Ecco una versione più concisa del titolo: Determinazione simultanea di sei componenti nella cistanche tubulosa mediante spettroscopia nel vicino infrarosso

1. Introduzione

Cistanche (Hoffmg. Et Link) è un genere fanerogamico perenne della famiglia delle piante Orobanchaceae. La maggior parte delle specie appartenenti al genere Cistanche vengono utilizzate da millenni in Cina come pianta medicinale; hanno la reputazione di tonico superiore; e sono conosciuti come "Ginseng dei Deserti". Cistanche tubulosa è un parassita obbligato delle radici della pianta perenne Tamarix chinensis. È stato documentato nella Farmacopea cinese come la fonte autentica diCistanches Herba(Nome cinese: Roucongrong) dall'edizione del 2005. La moderna ricerca farmacologica sulle specie Cistanche è stata avviata negli anni '80. Indagini farmacologiche hanno dimostrato che gli estratti delle piante di Cistanche possiedono un ampio spettro di attività, come curare l'insufficienza renale e la stitichezza senile, migliorare la capacità di apprendere e memorizzare, anti-Alzheimer, migliorare l'immunità, anti-invecchiamento, anti-fatica, ecc. Negli ultimi tre decenni, studi farmacologici completi e sistematici sono stati combinati con indagini fitochimiche per illuminare la base materiale degli effetti benefici delle radici delle piante Cistanche. Queste indagini indicano che i glicosidi feniletanoidi (PhG) erano i principali componenti efficaci nelle piante di Cistanche, svolgendo un ruolo chiave nel trattamento dell'insufficienza renale, dell'impotenza, dell'anti-invecchiamento e del morbo di Alzheimer. Il contenuto di due PhG (echinacoside e verbascoside) era richiesto nella farmacopea cinese. Nel frattempo, i carboidrati come mannitolo, saccarosio, glucosio e fruttosio nelle piante Cistanche possiedono la funzione lassativa e i gruppi di carboidrati diPiante di Cistanchesono stati utilizzati per il trattamento della stitichezza.

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Le risorse selvatiche di C. tubulosa sono distribuite principalmente nell'area circostante il deserto del Taklamakan nella regione autonoma meridionale dello Xinjiang in Cina. Similmente a molte altre specie utilizzate nella medicina tradizionale cinese (MTC), la C. tubulosa ha un grande valore economico ed è quasi estinta nel suo habitat naturale a causa della raccolta eccessiva. La coltivazione della C. tubulosa è iniziata negli anni '90 in Cina per garantire l'approvvigionamento di materie prime per la Cistanches Herba e per proteggere le risorse vegetali selvatiche. Nel 2017, nella prefettura di Hotan nello Xinjiang esistono quasi 13mila ettari di C. tubulosa coltivata. Sono necessari progressi nella tecnologia di semina per espandere la coltivazione e migliorare la qualità della C. tubulosa.

Lo scopo principale della coltivazione della C. tubulosa è produrre Cistanches Herba, essendo ricca di questi componenti efficaci. Tuttavia, il contenuto dei componenti efficaci inCistanches Herba, come PhG e oligosaccaridi, possono essere influenzati in modo significativo da molti fattori durante la produzione. Dovrebbe essere esplorato un sistema di rilevamento in tempo reale della qualità di C. tubulosa. Pertanto, è necessario sviluppare un metodo ad alta produttività per soddisfare l'esigenza di analizzare un gran numero di campioni in un breve periodo. Tradizionalmente, la determinazione dei componenti primari efficaci, come PhG e carboidrati, nella C. tubulosa veniva solitamente ottenuta utilizzando la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC). Sebbene sia accurato e affidabile, richiede molto tempo ed è laborioso per la raccolta e l'elaborazione dei dati. Inoltre, sono necessari molto tempo e impegno anche per la preparazione del campione, che solitamente comporta la polverizzazione, l'estrazione e la filtrazione dei test HPLC. Pertanto, per ottenere una quantità relativamente grande di dati sono necessari un principio chiaro e uno strumento facile da utilizzare. Fortunatamente, la spettroscopia nel vicino infrarosso (NIRS) è stata ampiamente utilizzata per valutare prodotti agricoli, alimenti, campioni medici e prodotti farmaceutici perché è rapida e non distruttiva. Pertanto, la NIRS potrebbe soddisfare esattamente i requisiti per misurazioni efficienti delle MTC e, non sorprende, che la NIRS sia stata applicata per l’identificazione qualitativa e la quantificazione dei composti nelle MTC.

