Genetica dell'osteopontina in pazienti con malattia renale cronica: studio tedesco sulla malattia renale cronica Ⅳ

Variabili e misurazioni di base

Una serie standardizzata di biomarcatori è stata misurata in un laboratorio centrale certificato utilizzando protocolli standardizzati [81]. Tra gli altri, la creatinina e l'albumina dal siero e dalle urine sono state quantificate utilizzando rispettivamente una metodologia tracciabile IDMS (Creatinine plus, Roche, Germania) e un metodo turbidimetrico (Tina-quant, Roche, Germania) Roche/Hitachi MODULAR P. La velocità di filtrazione glomerulare (GFR) è stata stimata utilizzando la formula CKD-EPI basata sulla creatinina (unità: mL/min/1,73 m2, [82]). L'UACR è stato calcolato come albumina urinaria/creatinina urinaria misurata (mg/g, [83]). Età e sesso sono stati auto-riferiti alla visita di base. Nel 2015, l'OPN è stato misurato dai campioni di siero basali dell'intera coorte di studio sulla GCKD utilizzando una tecnica immunoenzimatica quantitativa a sandwich (ELISA in fase solida; Quantikine Human OPN Immunoassay DOST00 di R&D Systems (R&D Systems Europe, Abingdon, Regno Unito )). La quantificazione è stata effettuata presso l'Istituto di chimica clinica e medicina di laboratorio, Greifswald, Germania. I coefficienti di variazione (intra-test) erano 4,5%, 5,3% e 3,5% rispettivamente per i livelli basso, mediano e alto. Il coefficiente di variazione inter-test è stato del 6,4%. I reagenti e gli standard secondari sono stati utilizzati come raccomandato dal produttore.

ERBA TRADIZIONALE BIOLOGICA PER LA SALUTE DEI RENI

Genotipizzazione, controllo di qualità e imputazione

Informazioni dettagliate sulla genotipizzazione e sulla pulizia dei dati nello studio GCKD sono state descritte in precedenza [18]. In breve, il DNA è stato isolato dal sangue intero e genotipizzato in 2.612.357 varianti per 5.123 partecipanti al GCKD utilizzando l'array Illumina HumanOmni2.5 Exome BeadChip (Illumina, GenomeStudio, Genotyping Module versione 1.9.4) presso il Centro Helmholtz di Monaco. La pulizia dei dati è stata eseguita separatamente per il contenuto Omni2.5 e il contenuto del chip dell'esoma dell'array. Sulla base di protocolli standardizzati [84], script scritti personalizzati (R, Perl) e software Plink1.9 [85] sono stati utilizzati per il controllo di qualità (QC) del contenuto Omni2.5. Le fasi del QC basato sui campioni includevano controlli del tasso di chiamata, del sesso, dell'eterozigosi, dell'ascendenza genetica e della parentela, portando all'esclusione di 89 campioni. A livello di variante, i polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) sono stati esclusi se il tasso di identificazione era<0.96, and whenever the assumption of the Hardy-Weinberg equilibrium was violated (p-value <1.0E-05). After removing SNPs on duplicate positions, the cleaned dataset contained 5,034 individuals and 2,337,794 SNPs (S1 Fig). Genotypes were then imputed using minimac3 v2.0.1 at the Michigan Imputation Server [86]. The Haplotype Reference Consortium (HRC) haplotypes version r1.1 were used as the reference panel, and Eagle 2.3 was used for phasing. The final dataset contains data of 5,034 participants and 7,750,367 high-quality autosomal bi-allelic variants (imputation quality of R2 �0.3, MAF �1%). For the exome chip content, QC was similarly conducted [18]. In addition, checks specific for exome variants were added [87]. In brief, 96 individuals and 3,818 SNPs were removed, the latter of which had a call rate <0.95 and a Hardy-Weinberg equilibrium p-value <1.0E−05. The final exome chip dataset contains 5,027 participants with 226,233 variants (S1 Fig). For the exome chip association analysis, the genotypes were post-processed using zCall with a zscore threshold of six [88]. Genomic positions base on human genome build GRCh37.

