al momento dello svezzamento, l'epitelio è completamente formato con cripte e villi, enterociti, cellule caliciformi e cellule enteroendocrine; Le cellule di Paneth hanno rilevato la produzione di peptidi antimicrobici; e le cellule caliciformi hanno aumentato la produzione di mucine per formare lo strato di muco (rivisto in [92]).

Questa transizione dell'epitelio dipendente dall'età va di pari passo con una graduale diminuzione dell'espressione di TLR5 nell'epitelio del piccolo intestino. Allo stesso tempo, l'espressione di TLR3 aumenta durante il periodo neonatale. Altri PRR, come TLR2, 4 e 9, sono espressi a livelli simili nei topi neonati e adulti [45, 93].

I meccanismi che portano alla regolazione dell'espressione e della funzione del PRR dopo la nascita rimangono poco chiari. Come accennato in precedenza, diversi studi hanno proposto un contributo dell'ambiente, in particolare la colonizzazione microbica, alla regolazione dell'espressione del PRR dopo la nascita [40, 41] (rivisto in [14]). Tuttavia, i topi privi di germi rispetto a quelli privi di agenti patogeni specifici non hanno mostrato differenze nell'espressione di TLR nell'intestino tenue o nel colon, indicando che né la sovraregolazione di TLR3 né la sottoregolazione di TLR5 in questo primo periodo dipendono dal microbiota [45, 93]. Inoltre, negli organoidi, l'espressione di molti, ma non tutti, i componenti di segnalazione PRR era già definita negli organoidi provenienti da tessuti che non erano mai stati in contatto con prodotti microbici [44]. Ciò indica che gran parte dell'organizzazione delle vie di segnalazione immunitaria innata è definita indipendentemente dal contatto con il microbiota e sembra essere determinata da processi di sviluppo predefiniti, come quelli delineati sopra, che modellano l'identità generale dei tessuti lungo il tratto gastrointestinale . Ciò non esclude un'ulteriore messa a punto dell'espressione del PRR da parte di fattori ambientali durante l'età adulta.

L'importanza della regolazione tempestiva delle interazioni microbiche epiteliali diventa chiara quando l'epitelio immaturo si confronta prematuramente con la colonizzazione microbica: i neonati prematuri sono inclini allo sviluppo di enterocolite necrotizzante (NEC), caratterizzata da necrosi intestinale, sepsi sistemica e multiorgano fallimento. Sebbene la patogenesi sia considerata multifattoriale, diversi studi hanno indicato che si sviluppa in risposta a uno squilibrio tra segnalazione proinfiammatoria e meccanismi di riparazione nell'intestino prematuro (rivisto in [94]) ed è stato suggerito un contributo dei PRR [41, 65, 95 –97]. Diversi studi hanno utilizzato organoidi fetali umani [24, 98, 99], organoidi murini normali esposti a batteri e ipossia per modellare NEC [100], o organoidi da un modello NEC murino e da pazienti NEC [101]. Studi futuri utilizzeranno questi modelli di organoidi consolidati e nuovi per definire ulteriormente il contributo dell'epitelio nel NEC.

Modellazione degli aspetti dipendenti dall'epitelio dell'IBD con organoidi

La perdita dell'integrità della barriera epiteliale intestinale è una caratteristica distintiva dell'IBD, cioè CD e UC, e sembra essere causata da un'interazione multifattoriale di predisposizione genetica, fattori ambientali, cambiamenti del microbiota intestinale e alterazioni della risposta immunitaria locale e sistemica (rivisto in [27]). Le attuali terapie prendono di mira prevalentemente le risposte immunitarie (aberranti) nell'IBD, che sono associate a tassi elevati di non-responder ed effetti collaterali (esaminati in [27]). È necessaria una migliore comprensione del contributo specifico dell'epitelio alla fisiopatologia dell'IBD per identificare nuovi bersagli terapeutici che potrebbero anche essere in grado di influire direttamente sul ripristino della barriera epiteliale intestinale e quindi sulla guarigione della mucosa.

