Lo studio dell'associazione sull'intero genoma identifica nuovi loci per la malattia renale allo stadio terminale attribuita al diabete di tipo 2 negli afroamericani
Mar 04, 2022
Meiji Guan1,2, Jacob M. Keaton1,2, Latchezar Dimitrov1,2, Pamela J. Hicks1,2, Jianzhao Xu1,2, Nicholette D. Palmer1,2,3, Lijun Ma4, Swapan K. Das5, Yii-Der I Chen6, Josef Coresh7, Myriam Fornage8, Nora Franceschini9, Holly Kramer10,11, Carl D. Langefeld12,13, Josyf C. Mychaleckyj14, Rulan S. Parekh15, Wendy S. Post7, Laura J. Rasmussen-Torvik16, Stephen S. Rich14 , Jerome I. Rotter6,17, John R. Sedor18,19, Denyse Thornley-Brown20, Adrienne Tin7, James G. Wilson21, Barry I. Freedman4, Donald W. Bowden1,2,3, Maggie CY Ng1,2,3* e il Consorzio TROVA
Astratto
Sfondo: fase finalerenepatologia(ESKD) è una significativa preoccupazione per la salute pubblica che colpisce in modo sproporzionato gli afroamericani (AA). Il diabete di tipo 2 (T2D) è la principale causa di ESKD negli Stati Uniti e gli sforzi per scoprire la suscettibilità genetica alla malattia renale diabetica (DKD) hanno avuto scarso successo. Un precedente studio di associazione dell'intero genoma (GWAS) negli AA con T2D-ESKD è stato ampliato con ulteriori casi e controlli di AA e genotipi imputati al pannello di riferimento di 1000 genomi a densità più elevata. L'analisi della scoperta includeva 3432 casi di T2D-ESKD e 6977 controlli non diabetici non nefropatici (N = 10,409), seguita da un'analisi della discriminazione in 2756 controlli non nefropatici T2D per escludere varianti associate a T2D.
Risultati:Sei varianti indipendenti situate dentro o vicinoRND3/RBM43, SLITRK3, ENPP7, GNG7, eAPOL1raggiunto un'associazione significativa a livello di genoma (P <5×>−8) con T2D-ESKD. A seguito di analisi di estensione nel 1910non diabeticoCasi di ESKD e 908 controlli non diabetici non nefropatici, una meta-analisi di 5342 casi AA di ESKD per tutte le cause e 6977 controlli AA non diabetici non nefropatici ha rivelato un nuovo locus ESKD per tutte le cause aEFNB2(rs77113398;P = 9.84 × 10–9; O=1.94). L'esclusione diAPOL1i portatori del genotipo a rischio renale hanno identificato due ulteriori loci associati a T2D-ESKD significativi a livello del genoma aGRAMMA3eMGAT4C. Una seconda variante aGNG7(rs373971520;P = 2.17 × 10–8, O=1.46) è rimasto associato a ESKD per tutte le cause nelAPOL1-analisi negativa.
Conclusioni:I risultati forniscono ulteriori prove per i fattori genetici associati alla malattia renale avanzata negli AA con T2D.
Parole chiave:Afroamericani, studio di associazione sull'intero genoma, diabete di tipo 2, malattia renale diabetica,Malattia renale allo stadio terminale
Per maggiori informazioni si prega di contattare:emily.li@wecistanche.com
introduzione
Prove crescenti suggeriscono che i fattori genetici svolgono un ruolo importante nella suscettibilità allo stadio terminalerenepatologia(ESKD). Ciò è particolarmente rilevante negli afroamericani (AA) dove i tassi di incidenza dell'ESKD sono più di tre volte maggiori rispetto agli europei americani (EA) [1]. I tassi di mortalità per i pazienti con ESKD, dialisi e trapianto sono rispettivamente di 136, 166 e 30 per 1000 anni-paziente e rappresentano il 7,2% dei costi dei sinistri pagati da Medicare [1]. Il diabete, di cui il 95% dei pazienti ha il diabete di tipo 2 (T2D), rimane la principale causa segnalata di ESKD negli Stati Uniti, rappresentando > 44% dei casi [1]. I miglioramenti nel controllo glicemico, lipidico e della pressione sanguigna non hanno ridotto notevolmente la prevalenza del diabeterenepatologia(DKD) [1, 2]. Inoltre, l'aggregazione familiare di DKD è indipendente dallo stato socioeconomico e dai fattori di rischio ambientale stabiliti [3, 4]. Sebbene gli alleli G1 e G2 nel gene dell'apolipoproteina L1 (APOL1) contribuiscano al 50-70% dell'ESKD non diabetico negli AA, non spiegano completamente l'eccesso di rischio di ESKD attribuita al T2D (T2D-ESKD) in questa popolazione. 5–7].
Gli studi di associazione sull'intero genoma (GWAS) hanno identificato > 70 varianti significative sull'intero genoma associate arenepatologia(CKD), albuminuria o funzione renale nelle popolazioni di discendenza europea [8-11]. Tuttavia, pochi loci sono stati associati a DKD in diverse popolazioni e non si replicano in modo coerente, in parte a causa delle limitate dimensioni del campione [12-18]. L'eziologia delle complicanze renali nei pazienti con T2D è probabilmente più eterogenea rispetto ai pazienti con diabete di tipo 1 [16]. Pertanto, per migliorare la potenza statistica sono necessari un'attenta fenotipizzazione e dimensioni del campione più grandi. Per esplorare l'architettura genetica della malattia renale avanzata nel T2D, abbiamo esteso i nostri precedenti sforzi GWAS (2890 pazienti con ESKD e 1719 controlli non diabetici non nefropatici) a un campione più ampio di AA con graverenepatologia. Le analisi di associazione sono state eseguite in sei coorti indipendenti di AA (Wake Forest School of Medicine, WFSM; Family Investigation of Nephropathy and Diabetes, FIND; Atherosclerosis Risk in Communities Study, ARIC; Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis, MESA; Jackson Heart Study, JHS; e sviluppo del rischio di arteria coronarica nei giovani adulti, CARDIA) per T2D-ESKD o ESKD non diabetico attraverso un disegno di studio a più stadi (Fig. 1). Ciò comprendeva 15.075 AA classificati in quattro gruppi fenotipici: casi di T2D-ESKD (N=3432), controlli non diabetici non nefropatici (N=6977), controlli nefropatici privi di T2D (N {{16} }) e casi di ESKD non diabetici (N=1910).