Studio di associazione sull'intero genoma di varianti comuni

Come riportato in precedenza [17,18], il GWAS è stato condotto per partecipanti GCKD con genotipizzazione completa (Omni2.5), eGFR, UACR e misurazione log2(OPN) (N=4,897) dati utilizzando la regressione lineare di log2 (OPN) su SNP (modello genetico additivo) con un MAF �1%, aggiustato per età, sesso, log (eGFR) e log (UACR) (S1 Fig). L'analisi di associazione è stata eseguita utilizzando SNPTEST v2.5 [89]. Le statistiche riassuntive sono state controllate per la qualità utilizzando GWAtoolbox [90] e per l'inflazione utilizzando il controllo genomico [91]. Non è stata tuttavia richiesta una correzione del controllo genomico (λ=1.01). Associazioni con un valore p<5.0E-08 were considered significant. Per chromosome, an index SNP was defined as the SNP with the lowest genome-wide p-value with a 1-Mb interval centered around this SNP. This approach was repeated until no further SNP outside the interval(s) was available passing the genome-wide significance threshold. In order to discover further independent signals, we repeated GWAS analysis for chromosomes with significant results by conditioning on the genotype of the SNP with the lowest association pvalue of the respective chromosome. This procedure was repeated until no further genomewide signal was observed.

L'annotazione funzionale delle varianti è stata condotta utilizzando ANNOVAR[92], SNiPA [93], Open Targets Genetics [94], FAVOR [95] e RegulomeDB [96]. I grafici delle associazioni regionali sono stati tracciati utilizzando LocusZoom v1.3 [97].

Mappatura fine

Statistical fine-mapping [21] was carried out as previously described [17] for the two replicated SNPs within a region ±500kb. Approximate Bayes factors (ABFs) were then derived from the original GWAS statistics estimates. The SD prior was chosen as 0.61 because 95% of the effect size estimates fell within the −1.2 to 1.2 interval [21]. The ABF of the SNPs were used to calculate the posterior probability for each variant driving the association signal (PPA, 'causal variant'). Credible sets were determined by summing up PPA-ranked variants until the cumulative PPA was >99%.

Analisi di colocalizzazione

Al fine di comprendere ulteriormente i meccanismi molecolari e i fenotipi associati alla base delle associazioni, abbiamo eseguito analisi di colocalizzazione delle statistiche riassuntive OPN GWAS relative ai due loci OPN replicati con statistiche riassuntive GWAS da altre tre fonti come descritto di seguito. Per tutte le analisi di colocalizzazione, abbiamo utilizzato la funzione 'coloc.fast' del pacchetto R gtx con parametri predefiniti e definizioni precedenti (https://github.com/tobyjohnson/gtx), un'implementazione di una versione adattata del metodo di colocalizzazione introdotto di Giambartolomei et al. [98]. Consideriamo una colocalizzazione positiva quando la probabilità a posteriori di una variante causale condivisa nel locus di associazione per entrambi i tratti (H4, p12) era > 0.8.

Espressione genica.

Innanzitutto, abbiamo utilizzato le statistiche riassuntive GWAS dei dati sull'espressione genica del progetto GTEx [99] e dello studio NEPTUNE [100]. I dati eQTL del GTEx V8 (49 tessuti) e dello studio NEPTUNE (NephQTL da glomerulo e porzioni renali tubulointerstiziali) sono stati scaricati dal portale GTEx (https://www.gtexportal.org/home/) e dal sito web NephQTL (http ://nephqtl.org/), rispettivamente. Le fasi di analisi della colocalizzazione sono state descritte in dettaglio altrove [17]. Innanzitutto, sono stati estratti i riepiloghi GWAS di GTEx e NephQTL nelle regioni genomiche ± 100kb dei due SNP OPN. Vengono identificati i geni nel GWAS estratto e per ciascun gene viene definita una finestra cis di 500kb che fiancheggia l'inizio e la fine del gene. Quindi, per ciascuna di queste finestre genetiche cis, con almeno un SNP avente un valore p di associazione <0,001, i riepiloghi GWAS del tessuto GTEx e NephQTL nonché l'OPN GWAS sono stati estratti e utilizzati come input per l'analisi di colocalizzazione.