Per ottenere informazioni sulla patologia epiteliale, diversi gruppi hanno istituito biobanche viventi composte da organoidi generati da singoli pazienti con CU o CD. Sebbene questo approccio sia ovvio, finora solo pochi studi hanno riportato risultati di organoidi derivati ​​da questo gruppo di pazienti [102-104]. Ciò può essere spiegato dall'osservazione che gli organoidi di pazienti con IBD sono più difficili da generare. La nostra esperienza è che gli organoidi generati da pazienti CD crescono più lentamente durante i primi passaggi e alcuni campioni sono stati persi, il che è stato associato a un tasso più elevato di contaminazione batterica nelle colture [105].

La caratterizzazione degli organoidi derivati ​​da pazienti con IBD ha rivelato un fenotipo con dimensioni ridotte e capacità di gemmazione, aumento del tasso di morte cellulare, detriti luminali e polarizzazione parzialmente invertita delle cellule epiteliali [106]. Il confronto globale di organoidi di pazienti con CU o CD e controlli sani ha mostrato che le differenze trascrizionali e di metilazione osservate nell'epitelio intestinale sono state mantenute in vitro [102, 103, 107]. Inoltre, uno studio precedente su organoidi generati da pazienti con CD ha suggerito alterazioni permanenti delle cellule staminali intestinali nell'IBD. Ciò si basava sull'osservazione che gli organoidi generati da lesioni CD attive mantenevano alti livelli di espressione di marcatori di cellule staminali epiteliali intestinali [108]. Ciò è stato in una certa misura confermato in un recente studio in cui gli organoidi del colon derivati ​​da pazienti pediatrici con IBD hanno mostrato un modello di espressione prolungata dei geni che presentano l'antigene [109].

Concentrandosi sui cambiamenti nella funzione della barriera epiteliale intestinale, inclusa la perdita di giunzioni strette e desmosomi, che di solito si trovano nell'IBD [110], è stato dimostrato che gli organoidi dei pazienti affetti da CD mantengono questo fenotipo di alterazioni giunzionali in condizioni di coltura [105]. Questo era particolarmente vero quando gli organoidi venivano generati da siti di grave infiammazione [105]. Una diminuzione delle proteine ​​​​giunzionali potrebbe anche essere indotta negli organoidi di donatori sani mediante l'applicazione della citochina proinfiammatoria TNF- e/o IFN- [106, 111]. Tuttavia, il modello fisso di cambiamenti delle proteine ​​​​giunzionali negli organoidi di pazienti con IBD è stato osservato solo a livello proteico ma non a livello di mRNA [105].

Queste osservazioni suggeriscono che diversi cambiamenti sono stati fissati negli organoidi dei pazienti con IBD. L'osservazione che alcuni, ma non tutti, i cambiamenti permanenti sono visibili solo sulle proteine, ma non a livello di RNA, suggerisce che ci sono alterazioni permanenti nelle modifiche post-trascrizionali o nella degradazione delle proteine ​​negli organoidi dei pazienti con IBD. Questo però resta da indagare nel dettaglio.

Non è chiaro cosa induca esattamente le alterazioni permanenti nei modelli di espressione dell'epitelio infiammato. A lungo si sospettava un effetto del microbiota; tuttavia, uno studio recente ha dimostrato che l'effetto del microbiota sull'epitelio si perde nel tempo [112]. Lo studio ha confrontato diverse strutture di topi perché le diverse composizioni del microbioma delle colonie di topi sono state identificate come fattori di confusione negli studi in vivo. Per chiarire questo effetto, lo studio ha confrontato gli isolati epiteliali e le colture di organoidi da topi privi di germi e due colonie separate di topi privi di patogeni specifici con microbiota diverso. Mentre l'epitelio appena isolato ha mostrato un'impronta dell'esposizione del microbiota sui livelli di RNA e proteine, questo effetto è stato perso dopo diverse settimane di coltura di piccoli organoidi intestinali [112]. Inoltre, un confronto globale dell'espressione genica di organoidi generati da regioni infiammate o non infiammate degli stessi pazienti IBD ha dimostrato che gli organoidi IBD delle regioni infiammate hanno perso l'espressione genica infiammatoria già dopo alcune settimane di coltura. I trascrittomi degli organoidi sono stati quindi raggruppati per paziente; pertanto, le differenze permanenti tra IBD e controlli sani sono rimaste. Il fenotipo infiammatorio negli organoidi IBD potrebbe quindi essere reindotto dall'aggiunta di un cocktail di citochine [107]. Nel complesso, ciò suggerisce che i cambiamenti permanenti osservati negli organoidi dei pazienti con IBD sono indipendenti dal contatto con il microbiota o le citochine.