Nella fase di scoperta, GWAS è stato eseguito in 3432 casi di T2D-ESKD e 6977 controlli non diabetici non nefropatici, seguito da un'analisi di discriminazione per escludere loci associati al T2D in 2756 controlli non nefropatici T2D. Le analisi di estensione sono state eseguite in 1910 AA con ESKD non diabetici e 908 controlli non nefropatici per valutare il contributo dei loci associati a T2D-ESKD ai non diabeticirenepatologia. Una meta-analisi di casi di ESKD diabetici e non diabetici ha valutato le associazioni genetiche nell'ESKD per tutte le cause. APOL1-forme associate di non diabeticirenepatologiae T2D spesso coesistono nei pazienti. In quanto tale, molti pazienti diabetici conrenepatologiapotrebbe essere classificato erroneamente come dotato di DKD, poiché diagnosticorenele biopsie di solito non vengono eseguite. Qui, è stata eseguita una seconda analisi GWAS che escludeva gli individui con genotipi a rischio renale APOL1 per ridurre al minimo l'errata classificazione di T2D-ESKD.
Risultati
Panoramica dello studio
Questo studio ha una potenza > 80 percento per rilevare varianti comuni (MAF maggiore o uguale a 0,10) con effetto moderato (OR maggiore o uguale a 1,3) a un livello di significatività di 5 × 10-8 (http: //csg.sph.umich.edu/abecasis/ gatti/). In tutto, sette loci significativi a livello del genoma (P<5× 10−8="" )="" associated="" with="" t2d-eskd="" were="" identified="" in="" either="" the="" baseline="" model="" (rnd3/rbm43,="" slitrk3,="" enpp7,="" gng7,="" and="" apol1)="" or="" apol1-negative="" model="" (enpp7,="" gramd3,="" and="" mgat4c).="" in="" addition="" to="" apol1,="" two="" loci,="" efnb2="" and="" gng7,="" also="" reached="" genome-wide="" significance="" in="" the="" all-cause="" eskd="" meta-analysis="" under="" either="" the="" baseline="" or="" apol1-negative="">
Caratteristiche cliniche dei partecipanti allo studio
Le tabelle 1 e 2 includono caratteristiche dettagliate dei partecipanti allo studio. I casi di ESKD sono stati reclutati dagli studi WFSM (Affy6.{3}}, Axiom e MEGA), FIND e ARIC. Gli individui con T2D-ESKD o nefropatia priva di T2D erano più anziani (o di età simile) rispetto ai controlli non diabetici non nefropatici al momento del reclutamento. Tuttavia, l'età media alla diagnosi di T2D nei casi di T2D-ESKD e nei controlli di nefropatia privi di T2D era più giovane dei controlli non diabetici non nefropatici al momento del reclutamento. Tutti i controlli T2D non relativi alla nefropatia ei controlli non diabetici non relativi alla nefropatia avevano eGFR normale maggiore o uguale a 60 ml/min/1,73 m2. Inoltre, i controlli non diabetici non nefropatici avevano livelli di glucosio a digiuno < 126="" mg/dl.="" i="" controlli="" con="" nefropatia="" priva="" di="" t2d="" erano="" più="" obesi="" rispetto="" a="" t2d-eskd="" o="" casi="" di="" eskd="" non="" diabetici="" e="" controlli="" non="" diabetici,="" non="" nefropatici,="" ad="" eccezione="" dei="" casi="" di="" t2d-eskd="" in="" aric,="" erano="" più="" obesi="" rispetto="" agli="" altri="">
Analisi dell'associazione T2D-ESKD stadio 1 e stadio 2
Nella scoperta della fase 1, GWAS è stato condotto separatamente in tre set di dati: (1) 1513 casi di T2D-ESKD e 5299 controlli non diabetici non nefropatici genotipizzati su Affy6.0, contributo di WFSM, FIND, ARIC, JHS, MESA e CARDIA (fase 1a); (2) 1700 casi di T2D-ESKD e 770 controlli non diabetici non nefropatici da WFSM genotipizzati con array di genotipizzazione Axiom Biobank (stadio 1b); e (3) 219 casi di T2D-ESKD e 908 controlli non diabetici, non nefropatici da WFSM genotipizzati su MEGA (stadio 1c). È stata eseguita una meta-analisi (stadio 2) per combinare i risultati dell'associazione per 3432 casi di T2D-ESKD e 6977 controlli non diabetici e non nefropatici degli stadi 1a, 1b e 1c. È stato osservato un fattore di inflazione λ di 1,013 dopo la correzione per il controllo genomico (file aggiuntivo 1: figura S1), suggerendo che la struttura della popolazione e la correlazione criptica erano sufficientemente aggiustate. Tra le varianti che dimostrano associazioni suggestive (P < 1="" ×="" 10-5),="" 59="" varianti="" con="" i2="" maggiore="" o="" uguale="" all'80="" percento="" sono="" state="" escluse="" a="" causa="" dell'elevata="" eterogeneità="" nelle="" dimensioni="" degli="" effetti="" tra="" gli="" studi.="" un="" totale="" di="" 478="" varianti="" rimanenti="" sono="" state="" valutate="" in="" un'analisi="" della="" discriminazione="" (81="" di="" loro="" hanno="" raggiunto="" una="" significatività="" a="" livello="" del="" genoma;="" file="" aggiuntivo="" 1:="" tabella="">
Analisi della discriminazione della fase 3
Per determinare se le associazioni T2D-ESKD identificate nella meta-analisi di stadio 1 fossero guidate dall'associazione con il T2D di per sé, è stata eseguita un'analisi di discriminazione per il contrasto T2D di 2756 AA con nefropatia priva di T2D con 6977 controlli non diabetici non nefropatici dalla fase 1 (Affy6.0, Axiom, MEGA; file aggiuntivo 1: tabella S3). Successivamente abbiamo escluso 174 delle 478 varianti associate a T2D-ESK D nominalmente associate a T2D in assenza di nefropatia. Tra le restanti associazioni T2D-ESKD, le varianti principali che rappresentano 6 associazioni indipendenti hanno raggiunto un significato a livello di genoma (Tabella 3, Fig. 2a). L'associazione più forte è stata osservata per rs9622363 situato in APOL1 (P=1.42 × 10-10, OR=0.77, EAF=0.45). Questa variante era in disequilibrio di legame moderato (r2=0.33 e 0.34, rispettivamente in YRI) con gli alleli APOL1 G1 (rs60910145, rs73885319) associati a ESKD non diabetico [6]. La seconda associazione più forte era a rs58627064, una variante intergenica situata vicino a SLITRK3, (P=6.81 × 10−10, OR=1.62, EAF=0.06). Due segnali indipendenti, rs142563193 (P=1.24 × 10−8 , OR=0.74, EAF=0.23) e rs142671759 (P=5.53 × 10 −9, OR=2.26, EAF=0.02) sul cromosoma 17 situato vicino a ENPP7, rispettivamente, erano anche significativi a livello di genoma. Inoltre, due associazioni con T2D-ESKD, rs4807299 (P=3.21 × 10−8 , OR=1.67, EAF=0.05) situate in GNG7 e rs72858591 (P Sono stati identificati=4.54 × 10−8, OR=1.43, EAF=0.10) situati in RND3/RBM43 (Fig. 1a).
