L'emodialisi aumenta lo stress ossidativo attraverso i radicali centrati sul carbonio nonostante una migliore biocompatibilità

Attivazione dei leucociti e risultatilo stress ossidativoindotto damateriali bioincompatibiliduranteimpatto dell’emodialisila prognosi dei pazienti. Nonostante i molteplici progressi indializzatori per emodialisi, ILprognosi dell’emodialisipazienti con complicazioni profondamente legate alo stress ossidativo, ad esempiodiabete la mellito rimane povera. Pertanto, abbiamo rivalutato gli effetti diemodialisisu più specie reattive dell'ossigeno che utilizzano metodi basati sulla risonanza di spin elettronico per un ulteriore miglioramento dibiocompatibilitàInemodialisi. Abbiamo arruolato 31 pazienti in condizioni stabili sottoposti a emodialisi utilizzando dializzatori a polisulfone ad alto flusso. Gli effetti dell'emodialisi sulle specie reattive dell'ossigeno sono stati valutati con due metodi: MULTiS, che valuta le attività di eliminazione del siero contro più specie reattive idrofile dell'ossigeno, e i-STrap, che rileva i radicali lipofili del centro del carbonio. Analogamente agli studi precedenti, abbiamo scoperto che l’attività di eliminazione dei radicali idrossilici nel siero è migliorata significativamente dopo l’emodialisi. A differenza degli studi precedenti, abbiamo scoperto che l’attività di scavenging contro i radicali alcossilici era significativamente ridotta dopoemodialisi. Inoltre, i pazienti con diabete mellito hanno mostrato una diminuzione dell’attività sierica di scavenging contro i radicali alchil perossilici e un aumento dei radicali lipofili del centro del carbonio dopo l’emodialisi. Questi risultati suggeriscono che, nonostante gli ampi miglioramenti nelle membrane dei dializzatori, le forme dispecie reattive dell'ossigenoche possono essere eliminati durante la dialisi sono limitati e molteplici specie reattive dell'ossigeno rimangono a livelli maggiori durante l'emodialisi.

Parole chiave:emodialisi, biocompatibilità, risonanza di spin elettronico del radicale alchilperossilico, MULTiS, i-STrap

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Malattia renale cronica(CKD) è noto per essere associato aelevato stress ossidativo. (-4)Accumulo di tossina uremicas con proprietà pro-ossidanti che portano amicroinfiammazionecausato dalaumento delle citochine proinfiammatoriesè la caratteristica fondamentale diFisiopatologia della malattia renale cronica. (s-, l'emodialisi (HD), una terapia sostitutiva renale ampiamente utilizzata, agisce come un'arma a doppio taglio per ridurre lo stress ossidativo nei pazienti con insufficienza renale cronica. Attivazione dei leucociti polimorfonucleati, dovuta al contatto con la membrana o altre superfici artificiali nei circuiti HD , è la causa principale dello stress ossidativo indotto dall'HD.s-) Al contrario, la rimozione delle tossine uremiche pro-ossidative, in particolare dei composti idrofili a basso peso molecolare come la trimetilammina-Nossido o i composti guanidinici, può migliorare la natura antiossidante dell'HD, portando ad un miglioramento a lungo termine del tasso di sopravvivenza e della qualità della vitapazienti con insufficienza renale cronica. (2,13) ​​Inoltre, la correzione dell'acidosi porta alla riattivazione degli enzimi antiossidanti e alla riduzione del sovraccarico di volume che porta alla prevenzione del cardio. le complicanze vascolari sono meccanismi antiossidanti. (4 Pertanto, è necessario che i materiali HD riducano al minimo l'attivazione dei leucociti e massimizzino gli effetti antiossidanti. Per superare questo problema sono stati sviluppati materiali HD antiossidanti e biocompatibili, esemplificati dal dializzatore rivestito di vitamina E. (si7) Tuttavia, nonostante i numerosi progressi nei dializzatori HD, la prognosi dei pazienti con MH rimane insoddisfacente, specialmente quelli con diabete mellito (DM), una malattia che promuove uno stato altamente ossidativo.(8) Queste preoccupazioni sono in parte dovute al fatto che i dettagli dei processi in vivo ampiamente vari e complessiReazioni legate allo stress ossidativonon sono stati sufficientemente analizzati. Pertanto, questo studio mirava a chiarire l'effetto dell'HD sulle dinamiche delle specie reattive dell'ossigeno (ROS), come gli eventi a monte delle reazioni allo stress ossidativo, sulla base del concetto che ciascun sito bersaglio delle reazioni ossidative e antiossidanti nel corpo deve essere descritto biochimicamente in un tempo e uno spazio specifici. Una spiegazione per questo è amancanza di analisi dettagliatedel lato a monte delle reazioni legate allo stress ossidativo che stimolano queste reazioni cellulari. L'identificazione dei ROS che agiscono come stimolatori delle reazioni di stress ossidativo o delle interazioni tra i ROS per generare stimolatori ossidativi è difficile a causa delle elevate velocità di reazione e delle complesse catene di reazioni. Poiché i ROS non sono uniformi e i singoli ROS hanno caratteristiche specifiche durante le reazioni in vivo, è necessaria un'analisi di più ROS. (9-2n Pertanto, per migliorare la biocompatibilità basata sull'uso di materiali antiossidanti e biocompatibili, è necessario comprendere i cambiamenti nella dinamica dei ROS causati dall'HD.