Pertanto, sebbene sia ragionevole ipotizzare che alcuni dei cambiamenti permanenti nelle cellule epiteliali intestinali di pazienti con IBD possano essere causati da cambiamenti nella segnalazione immunitaria innata, le prove di ciò sono attualmente scarse. Inoltre, non tutti i cambiamenti epiteliali osservati nelle regioni infiammate dell'intestino sono permanentemente conservati nell'epitelio purificato, indicando importanti contributi dall'ambiente locale. In futuro, nuovi studi con modelli organoidi più complessi, che incorporino anche cellule immunitarie, stimolazione di citochine infiammatorie e co-colture con microrganismi, dovrebbero aiutare ad affrontare questa ipotesi in modo più dettagliato.

Conclusioni, prospettive future e prospettive

In sintesi, mentre molte malattie all'interno del tratto gastrointestinale rimangono non completamente comprese, prove crescenti indicano un ruolo critico dell'epitelio gastrointestinale nella patogenesi di molte di esse, sebbene il suo ruolo specifico rimanga poco chiaro.

La conoscenza limitata della funzione immunitaria innata dell'epitelio gastrointestinale è stata attribuita alla mancanza di modelli sperimentali appropriati. Con l'implementazione della tecnologia degli organoidi, è stato compiuto un passo importante per superare questo problema. Gli organoidi generati da ciascuna regione del tratto gastrointestinale si aggiungeranno in modo significativo alle conoscenze esistenti. Come rivelato da studi precedenti, la generazione di organoidi offre il vantaggio cruciale di poter osservare le risposte delle cellule gastrointestinali primarie rispetto alle linee cellulari trasformate, che sono per lo più generate da tumori maligni gastrointestinali. Una delle caratteristiche più affascinanti degli organoidi è che mantengono caratteristiche specifiche del segmento del tratto gastrointestinale da cui sono stati generati come parte della loro identità cellulare durante l'età adulta. Secondo gli attuali studi sperimentali, l'identità regionale è fissata nelle cellule staminali gastrointestinali. In questo contesto, un problema rimanente sarà determinare esattamente come e quando durante lo sviluppo si verifica questa programmazione intrinseca.

Quando si esaminano concetti specifici di come l'epitelio può rispondere o interagire con l'ambiente, la tecnologia degli organoidi ha ora permesso di illuminare l'espressione e la funzione differenziale e specifica del segmento dei PRR all'interno dell'epitelio gastrointestinale. Le conseguenze funzionali complessive per i complessi sistemi regolatori all'interno dell'intero tratto gastrointestinale non sono ancora chiare e dovranno essere affrontate in futuro. Per questo, sarà anche importante co-coltivare organoidi con cellule immunitarie (riviste in [113]), cellule del sistema nervoso enterico [114] e fattori luminali come le co-colture batteriche (riviste in [115]) (Fig. 4).

Un ulteriore aspetto importante è che gli organoidi generati dal tessuto di pazienti affetti da malattie gastrointestinali come l'IBD mantengono alcune delle caratteristiche osservate nei corrispondenti campioni di tessuto da cui derivano. Ciò offre la possibilità unica di svelare ulteriormente il contributo specifico dell'epitelio e della malattia alla patogenesi delle malattie gastrointestinali, non solo quelle che comportano cambiamenti indotti dall'infiammazione, ma anche quelle che comportano cambiamenti nelle malattie maligne. Entrambi possono rivelarsi coinvolgere un contributo specifico dell'immunità innata derivata dall'epitelio. Per questo, la creazione sistematica di "biobanche viventi" sarebbe un passo importante. Come visione per il futuro, tali biobanche viventi potrebbero essere collegate a biobanche già esistenti, che attualmente forniscono esclusivamente biomateriali "morti". Ciò rappresenterebbe un altro passo importante non solo per la ricerca, ma anche per facilitare la diagnosi e la terapia individualizzate per i pazienti.