Analisi dell'ESKD non diabetica di stadio 4 e meta-analisi di ESKD per tutte le cause di stadio 5
Dopo la fase di discriminazione, 304 varianti che mostravano un'associazione suggestiva con T2D-ESKD (P < 1="" ×="" 10-5)="" sono="" state="" testate="" in="" 1910="" casi="" di="" eskd="" non="" diabetici="" indipendenti="" e="" 908="" controlli="" dallo="" stadio="" 1c.="" l'obiettivo="" dell'analisi="" della="" fase="" 4="" era="" valutare="" il="" contributo="" dei="" loci="" associati="" a="" t2d-eskd="" ai="" non="">renepatologia. Dopo aver escluso le varianti con eterogeneità I2 maggiore o uguale all'80 percento, 25 varianti erano nominalmente associate a ESKD non diabetica (P <0,05). forti="" associazioni="" (1,27="" ×="" 10-29="">< p="">< 8.86="" ×="" 10-15)="" sono="" state="" osservate="" nella="" regione="" apol1-myh9,="" a="" conferma="" del="" loro="" ruolo="" nei="" pazienti="" non="">rene patologia. È stata condotta una meta-analisi ESKD per tutte le cause, inclusi 5342 ESKD per tutte le cause e 6977 controlli non diabetici non nefropatici, per valutare la generalizzabilità delle 25 varianti associate a T2D-ESKD con forme più ampie di ESKD (stadio 5). Trentacinque varianti significative a livello di genoma in due loci sono risultate associate a ESKD per tutte le cause, comprese 15 varianti all'interno o vicino a EFNB2 e 20 varianti a APOL1 (Fig. 1b). L'associazione principale in APOL1 era rs9622363 (P=1.96 × 10−25, OR=0.68, EAF=0.43) e il segnale superiore vicino a EFNB2 era rs77113398 (P=9.84 × 10−9, OR=1.94, EAF=0.023) (Tabella 4, Fig. 2b). Quattro ulteriori loci indipendenti hanno dimostrato un'associazione suggestiva (P <5 ×="" 10-6)="" con="" eskd="" per="" tutte="" le="" cause="" a="" lpp,="" fstl5,="" oprk1/atpv1h="" e="" sybu/kcnv1="" (tabella="" 4,="" fig.="">
Analisi di associazione esclusi i portatori del genotipo a rischio renale APOL1
È stata eseguita un'analisi secondaria escludendo i portatori del genotipo a rischio renale APOL1 nei casi di T2D-ESKD e i controlli non diabetici non nefropatici (modello negativo APOL1-) per arricchire l'ESKD associato a T2D. Il modello di base ha mostrato una forte associazione di APOL1 e MYH9 con T2D-ESKD (Tabella 3, Fig. 1a) suggerendo che alcuni casi potrebbero essere stati classificati erroneamente e più probabilmente avevano ESKD non diabetico. Un totale di 664 casi di T2D-ESKD e 918 controlli non diabetici non nefropatici sono stati esclusi dall'analisi di stadio 1, lasciando 2768 casi di T2D-ESKD e 6059 controlli nel modello APOL1-negativo. Le associazioni nominali con T2D-ESKD (P < 1="" ×="" 10-5)="" sono="" state="" osservate="" con="" 522="" varianti="" (66="" delle="" quali="" hanno="" raggiunto="" un="" significato="" a="" livello="" del="" genoma;="" file="" aggiuntivo="" 1:="" tabella="" s2)="" e="" queste="" sono="" state="" selezionate="" per="" l'analisi="" della="" discriminazione="" della="" fase="" 3.="" sono="" state="" rimosse="" duecentoventitré="" varianti="" che="" avevano="" evidenza="" di="" associazione="" con="" t2d="" di="" per="" sé="" (file="" aggiuntivo="" 1:="" tabella="" s4)="" e="" 24="" varianti="" che="" mostravano="" una="" forte="" eterogeneità="" (i2="" maggiore="" o="" uguale="" a="" 80)="" nella="" meta-analisi.="" tra="" le="" varianti="" significative="" a="" livello="" del="" genoma="" identificate="" nel="" modello="" di="" base,="" rs142671759="" in="" enpp7="" (p="4.10" ×="" 10-8,="" or="2.30," eaf="0.024)" ha="" mostrato="" un="" associazione="" coerente="" con="" t2d-eskd="" nel="" modello="" negativo="" apol1-.="" due="" varianti="" aggiuntive="" hanno="" raggiunto="" la="" significatività="" dell'intero="" genoma,="" rs75029938="" in="" gramd3="" (p="2.02" ×="" 10–9,="" or="1.89," eaf="0.042)" e="" rs17577888="" nella="" regione="" mgat4c="" (p="3.87" ×="" 10-8,="" or="0.67," eaf="0.087)" (tabella="" 5,="" fig.="">