In questo studio, il contenuto di sei componenti efficaci, inclusoechinacoside, verbascoside, mannitolo, saccarosio, glucosio e fruttosioin 116 lotti di campioni di C. tubulosa raccolti dalla prefettura di Hotan nello Xinjiang nel 2013-2015 sono stati determinati per la prima volta mediante HPLC. Successivamente, i modelli di calibrazione di questi sei componenti sono stati stabiliti con il metodo di regressione dei minimi quadrati parziali (PLSR). Questi modelli sono stati poi convalidati con i coefficienti di correlazione e gli errori di previsione nei set di calibrazione. I risultati hanno dimostrato che il metodo sviluppato potrebbe essere impiegato come metodo affidabile per l'analisi quantitativa di C. tubulosa.

2. Risultati

2.1. Analisi HPLC

Il contenuto diechinacoside e verbascosidesono stati determinati mediante un metodo HPLC-UV ben definito in letteratura e quattro carboidrati (mannitolo, saccarosio, glucosio e fruttosio) sono stati determinati mediante un metodo HPLC-ELSD ben definito in letteratura per tutti i 116 campioni. I metodi di preparazione e determinazione dei campioni sono stati descritti nelle Sezioni 3.1 e 3.3. La Figura 1 mostra i cromatogrammi caratteristici degli standard misti. Si può vedere che tutte e sei le componenti efficaci erano separate dalla linea di base e quindi potevano essere quantificate. Il metodo HPLC è stato convalidato prima dell'analisi del campione. I principali risultati del metodo HPLC sono elencati nella Tabella 1. Nei risultati sono mostrati una relazione lineare favorevole (r=0.9998) e un recupero (98,5%) del metodo di determinazione dell'echinacoside, lo stesso risultato di tutti e cinque componenti. Pertanto, il contenuto dei sei componenti efficaci può essere determinato con precisione. Tutti gli intervalli di contenuto determinati sono riepilogati nella Tabella 1.

2.2. Analisi NIRS

La Figura 2 mostra gli spettri NIR (4000–10,000 cm−1) dei campioni di C. tubulosa. Picchi di assorbimento significativi sono comparsi da 4.000 cm−1 a 7.500 cm−1 in tutti i campioni, mentre lievi fluttuazioni sono apparse da 7.500 cm−1 a 10.000 cm−1. La deriva della linea di base degli spettri NIR si è verificata perché il campione veniva facilmente influenzato da fattori quali la dimensione e il colore delle particelle (Figura 2A). I pretrattamenti matematici degli spettri sono stati utilizzati per ridurre in una certa misura l'influenza delle informazioni non necessarie. I pretrattamenti matematici includevano la prima derivazione (1a derivazione), la seconda derivazione (2a derivazione), la varietà normale standard (SNV) e la correzione della dispersione moltiplicativa (MSC). La Figura 2B mostra la seconda derivazione degli spettri NIR di C. tubulosa e si osservano le variazioni significative che si sono verificate da tre regioni, 4000–4500 cm−1, 5000–5500 cm−1 e 7000–7500 cm−1.

2.3. Istituzione di modelli di calibrazione quantitativa

La regressione parziale dei minimi quadrati (PLSR) è un metodo di modellazione classico ed è stato ampiamente applicato nei modelli quantitativi grazie all'elevata qualità dei risultati. I vantaggi di PLSR includono la sua buona capacità di previsione e la relativa semplicità. Il PLSR è stato ampiamente applicato anche nella creazione di modelli di calibrazione quantitativa delle MTC [25]. Sulla base degli spettri NIR pretrattati, è stato stabilito un modello di analisi quantitativa NIR per i sei componenti efficaci di C. tubulosa utilizzando il metodo PLSR con i dati dell'analisi HPLC come valori reali. I 116 campioni sono stati divisi casualmente in set di calibrazione e validazione con un rapporto 3:1. Le condizioni più adatte per la calibrazione sono state scelte dal basso RMSEC e dall'alto coefficiente di correlazione.