Per studiare la dinamica dei ROS durante l'HD, abbiamo impiegato due metodi basati sulla risonanza di spin elettronico (ESR) di nuova concezione. il test multiplo di eliminazione dei radicali liberi idrofili (MULTIS) e il test di rilevamento dei radicali lipofili su sangue intero (i-STrap) Sebbene la ricerca sull'attività di eliminazione dei ROS mediante ESR non sia estesa, rimane l'unico metodo disponibile per identificare il tipo ed esaminare la dinamica del ROS. Il metodo combina un sistema di flusso di tipo cromatografia liquida ad alte prestazioni con un sistema ESR e impiega 5-(2,2-dimetil-1.3-propossiciclofosforile)-5- metil-1-pirrolinaNossido (CYPMPO) come trappola di spin. MULTIS fornisce sensibilità e stabilità più elevate per la misurazione dell'eliminazione dei ROS rispetto ai test ESR convenzionali.22-24) Uno dei nostri coautori ha precedentemente riportato attività di eliminazione dei ROS misurate da MULTIS in pazienti con insufficienza renale cronica in stadio 5. Tuttavia, non hanno valutato l'effetto dell'HD.e2) Inoltre, il metodo i-STrap è un metodo basato sulla VES che rileva i ROS nel sangue intero utilizzando 2-difenilfosfinoil-2-metil-3,{ {20}}diidro-2H-pirrolo N-ossidoDPhPMPO)come trappola di spin e misura la VES dopo un'estrazione organica, riflettendo così i ROS lipofili.26. In questo studio, abbiamo scoperto che i livelli di diversi ROS erano aumentati e non eliminati dall’HD, indicando che le reazioni a catena dei radicali non sono ancora adeguatamente controllate dopo l’HD. Ciò potrebbe influire suprognosi dei pazienti con insufficienza renale cronica.

Materiali e metodi

Soggetti e consenso informato. Tutte le procedure condotte su soggetti umani sono state eseguite dopo aver ottenuto il consenso scritto individuale. Il protocollo utilizzato è stato approvato dal Comitato dell'Università di Tecnologia di Tsukuba (autorizzazione n. 201809). Questo è uno studio osservazionale; pertanto, gli interventi sono stati eseguiti sui pazienti. Nello studio sono stati inclusi un totale di 31 pazienti con MH stabile. Abbiamo ottenuto e registrato informazioni cliniche e demografiche per ciascun paziente. Tutti i pazienti sono stati trattati con dializzatori a membrana in polisulfone ad alto flusso (Toray Medical Co., Ltd., Tokyo, Giappone) con varie aree superficiali della membrana, adattate alla costituzione corporea di ciascun individuo. I pazienti sono stati divisi in due gruppi a seconda della causa della loro malattia renale allo stadio terminale: il gruppo non diabetico (gruppo non DM, n=17) e il gruppo diabetico, n=14).