Abbiamo ulteriormente testato 275 associazioni suggestive di T2D-ESKD che hanno superato la discriminazione e avevano I2 < 80="" in="" 1019="" casi="" aggiuntivi="" di="" eskd="" non="" diabetici="" aa="" che="" escludevano="" i="" portatori="" del="" genotipo="" a="" rischio="" renale="" apol1.="" quindici="" varianti="" hanno="" mostrato="" evidenza="" nominale="" di="" associazione="" con="" eskd="" non="" diabetico.="" questi="" sono="" stati="" successivamente="" testati="" in="" una="" meta-analisi="" eskd="" per="" tutte="" le="" cause,="" inclusi="" 3787="" casi="" di="" eskd="" per="" tutte="" le="" cause="" e="" 6059="" controlli="" non="" diabetici="" non="" nefropatici="" di="" cui="" sono="" stati="" esclusi="" i="" portatori="" del="" genotipo="" a="" rischio="" renale="" apol1.="" una="" 2-eliminazione="" della="" coppia="" di="" basi="" in="" gng7,="" rs373971520="" (p="2.17" ×="" 10-8,="" or="1.46," eaf="0.11)," ottenuta="" a="" livello="" di="" genoma="" associazione="" significativa="" con="" eskd="" per="" tutte="" le="" cause="" (fig.="" 3b).="" sette="" loci="" aggiuntivi="" mostravano="" un'associazione="" nominale="" con="" eskd="" per="" tutte="" le="" cause="" (p="">< 5="" ×="" 10-6="" ),="" inclusi="" lpp,="" alk/ypel5,="" mnx1-as1/ube3c,="" nup98,="" linc01075/linc00448,="" tmco5a="" e="" sulf2/linc01522="" (tabella="" 6).="" le="" principali="" associazioni="" del="" modello="" di="" base="" avevano="" una="" moderata="" insignificanza="" dell'attenuazione,="" nonostante="" le="" dimensioni="" degli="" effetti="" simili,="" in="" parte="" a="" causa="" della="" ridotta="" dimensione="" del="" campione="" (file="" aggiuntivo="" 1:="" tabella="" s5).="" inoltre,="" è="" stato="" eseguito="" un="" terzo="" gwas="" con="" apol1="" incluso="" come="" covariata="" nel="" modello="" (modello="" apo="" l1-aggiustato)="" e="" confrontando="" i="" valori="" -log="" (p)="" con="" i="" modelli="" di="" base="" e="" apol1-negativi.="" è="" stata="" osservata="" un'elevata="" correlazione="" (coefficiente="" di="" correlazione="" della="" persona="" r="0.95)" tra="" i="" modelli="" apol{57}}aggiustati="" e="" apol{58}}="" negativi.="" i="" risultati="" di="" tutti="" e="" tre="" i="" confronti="" sono="" inclusi="" nella="" documentazione="" supplementare="" (file="" aggiuntivo="" 1:="" figura="">
Discussione
Riportiamo i risultati di un GWAS ad alta densità che studia la suscettibilità genetica al T2D-ESKD in 15.075 AA. Le principali varianti associate a T2D-ESKD sono state successivamente valutate per l'associazione con ESKD non diabetico ed è stata eseguita una meta-analisi per testare la loro generalizzabilità a forme comuni di ESKD. Otto associazioni indipendenti in sette loci genetici hanno mostrato un'associazione significativa a livello del genoma con T2D-ESKD nei modelli di base o APOL1-negativi, inclusi RND 3/RBM43, SLITRK3, ENPP7, GNG7, APOL1, GRAMD3 e MGAT4C. Oltre all'APOL1, due loci significativi a livello del genoma erano associati a ESKD, EFNB2 e GNG7 per tutte le cause. Inoltre, 10 loci genetici hanno dimostrato un'associazione nominale con ESKD per tutte le cause (P < 5="" ×="" 10-6="" ),="" inclusi="" lpp,="" fstl5,="" oprk1/atp6v1h,="" sybu/kcnv1,="" alk/ypel5,="" mnx1-as1/ube3c,="" nup="" 98,="" linc01075/linc00448,="" tmco5a="" e="" sulf2/lin="">
L'associazione più significativa tra T2D-ESKD (OR=0.77, P=1.42 × 10-10) e ESKD per tutte le cause (OR=0.69, P {{11 }}.96 × 10-25) nel modello di base era una variante intronica rs9622363 nella regione APOL1 associata a non diabeticirene patologianegli individui di origine africana. Il condizionamento sugli alleli APOL1 G1 e G2 ne diminuisce drasticamente il significato [6]. rs9622363 è segnalato per alterare i motivi vincolanti del fattore di trascrizione (TF) (file aggiuntivo 1: tabella S6). In uno studio recente, gli alleli rs9622363 e APOL1 G1 hanno formato un aplotipo che ha ottenuto la più forte associazione con CKD nei nigeriani [19]. A differenza di G1 o G2, l'allele maggiore in rs9622363 (G, EAF=0.57) è associato al rischio di CKD. Dopo aver escluso i portatori del genotipo a rischio renale APOL1, l'associazione con rs9622363 è stata attenuata. Ciò ha confermato che rs9622363 e gli alleli APOL1 G1 e G2 contribuiscono allo stesso segnale. L'identificazione di rs9622363 nel modello di base può suggerire un'errata classificazione di alcuni casi come T2D-ESKD.