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2.3.1. Selezione della banda d'onda per i modelli di calibrazione

La selezione di una banda d'onda adatta è stata un passo importante per la costruzione del modello di calibrazione. In questo studio sono stati confrontati gli spettri dell'intervallo NIR di 4000–7500 cm−1 (consigliato dal software TQ Analyst) e 4000–10.000 cm−1. È stato osservato che questo intervallo non è adatto per la calibrazione nell'intervallo tra 4000 cm−1 e 7500 cm−1 dalla Tabella 2. Pertanto, nel presente studio, gli intervalli spettrali per i sei costituenti chimici sono stati tutti selezionati dall'intervallo da Da 4000 a 10.000 cm−1 confrontando le prestazioni di RMSEC e il coefficiente di correlazione.

2.3.2. Selezione del numero ottimale di fattori per i modelli di calibrazione

Il PLSR spiega la quantità massima di variabilità nei dati riducendo la dimensionalità dei dati degli spettri mediante il calcolo dei fattori. Il problema dell'"insufficienza dell'idoneità" è emerso a causa di un'informazione insufficiente derivante da un numero limitato di fattori; tuttavia, la scelta di fattori maggiori rispetto ai valori ottimali introdotti nel modello porterà al problema del "overfittedness". Sia l'"underfittedness" che l'"overfittedness" ridurranno il potere predittivo dei modelli stabiliti [22]. La Figura 3 mostra la relazione tra RMSECV e i fattori per tutti e sei i composti. Pertanto, abbiamo selezionato quei fattori corrispondenti ai valori più bassi di RMSECV. La selezione ottimale dei fattori per i modelli di calibrazione è elencata nella Tabella 3.

2.3.3. Selezione del pretrattamento spettrale per i modelli di calibrazione

Un altro fattore critico influente per i modelli di calibrazione è il pretrattamento spettrale che mira a ridurre l'influenza della dispersione e della deriva della linea di base, migliorando i rapporti segnale-rumore e rimuovendo le variazioni irregolari. Per eliminare l'influenza della diffusione delle radiazioni sono stati utilizzati metodi di correzione della dispersione moltiplicativa (MSC) e della variabile normale standard (SNV). Per risolvere gli effetti della deriva della linea di base, sono stati confrontati gli spettri della derivata 1a e 2a ed è stata selezionata la derivazione 2a. Per ottenere l'effetto desiderato, abbiamo attenuato gli spettri con l'algoritmo del filtro Savitzky-Golay (SG) prima della derivazione per prevenire l'ingrandimento del rumore. La tabella 3 mostra le informazioni sul pretrattamento spettrale e i suoi risultati per i modelli di calibrazione.

2.4. Valutazione dei modelli consolidati

Un buon modello di calibrazione NIRS dovrebbe avere valori RMSEC e RMSEP bassi, nonché un coefficiente di correlazione elevato (r) e piccole differenze tra RMSEC e RMSEP. I modelli di calibrazione dei sei composti selezionati sono stati stabiliti secondo le procedure sopra menzionate (Tabella 3). I valori RMSEC e r per il set di calibrazione dell'echinacoside erano rispettivamente 27,6 e 0.9808. I parametri prestazionali di altri modelli di composti chimici sono elencati nella Tabella 3, dalla quale possiamo concludere che i modelli stabiliti emergono risultati di previsione soddisfacenti e possono essere utilizzati per la rapida analisi quantitativa di C. tubulosa. I grafici a dispersione dei sei composti chimici sono mostrati nella Figura 4 per rendere i modelli di calibrazione più descrittivi e osservabili visivamente. Come mostrato nella Figura 4, si sono verificate differenze minori tra i valori predittivi e quelli misurati, poiché la maggior parte dei punti erano distribuiti attorno alla curva regressiva con un'equazione come y=x. Pertanto, nella Figura 4 sono state osservate eccellenti prestazioni predittive.

3. Materiali e metodi

3.1. Preparazione del campione

Centosedici campioni di C. tubulosa sono stati raccolti dalla prefettura di Hotan nella regione autonoma dello Xinjiang dal 2013 al 2015. Tutti i campioni sono stati coltivati, ma sono stati raccolti in diverse fasi di crescita. Il peso fresco dei campioni variava da 20 g a 1000 g. Dopo l'essiccazione al sole, i campioni essiccati sono stati frantumati e setacciati attraverso un setaccio a maglie 60-.