Raccolta campioni. I campioni di sangue sono stati prelevati all'inizio e alla fine del trattamento dialitico dal prelievo situato sul lato arterioso del circuito HD. Per le misurazioni MULTIS, i sieri sono stati separati e conservati in un congelatore a {{0}} gradi (fino all'esecuzione della misurazione, per le misurazioni i-STrap. I campioni di sangue intero sono stati raccolti in provette rivestite di eparina a cui era consentito riposare per un'ora prima delle misurazioni. Misurazioni dell'attività di eliminazione di più radicali liberi nel siero. Le attività di eliminazione dei ROS idrofili sono state misurate con il metodo MULTIS utilizzando protocolli precedentemente descritti con modifiche minori.2227) Attività di eliminazione dei ROS idrofili, vale a dire il radicale idrossile (OH) , superossido (0,"), radicale alcossilico (RO"), radicale alchil perossilico (ROO") e ossigeno singoletto ('0,), sono stati misurati. Uno spettrometro ESR in banda X( RR-Xl ESR: Radical Research Inc., Tokyo, Giappone) utilizzando la modulazione di campo da 100 kHz e il software operativo WN-RAD (Radical Research Inc.). I reagenti di spin trapping ESR utilizzati erano CYPMPO per " OH, O, RO' e ROO' e 4-idrossi-2,2,6,6-tetrametilpiperidina (TEMP) per 'O. Le impostazioni tipiche dello spettrometro erano le seguenti: larghezza di modulazione del campo: 0,1 mT; potenza microonde, 10 mW; larghezza e velocità di scansione del campo+7,5 mT/2 min; e costante di tempo, 0,1 s. Ogni ROS è stato generato tramite illuminazione in situ con luce UV/visibile da un illuminatoreRUVF-203illuminatore UV SR, Radical Research Inc.) dotato di una lampada ad arco al mercurio/xeno a media pressione da 200 W e guida luminosa al quarzo, collegata alla cavità del risonatore. Le sorgenti luminose, i tempi di illuminazione, i precursori e i fotosensibilizzatori utilizzati per produrre ROS sono riepilogati nella Tabella 1. Le attività di eliminazione dei ROS sono state calcolate secondo un metodo precedentemente descritto22) e convertite nell'unità equivalente agli scavenger puri noti: glutatione (GSH) per OH e 'O, superossido dismutasi (SOD) per O, 6-idrossi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-acido carbossilico (Trolox) per RO', e a -acido lipoico per ROO'MULTISLe misurazioni per ciascun ROS sono state eseguite in triplicato.

Misurazione della lipofilia

Attività di eliminazione dei Ros nel sangue intero utilizzando i-Strap. L'attività di eliminazione dei ROs lipofili è stata misurata utilizzando il ki di misurazione i-STrap ESR (Dojin-Glocal/Dojindo, Kumamoto, Giappone) basato sul protocollo del produttore e su un rapporto precedente.2s Questo metodo si basa sulla reazione competitiva tra antiossidanti nel sangue intero e DPhPMPO con il tert-butil idroperossido (BuOOHradical. I campioni di sangue intero sono stati incubati con DPhPMPO(1{{10}} mM) e test-BuOOH (10 mM) per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, la centrifugazione gli addotti nella fase organica sono stati estratti utilizzando soluzioni di cloroformio e metanolo; le misurazioni della VES sono state condotte utilizzando questi campioni organici. Le condizioni di misurazione erano le stesse della misurazione MULTIS, ad eccezione dell'ampiezza e della velocità di scansione del campo, impostate a+5 0,0 mT/2 min, non erano presenti antiossidanti specifici per la misurazione i-STrap; pertanto, l'attività di scavenging è stata espressa come un valore 10/-1, dove "0" denota l'intensità del segnale senza un campione e "' denota il segnale intensità con un campione.(28)Reagenti. CYPMPO è stato ottenuto da RR INC.(Giappone); riboflavina, 2,2'-azobis (2-amidinopropano) dicloridrato (AAPH), testo-BuOOH, dimetilsolfossido (DMSO) e rosa bengala sono stati acquistati da Sigma-Aldrich Japan (Tokyo, Giappone) ed è stato acquistato TEMP dalla Tokyo Chemical Industry (Tokyo, Giappone). Il perossido di idrogeno e i tamponi sono stati ottenuti da WakoChemical Co. (Osaka, Giappone). Analisi statistica." L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando Prism 6 per il software per computer Mac OS X (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). I ​​dati sono stati testati utilizzando il software per computer di Student t-test per dati appaiati. I dati sono stati espressi come valori medi con un intervallo di confidenza del 95% (IC al 95%).