Una variante intergenica (rs72858591) situata tra un gene della proteina GTPase RND3 e RBM43, che codifica per la proteina 43 del motivo di legame dell'RNA, ha rivelato un'associazione significativa a livello di genoma con T2D-ESKD. È associato ai cambiamenti del motivo del legame TF e si sovrappone sia alle regioni del promotore che a quelle del potenziatore (file aggiuntivo 1: tabella S6). Una variante intergenica indipendente (rs7560163, r2=0.01, YRI) in questa regione era precedentemente associata al T2D negli AA [20]. Al contrario, rs72858591 non era associato a T2D (P=0.073) nel presente studio. Ciò potrebbe suggerire che due diversi insiemi di variazioni in questo locus contribuiscono indipendentemente al T2D e al T2D-ESKD, un possibile effetto pleiotropico. Due varianti indipendenti (rs142563193 e rs142671759) che erano a livello del genoma significativamente associate a T2D-ESKD si trovano vicino a ENPP7. Queste varianti si sovrappongono a regioni potenziatore e promotore, picchi ipersensibili alla DNasi e/o motivi di legame TF (file aggiuntivo 1: tabella S6). La proteina codificata da ENPP7 è una sfingomielina fosfodiesterasi alcalina intestinale che converte la sfingomielina in ceramide e fosfocolina. Secondo quanto riferito, ENPP7 influisce sull'assorbimento del colesterolo [21] e numerosi studi suggeriscono che i livelli di colesterolo lipoproteico ad alta densità sono fattori di rischio per CKD nei pazienti con diabete [22-24].
Due varianti localizzate in GNG7 erano associate a T2D-ESKD (rs4807299; P=3.21 × 10−8 , modello di base) o ESKD per tutte le cause (rs373971520; P=2.17 × 10− 8; APOL1-modello negativo). Rs4807299 è associato a modifiche del motivo di legame TF e sovrapposizioni con le regioni del promotore e del potenziatore (file aggiuntivo 1: tabella S6). GNG7 codifica per la subunità proteica G Gamma 7, coinvolta nella funzione del sistema nervoso centrale [25] e nel rischio di cancro [26, 27].
Poiché gli afroamericani con diabete e proteinuria spesso non ottengono una biopsia renale diagnostica, si presume in genere che la loro ESKD sia stata causata da DKD. Tuttavia, APOL1-associato non diabeticorenepatologiapuò essere la vera causa di malattie renali in molti di questi pazienti. Le analisi che hanno escluso i portatori del genotipo a rischio renale APOL1 hanno creato un gruppo di casi più omogeneo e hanno fornito l'opportunità di scoprire l'architettura genetica del T2D-ESKD che è indipendente dall'effetto APOL1. Nel modello negativo APOL1-, oltre a replicare ENPP7 identificato nel modello di base, due nuovi loci
raggiunto un'associazione significativa a livello di genoma con T2D ESKD: GRAMD3 (rs75029938; P=2.02 × 10-9) e MGA T4C (rs17577888; P=3.87 × 10-8). L'annotazione funzionale ha suggerito che entrambe le varianti si trovano insieme a motivi di rilegatura TF. Rs75029938 può rientrare nelle regioni del potenziatore e del promotore e rs17577888 era associato all'abbondanza di trascrizione del gene FLVCR1 nei monociti del sangue periferico (P=6.41 × 10-6; File aggiuntivo 1: Tabella S6). La variazione genetica in GRAMD3 è stata associata all'adiposità in una meta-analisi multietnica dell'intero genoma [28]. Precedenti studi suggeriscono che l'obesità è un importante fattore di rischio per DKD [29]. MGAT4C codifica per mannosil (alfa-1,3-)-glicoproteina beta-1,4-N-acetilglucosaminiltransferasi, isozima C, che partecipa al trasferimento di N-acetilglucosamina (GlcNAc) ai residui centrali di mannosio di glicani N-linked. Il potenziale coinvolgimento di MGAT4C in DKD richiede ulteriori studi.
Questa analisi includeva una coorte di AA con ESKD non diabetica per valutare la generalizzabilità dei loci associati a T2D-ESKD in forme comuni di CKD. La meta-analisi che combina casi con T2D-ESKD ed ESKD non diabetica ha identificato due nuovi loci significativi a livello del genoma associati a ESKD per tutte le cause oltre a APOL1; rs77113398 vicino a EFNB2 (P=9.84 × 10-9; modello di base) e rs373971520 in GNG7 (2.17 × 10-8; APOL1-modello negativo). Rs77113398 si sovrappone al potenziatore, alle regioni del promotore e ai picchi della DNasi (file aggiuntivo 1: tabella S6). Le precedenti scansioni del genoma negli AA hanno identificato prove significative per il collegamento all'ESKD sul cromosoma 13q33 inclusa la regione EFNB2 sia nell'ESKD diabetico che nell'ESKD non diabetico [30, 31]. Uno studio di follow-up ha esaminato 28 varianti di tagging che coprono 39 kilobasi (kb) della regione di codifica EFNB2 ha dimostrato associazioni nominali tra due varianti e ESKD per tutte le cause [32]. Tuttavia, queste varianti segnalate non erano correlate con rs77113398. L'efrina-B2 (EFNB2) è espressa nel nefrone in via di sviluppo; le interazioni tra l'efrina-B2 ei suoi recettori svolgono un ruolo importante nell'assemblaggio microvascolare glomerulare [33]. Inoltre, la segnalazione inversa dell'efrina-B2 protegge dalla rarefazione capillare peritubulare regolando l'angiogenesi e la stabilità vascolare duranterenelesione[34]. L'efrina-B1 si co-localizza anche con la proteina associata a CD2- (CD2AP) e la nefrina sul diaframma a fessura del podocita e svolge un ruolo importante nel mantenimento della funzione di barriera a livello del diaframma a fessura [35]. I topi transgenici del recettore dell'efrina B4 chinasi sviluppano glomerulopatia, manifestata da arteriole afferenti ed efferenti fuse che bypassano i glomeruli [36]. Pertanto, più linee di evidenza supportano la potenziale associazione EFNB2 con CKD ed è il gene causale più promettente alla base dell'associazione rs77113398.