3.2. Raccolta dati spettroscopici NIR

Gli spettri NIR dei campioni sono stati raccolti ad un intervallo di 8 cm−1 sulla regione spettrale di 4000–10.000 cm−1 con un sistema Antaris MXFT-NIR (Thermo Scientific, Madison, WI, USA) dotato di un adattatore di riflettanza per fibra ottica portatile. Ciascuno spettro è stato ottenuto calcolando una media di 64 scansioni. Tutti i campioni sono stati lasciati equilibrare a temperatura ambiente (25 ◦C) prima della scansione degli spettri NIR per garantire che i campioni fossero analizzati alla stessa temperatura. L'umidità nel laboratorio è stata mantenuta a livello ambientale.

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3.3. Raccolta dati HPLC

3.3.1. Preparazione dell'estrazione

Un grammo di polvere di C. tubulosa è stato estratto con 50 mL di metanolo al 50% in una beuta con ultra-sonicazione (500 W, 40 KHz) per 30 minuti. L'estratto è stato conservato a 4 ◦C. Il surnatante dell'estratto è stato filtrato per ottenere un campione per l'analisi HPLC.

3.3.2. Determinazione simultanea di Echinacoside e Verbascoside con HPLC-UV

L'analisi cromatografica liquida è stata condotta su un sistema UHPLC Shimadzu (Shimadzu, Kyoto, Giappone) costituito da due unità di erogazione del solvente LC-20ADXR, una pompa LC-20AD, un sistema automatico SIL-20ACXR campionatore, un forno a colonna CTO-20AC, un rilevatore DAD SPD-M20A, un degasatore DGU-20A3R e un controller CBM-20A.

Una colonna Grace Prevail Carbohydrated ES (150 × 2,1 mm, 2,7 mm) utilizzata per le separazioni cromatografiche è stata mantenuta a 35 ◦C. La fase mobile era costituita da acetonitrile (A) e 0,1% di acido formico acquoso (B) ed è stata erogata seguendo il programma del gradiente come segue: 0–7 min, gradiente lineare del 10–20% UN; 7–15 minuti, 20% A; e 15–20 min, gradiente lineare del 20–10% A. La portata della fase mobile era 0,4 mL/min. Il monitoraggio UV è stato eseguito a 330 nm.

3.3.3. Determinazione simultanea di mannitolo, saccarosio, glucosio e fruttosio con HPLC-ELSD

L'HPLC è stata eseguita su un sistema LC Agilent serie 1100 (Palo Alto, California, USA) costituito da un degasatore G1322A, una pompa quaternaria G1311A, un campionatore automatico G1311A, un controller della temperatura della colonna G1316A e un rilevatore DAD G1315B.

Per le separazioni cromatografiche è stata impiegata una colonna Sigma Prevail Carbohydrated ES (4,6 × 250 mm, 5 µm) e mantenuta a una temperatura della colonna di 25 ◦C. La fase mobile era composta da acetonitrile e acqua (77:23, v/v) e alleato isocratico fornito ad una portata di 0,7 mL/min. L'effluente è stato monitorato utilizzando un rilevatore di diffusione evaporativa della luce (ELSD) con parametri predefiniti.

3.4. Elaborazione dei dati

TQ Analyst (versione 8.0, Thermo Scientific, Madison, WI, USA) è stato utilizzato per eseguire la divisione dei set di calibrazione e validazione, il pretrattamento matematico degli spettri, la creazione dei modelli di calibrazione e altri calcoli . Per realizzare le figure è stata utilizzata Origin (versione 9.1).

4. Conclusioni

In questo studio, abbiamo proposto un metodo rapido e non distruttivo per l'analisi simultanea diechinacoside, verbascoside, mannitolo, saccarosio, glucosio e fruttosioin C. tubulosa da NIRS. Le analisi di RMSEC, coefficiente di correlazione, RMSEP e valori Rp hanno dimostrato che i modelli NIR quantitativi stabiliti potrebbero essere utilizzati per prevedere con precisione il contenuto dei sei componenti efficaci selezionati in C. tubulosa. Rispetto all'HPLC, il metodo NIRS riportato in questo studio può far risparmiare tempo e manodopera significativi, pur mantenendo una capacità di analisi quantitativa soddisfacente. Pertanto, il metodo qui riportato ha il potenziale per essere utilizzato nel controllo di qualità di C. tubulosa e quindi per guidare lo sviluppo della tecnologia di coltivazione e processo per C. tubulosa.

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