Riquadro 1. L'immunità innata e le cellule epiteliali nel tratto gastrointestinale non sono chiare se l'impatto osservato sia dovuto alla segnalazione immunitaria innata nelle cellule epiteliali o nelle cellule immunitarie professionali.

Per districare l'interazione tra cellule immunitarie professionali e cellule epiteliali, diversi studi hanno utilizzato knockout specifici dell'epitelio o, più recentemente, organoidi epiteliali. Nei modelli murini, nessuna delle delezioni epiteliali specifiche dei PRR porta a un'infiammazione spontanea. Tuttavia, i topi con knockout epiteliale specifico di MyD88 sono più suscettibili alla colite sperimentale e mostrano una grave interruzione della barriera, risposte alterate delle cellule caliciformi e di Paneth [121] e una ridotta produzione di mucina e peptidi antimicrobici [121, 122]. Gli organoidi dell'intestino tenue non innescano una risposta infiammatoria a diversi ligandi PRR purificati [55], sebbene ciò non possa essere generalizzato e dipenda dalla specie, dalla posizione e dall'età del tessuto da cui sono generati gli organoidi [44, 45].

L'assenza di un fenotipo infiammatorio spontaneo nei modelli knockout PRR specifici delle cellule epiteliali supporta l'ipotesi che fattori diversi da una risposta infiammatoria generale dell'epitelio abbiano un impatto sull'omeostasi epiteliale. Ad esempio, la stimolazione con l'agonista NOD2 muramil dipeptide (MDP) ha aumentato il numero di organoidi che crescono da cellule staminali isolate, indicando che la segnalazione immunitaria innata supporta la sopravvivenza delle cellule staminali [67, 84]. Inoltre, i dati dei topi evidenziano l'importanza degli effetti anti-apoptotici della segnalazione di NF-κB in risposta ad altri stimoli, come il TNF- [123]. È interessante notare che negli esseri umani i polimorfismi nei geni immunitari innati, inclusi NOD2 e TLR4, sono associati a un aumentato rischio di sviluppare IBD [124] e il blocco del TNF- è attualmente il trattamento più efficace per IBD in alcuni pazienti (rivisto in [125]).

Emerge un quadro in cui un basso livello di stimolazione immunitaria innata è importante per la secrezione di muco, l'integrità della barriera e la sopravvivenza delle cellule epiteliali. La sua compromissione può consentire la traslocazione dei batteri intestinali dal lume nel tessuto subepiteliale, portando all'infiammazione.

Ringraziamenti

Ringraziamo Ömer Kaya per l'aiuto con le illustrazioni e Rike Zietlow per l'editing.

Contributo dell'autore

Idea: SB Concetto iniziale: SB e Ö.K.; ricerca bibliografica: Ö.K., NS e SB; Bozza iniziale: Ö.K. Revisione, riscrittura, aggiunta di sezioni: NS, SB Tutti gli autori hanno rivisto criticamente il manoscritto finale.

Finanziamento

Finanziamenti ad accesso aperto abilitati e organizzati da Projekt DEAL. Questo lavoro è stato supportato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG GRK 2157; 3D Tissue Models for Studying Microbial Infections by Human Pathogens, Project 10, to SB), dal Centro interdisciplinare per la ricerca clinica (IZKF; www.med.uni-wuerzburg.de/izkf /startseite) a Würzburg (Grant AD-427 a NS e SB), e DFG SPP1982 SCHL1962/5-2 a NS.

Dichiarazioni

Conflitto d'interesse

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Accesso libero

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