Questo studio ha punti di forza e limiti. Sebbene il disegno dello studio a più stadi fosse ben potenziato, inclusi 15.075 AA, mancava la replicazione delle associazioni T2D-ESKD, in particolare per le varianti rare. Inoltre, diversi segnali significativi a livello del genoma hanno mostrato dimensioni dell'effetto significativamente diverse tra gli stadi, il che era probabilmente attribuibile alle differenze di dimensione del campione tra gli stadi e una conseguenza della "maledizione del vincitore", un fenomeno che descrive che la dimensione dell'effetto genetico reale è sovrastimata a causa di il primo riscontro positivo. È necessaria una replica futura per confermare questi risultati. Ci sono poche altre raccolte esistenti con campioni appropriati in AA; questo limitato sforzo di replica. Inoltre, è difficile escludere tutti gli individui classificati erroneamente con DKD a causa della frequente mancanza di biopsie renali. Pertanto, abbiamo accuratamente escluso i campioni con ESKD attribuiti a eziologie non diabetiche sulla base di fenotipi clinici e successivamente abbiamo escluso i portatori del genotipo a rischio renale APOL1 ad alto rischio di ESKD non diabetico. Questo dovrebbe ridurre al minimo l'errata classificazione.
Conclusione
In conclusione, è stato condotto un GWAS in AA con T2D-ESKD e sette loci genetici hanno mostrato prove di associazione significative a livello del genoma, tra cui RND3/RBM43, SLITRK3, ENPP7, GNG7, APOL1, GRAMD3 e MGAT4C. Oltre a APOL1, EFNB2 e GNG7 erano anche associati all'ESKD non diabetico e hanno rivelato un'associazione significativa a livello del genoma con l'ESKD per tutte le cause. Sono necessarie future indagini, tra cui la replicazione genetica e la convalida sperimentale di queste associazioni appena identificate, per valutare il loro potenziale impatto sui processi biologici che portano a una DKD avanzata nelle popolazioni di recente discendenza africana.
Metodi
Partecipanti allo studio
I partecipanti allo studio sono stati reclutati dalla Wake Forest School of Medicine (WFSM; N {0}}), Family Investigation of Nephropathy and Diabetes (FIND; N=926), Jack son Heart Study (JHS; N {{2} }}), Studio sul rischio di aterosclerosi nelle comunità (ARIC; N {3}}), Sviluppo del rischio di arteria coronarica nei giovani adulti (CARDIA; N=912) e Studio multietnico sull'aterosclerosi (MESA; N { {6}}). Le analisi sono state approvate dai comitati di revisione istituzionale locale e tutti i partecipanti hanno fornito il consenso informato scritto. Sono stati considerati casi di T2D-ESKD, inclusa una grave DKD, quando è stato diagnosticato diabete maggiore o uguale a 5 anni prima dell'insorgenza dell'ESKD o con retinopatia diabetica per garantire un'adeguata durata del T2D, con terapia sostitutiva renale, velocità di filtrazione glomerulare stimata ( eGFR) Inferiore o uguale a 30 ml/min/1,73 m2 (CKD4), o rapporto albumina urinaria/creatinina (UACR) Maggiore o uguale a 300 mg/g (macroalbuminuria). I partecipanti con CKD4 o macroalbuminuria (N=138) sono stati inclusi come casi dato il loro alto rischio di sviluppare ESKD. T2D è stato diagnosticato secondo i criteri dell'American Diabetes Association con una glicemia a digiuno maggiore o uguale a 126 mg/dl, 2-h orale glucosio test di tolleranza maggiore o uguale a 200 mg/dl, glucosio casuale maggiore o pari a 200 mg/dl, uso di farmaci per il diabete o diabete diagnosticato dal medico. I casi con ESKD non diabetica erano privi di diabete (o avevano T2D da < 5="" anni)="" all'inizio="" della="" terapia="" sostitutiva="" renale="" e="" l'eskd="" era="" attribuita="" a="" malattia="" glomerulare="" cronica="" (p.="" es.,="" glomerulosclerosi="" segmentaria="" focale),="" nefropatia="" associata="" all'hiv,="" ipertensione="" o="" sconosciuta="" causa.="" pazienti="" con="" eskd="" attribuita="" a="" cause="" chirurgiche="" o="" urologiche,="">malattie renali, malattie autoimmuni, epatite, nefropatia da IgA, glomerulonefrite membranosa, glomerulonefrite membranoproliferativa o monogenicarenemalattieerano esclusi. I controlli non diabetici non relativi alla nefropatia includevano partecipanti senza diabete orene patologia(eGFR maggiore o uguale a 60 ml/min/ 1,73 m2 e UACR < 30="" mg/g).="" i="" soggetti="" con="" nefropatia="" priva="" di="" t2d="" avevano="" egfr="" maggiore="" o="" uguale="" a="" 60="" ml/min/1,73="" m2="" e="" uacr="">< 30="">
Preparazione del campione, genotipizzazione, imputazione e controllo di qualità
I partecipanti allo studio sono stati genotipizzati a livello di genoma utilizzando tre diverse piattaforme: (1) 870 4 campioni reclutati da WFSM, ARIC, CARDIA, JHS, MESA e FIND sono stati genotipizzati sul polimorfismo a singolo nucleotide umano a livello di genoma Affymetrix (SNP) matrice 6.0 (Affy6.0); (2) 3133 campioni reclutati da WFSM sono stati genotipizzati su Affymetrix Axiom Biobank Genotyping Array (Axiom); e (3) 3238 campioni reclutati da WFSM sono stati genotipizzati sull'Illumina Multi-Ethnic Genotyping Array (MEGA). Il controllo di qualità e l'imputazione sono stati eseguiti separatamente da ciascuna piattaforma di genotipizzazione come descritto di seguito.
Le varianti che hanno superato il controllo di qualità (QC) sono state imputate a un pannello di riferimento dell'aplotipo combinato che include il pannello di riferimento cosmopolita di fase 3 1000 Genomi (versione di ottobre 2014) [37] e una versione del pannello di riferimento dell'African Genome Variation Project (AGVP) che include 640 Aplotipi di ascendenza africana gentilmente forniti dall'African Partnership forRicerca sulle malattie cronichee Wellcome Trust Sanger Institute [38]. La prefasatura è stata eseguita utilizzando SHAPEIT2 [39] e l'imputazione è stata eseguita utilizzando IMPUTE2 [40]. Il controllo qualità post-imputazione è stato condotto per escludere varianti con mancata corrispondenza degli alleli o con ampia discrepanza di frequenza ( maggiore o uguale a 0.2) con il pannello di riferimento (0.2 × frequenza in EUR più {{ 13}}.8 × frequenza in AFR) e punteggio delle informazioni sull'imputazione < 0,4.="" un="" sottoinsieme="" di="" campioni="" è="" stato="" genotipizzato="" direttamente="" per="" le="" varianti="" apol1="" g1="" e="" g2="" utilizzando="" sequenom="" (sequenom,="" san="" diego,="" ca).="" la="" concordanza="" era="" del="" 95%="" con="" i="" genotipi="">
Affy6.{1}} set di dati
Come descritto in precedenza [41], 1513 casi di T2D-ESKD, 5299 controlli non diabetici non nefropatici e 1892 controlli T2D non nefropatici delle coorti WFSM, FIND, JHS, ARIC, CARDIA e MESA sono stati genotipizzati utilizzando Affy6.{{ 11}} (Tabella 1). In ogni studio, sono state applicate misure QC standard per escludere varianti con tasso di chiamata < 95%="" ,="" frequenza="" allelica="" minore="" (maf)="">< 0.01="" o="" che="" mostravano="" una="" deviazione="" dall'equilibrio="" di="" hardy-weinberg="" (hwe)="" (p="">< 0,0001).="" il="" controllo="" qualità="" del="" campione="" è="" stato="" eseguito="" per="" escludere="" soggetti="" con="" tassi="" di="" chiamata="">< 95="" percento,="" contaminazione="" del="" dna,="" duplicati="" o="" valori="" anomali="" della="" popolazione.="" dato="" che="" cardia,="" jhs="" e="" mesa="" mancavano="" di="" casi="" con="" t2d-eskd,="" i="" campioni="" di="" questi="" studi="" sono="" stati="" combinati="" per="" analisi="" di="" imputazione="" e="" associazione="" insieme="" a="" wfsm,="" find="" e="">
Set di dati Axiom
Al WFSM, 1700 casi AA con T2D-ESKD, 770 controlli AA senza diabete o nefropatia e 663 controlli AA con T2D privi di nefropatia sono stati genotipizzati su un array di genotipizzazione Axiom personalizzato (Tabella 2). In precedenza erano state riportate informazioni dettagliate sulle varianti, progettazione di contenuti personalizzati, inclusa la mappatura fine delle regioni candidate, metodi di genotipizzazione e QC [42]. In breve, questa matrice includeva circa 264.000 varianti di codifica e inserimenti/eliminazioni (indel), 70.000 varianti di perdita di funzione, 2.000 varianti farmacogenomiche, 23.000 marcatori eQTL, 246.000 marcatori di tag dell'intero genoma basati sulla popolazione multietnica e 115.000 personalizzati indicatori di contenuto. Sono state escluse le varianti con tassi di chiamata < 95="" percento,="" partenza="" da="" hwe="" (p="">< 0,0001)="" e="" varianti="" monomorfiche.="" un="" totale="" di="" 724.530="" varianti="" sono="" state="" richieste="" con="" successo="" per="" il="" controllo="" di="" qualità="" a="" valle,="" l'imputazione="" e="" le="" analisi.="" il="" controllo="" di="" qualità="" del="" campione="" è="" stato="" eseguito="" per="" escludere="" le="" persone="" con="" tassi="" di="" chiamata="" bassi="">< 95%),="" gender="" discordance,="" dna="" contamination,="" duplication,="" or="" population="">
MEGA set di dati
Al WFSM, 1910 casi di ESKD non diabetici, 219 casi di ESKD T2D, 201 controlli con T2D privi di nefropatia e 908 controlli non diabetici non nefropatici sono stati genotipizzati sull'array MEGA (Tabella 2). Questa matrice è stata progettata per migliorare la mappatura fine e la scoperta funzionale aumentando la copertura delle varianti tra più etnie. L'array include (1) contenuto backbone contenente varianti altamente informative per GWAS e analisi dell'esoma in popolazioni ancestralmente diverse e (2) contenuto personalizzato utilizzato per replicare o generalizzare le associazioni GWAS dell'indice, aumentare le varianti di tagging GWAS nelle regioni prioritarie, migliorare il contenuto dell'esoma nelle regioni prioritarie , mappa fine dei loci GWAS, identifica varianti regolatorie funzionali, esplora varianti clinicamente importanti e identifica nuovi loci varianti nei percorsi candidati [43]. La genotipizzazione è stata eseguita presso WFSM. Il DNA di casi e controlli è stato ugualmente interfogliato su 96-piastre a pozzetti per ridurre al minimo gli errori artefatti durante l'elaborazione del campione. Un totale di 48 campioni sequenziati nell'ambito del 1000 Genomes Project [44] presso il Coriell Institute for Medical Research sono stati inclusi nella genotipizzazione e avevano un tasso di concordanza del 98,57 percento. La chiamata del genotipo è stata eseguita utilizzando Genome Studio (Illumina, CA, USA). Sono state rimosse le varianti con posizione mancante, allele mancante, mancata corrispondenza degli alleli, tassi di chiamata < 95="" percento,="" deviazione="" da="" hwe="" (p="">< 0,0001),="" differenza="" di="" frequenza=""> 0,2 rispetto al pannello di riferimento di fase 3 del progetto Genome 1000 e varianti monomorfiche. Sono stati confrontati più set di sonde e solo quello con il tasso di chiamate più elevato è stato mantenuto. Un totale di 1.705.970 varianti sono state richieste con successo per il controllo di qualità a valle, l'imputazione e le analisi. Il controllo di qualità del campione è stato eseguito per escludere le persone con un basso tasso di chiamate (< 95%),="" gender="" discordance,="" dna="" contamination,="" duplication,="" or="" population="" outliers.="" dna="" swapping="" was="" identified="" and="">
analisi statistica
Fase di scoperta
Abbiamo utilizzato un disegno di studio a più stadi per identificare le varianti associate a T2D-ESKD e il loro potenziale ruolo nell'ESKD per tutte le cause. Nella fase di scoperta, sono stati inclusi 3432 casi di T2D-ESKD e 6977 controlli non diabetici non nefropatici da tutti e tre i set di dati (Fig. 1). L'analisi di associazione è stata eseguita per ciascun set di dati utilizzando un metodo logistico a modello misto implementato nel programma GMMAT [45] sotto un modello genetico additivo. Questo metodo controlla la struttura della popolazione e la correlazione criptica includendo una matrice di relazione genetica (GRM) stimata da un insieme di varianti autosomiche di alta qualità come effetto casuale. L'analisi dei componenti principali è stata eseguita utilizzando EIGENSOFT [46] per ciascuna piattaforma di genotipizzazione. Il primo autovettore (PC1) insieme all'età e al sesso è stato utilizzato come covariate. Una meta-analisi è stata eseguita nei tre set di dati utilizzando un metodo di ponderazione della varianza inversa a effetti fissi implementato in METAL [47]. Per l'analisi della discriminazione sono state selezionate associazioni suggestive per T2D-ESKD con P < 1="" ×="" 10-5="" ,="" conteggio="" degli="" alleli="" minori="" (mac)=""> 400 e eterogeneità I2 <>
Fase di discriminazione
Per determinare se i presunti loci associati a T2D-ESKD nella fase di scoperta fossero guidati da associazioni con T2D di per sé, una meta-analisi che combina 2756 AA con nefropatia priva di T2D e 6977 controlli non diabetici non nefropatici dai tre set di dati (Affy6 .0, Axiom e MEGA) è stato eseguito (fase 3, Fig. 1). Le varianti che mostravano un'associazione nominale (P <{15}}.05) con="" t2d="" sono="" state="" escluse="" per="" rimuovere="" le="" varianti="" associate="" a="">
Analisi di estensione dell'ESKD non diabetica e meta-analisi dell'ESKD per tutte le cause
Varianti genetiche che mostravano un'associazione suggestiva con T2D-ESKD (P < 1 × 10-5) ma non associate a T2D sono state esaminate in una coorte di ESKD non diabetica che includeva 1910 casi di ESKD non diabetici e 908 controlli non diabetici non nefropatici dal Set di dati WFSM-MEGA per l'associazione con eziologie non diabetiche dimalattie renali(fase 4). Le varianti che mostrano un'associazione nominale (P <0.05) sono="" state="" testate="" in="" una="" meta-analisi="" di="" eskd="" per="" tutte="" le="" cause="" utilizzando="" tutti="" i="" controlli="" t2d-eskd,="" eskd="" non="" diabetici="" e="" i="" tre="" set="" di="" dati="" (="" n="12,319," affy6.0,="" axiom,="" mega)="" (fig.="" 1).="" questa="" meta-analisi="" ha="" valutato="" se="" le="" associazioni="" t2d-eskd="" contribuissero="" al="" rischio="" di="" eskd="" per="" tutte="" le="" cause.="" abbiamo="" anche="" cercato="" le="" nostre="" principali="" varianti="" associate="" a="" malattie="" renali="" per="" la="" presunta="" associazione="" con="" t2d="" negli="" aa="" dal="" consorzio="" media="" (n="15.043" casi="" e="" 22.318="" controlli);="" snp="" con="" p=""><0,05 dopo="" la="" rimozione="" di="" più="" correzioni="" di="">
Esclusione dei portatori del genotipo a rischio APOL1
Gli alleli APOL1 G1 e G2 contribuiscono al rischio dimalattia renale non diabetica[6, 48]. Per ridurre al minimo l'errata classificazione di T2D-ESKD, è stata eseguita una seconda analisi escludendo i portatori APOL1 con due varianti di rischio renale e quelli con genotipi APOL1 mancanti da casi di T2D ESKD e controlli non diabetici non nefropatici (modello APOL1-negativo ). Questa analisi ha ridotto l'eterogeneità della popolazione nonostante la riduzione della dimensione del campione e il potere statistico inferiore. In particolare, 308 casi T2D-ESKD e 630 controlli dai set di dati Affy6.0, 323 casi T2D-ESKD e 113 controlli dal set di dati Axiom e 33 casi T2D-ESKD e 175 controlli dal set di dati MEGA sono stati rimossi. Inoltre, abbiamo rimosso 891 dei 1910 casi di ESKD per tutte le cause. Questa analisi può smascherare gli effetti di altri loci ESKD non diabetici oltre APOL1. Gli individui sono stati considerati portatori della variante di rischio renale APOL1 se portavano due alleli G1 (allele rs60910145 G, allele rs73885319 G), due alleli G2 (rs143830837, 6 paia di basi delezione in-frame) o erano eterozigoti composti (uno G1 e uno allele G2) [6].
Caratterizzazione funzionale
Sono stati selezionati proxy di varianti associate a T2D-ESKD significative a livello del genoma (r2 maggiore o uguale a 0.7 su 1000 genomi di popolazione AFR) dal basale e modelli APOL1-negativi sono stati selezionati utilizzando LDlink [49 ]. Le varianti principali e i proxy sono stati quindi interrogati per annotazioni funzionali da HaploReg [50], che includeva lo stato della cromatina e l'annotazione di legame proteico dai progetti Roadmap Epigenomics [51] e ENCODE [52], conservazione della sequenza tra mammiferi, effetto delle varianti sulla regolamentazione motivi ed espressione genica da studi QTL.
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