Sebbene non sembri che la percentuale di TEX aumenti con la gravità della malattia (Figura 6C supplementare) o con l'età degli animali inclini al lupus (6), il numero totale di cellule T infiltranti aumenta con la gravità della malattia in questi modelli e nei pazienti umani. Quindi, potrebbe esserci un punto oltre il quale l'esaurimento puònon controllare più la malattia. Il lavoro precedente ha suggerito che quei pazienti con una firma CD8 più TEX nel sangue periferico avevano meno probabilità di riacutizzarsi rispetto a quelli privi di questa firma (52). Tuttavia, ciò che accade a livello dell'organo bersaglio rimane una questione in sospeso e sarà interessante, in lavori futuri, determinare se la proporzione di cellule esaurite in una biopsia può essere correlata con gli esiti della malattia.

Secondo studi pertinenti, la cistanche è un'erba tradizionale cinese utilizzata da secoli per curare varie malattie. È stato scientificamente dimostrato che possiede proprietà antinfiammatorie, antietà e antiossidanti. Gli studi hanno dimostrato che la cistanche è benefica per i pazienti affetti da malattie renali. I principi attivi della cistanche sono noti per ridurre l'infiammazione, migliorare la funzione renale e ripristinare le cellule renali compromesse. Pertanto, l'integrazione della cistanche all'interno di un piano di trattamento della malattia renale può offrire grandi vantaggi ai pazienti nella gestione della loro condizione. Cistanche aiuta a ridurre la proteinuria, abbassa i livelli di BUN e di creatinina e riduce il rischio di ulteriori danni ai reni. Inoltre, la cistanche aiuta anche a ridurre i livelli di colesterolo e trigliceridi che possono essere pericolosi per i pazienti affetti da malattie renali.

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Sarà importante identificare i meccanismi mediante i quali ciascuno di questi tipi ed eventi cellulari potenzialmente dannosi viene inibito dal rene e in che modo le terapie esistenti e nuove possono influenzarli. Si spera che questo lavoro consentirà a noi e ad altri di indirizzare queste diverse popolazioni di cellule T in modo più specifico, aprendo così nuove strade terapeutiche.

Metodi

Animali. I topi C57BL/6 sono stati acquistati dal Jackson Laboratory. I topi MRL/lpr sono stati inizialmente ottenuti dal Jackson Laboratory e sono stati mantenuti nel nostro laboratorio. I topi Fc R2B–/–.Yaa sono stati ottenuti da Silvia Bolland (National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH, Rockville, Maryland, USA) e sono stati mantenuti nel nostro laboratorio. I topi erano invecchiati e la proteinuria è stata misurata prima del sacrificio, come documentato nella Tabella 2 supplementare.

Isolamento delle cellule T dal rene e dalla milza. Le cellule T sono state isolate come precedentemente descritto (6). In breve, dopo il sacrificio, le milze sono state rimosse e gli animali sono stati perfusi con 40 mL di HBSS fino al completo sbiancamento del fegato e del rene. I KIT sono stati isolati utilizzando l'Octodissociator (Miltenyi Biotec) in presenza di 1600 unità Kunitz/mL di collagenasi D (Roche Diagnostics) e 0,2 mg/mL di DNAsi IV (MilliporeSigma) per 30 minuti a 37 gradi . È stata eseguita la lisi dei globuli rossi e le cellule sono state filtrate attraverso un filtro cellulare (100 μM di nylon; Falcon, Corning). Gli splenociti sono stati isolati mediante dissociazione meccanica tra 2 vetrini smerigliati e filtrati attraverso un filtro a rete da 70 μm dopo la lisi dei globuli rossi.

Le cellule sono state colorate come precedentemente descritto (6) con il seguente pannello: anti-CD8 (Lyt-2/TIB-105, Pac-Blue, prodotto internamente), anti-CD4 (GK{{9 }}.5, in PE, acquistato da BioLegend) e anti-CD90.2 (Thy1.2/30H12, Al488, prodotto internamente) per topi MRL/lpr o anti-CD90.2 (Thy1.2/30H12 , Al647, prodotto internamente) per Fc R2B–/–.Yaa Ghost BV510 (Tonbo) è stato utilizzato per escludere le cellule morte. Per tutti gli anticorpi "in-house", i cloni di ibridoma sono disponibili in commercio e gli anticorpi sono stati purificati come descritto (6).

Le cellule T sono state ordinate utilizzando un FACSAria (BD Biosciences). Dopo lo smistamento, le cellule sono state lavate due volte con il 2% di BSA in PBS. Quindi i reagenti HTO anti-CD45 sono stati aggiunti a una diluizione 1:50 a ciascuno dei campioni ordinati. Anti-CD45 TotalSeq-A0096 30-F11 (BioLegend) è stato utilizzato per la coorte Main-Seq e TotalSeq-C0096 30-F11 (BioLegend) è stato utilizzato per entrambe le coorti TCR-Seq. Dopo che le cellule di colorazione HTO sono state lavate due volte in BSA al 2% in PBS.

Preparazione della libreria e RNA-Seq delle cellule T. Le cellule sono state contate e caricate nel sistema 10x Genomics Chromium secondo le istruzioni del produttore. Sono state generate librerie di espressione genica, TCR e hashtag anticorpale/codici a barre delle caratteristiche, la loro qualità è stata valutata tramite lo Screentape Agilent TapeStation High Sensitivity D5000 e le loro quantità sono state quantificate con il kit di quantificazione della libreria KAPA per piattaforme Illumina. Per la coorte Main-Seq è stata utilizzata la libreria 3PrimeV2; la libreria di codici a barre delle caratteristiche è stata generata secondo il protocollo del New York Genome Center (56). Per le coorti TCR-Seq, le librerie 5PrimeV1 sono state ottenute da 10x Genomics. Per l'hashtag, abbiamo seguito le istruzioni del produttore relative al "codice a barre delle caratteristiche". Le librerie sono state raggruppate e sequenziate su un NovaSeq (Illumina Biosciences). I file FASTQ sono stati generati e allineati al genoma di riferimento del topo mm10 con Cell Ranger 5.0.0 (10x Genomics) per produrre la matrice di conteggio gene-cellula e cellula-anticorpo.

elaborazione dei dati scRNA-Seq. I dati grezzi 10x di ciascun campione sono stati demultiplati e i file FASTQ sono stati generati utilizzando la pipeline "veloce" di Cell Ranger (v5.0.0, 10 x Genomica). Il "conteggio" di Cell Ranger è stato utilizzato per allineare le letture al genoma di riferimento mm10 e sono state generate tabelle di quantificazione dell'identificatore molecolare univoco (UMI) di mRNA e HTO. I file di matrice di codici a barre grezzi generati dalla pipeline di Cell Ranger sono stati ulteriormente utilizzati per l'analisi a valle utilizzando il pacchetto Seurat (v4.0.0) (12) in R (v3.4.3).

Controllo qualità iniziale e lavorazione. Le cellule che esprimevano meno di 200 geni, o con più del 10% di UMI mappate sul DNA mitocondriale, sono state filtrate. Le tabelle HTO sono state aggiunte al set di dati e normalizzate mediante un metodo di rapporto logaritmico centrato utilizzando la funzione "NormalizeData". Il conteggio HTO normalizzato è stato utilizzato per determinare se ogni gel bead-in-emulsion conteneva una singola cellula utilizzando la funzione Seurat "MULTIseqDemux" e l'ispezione manuale delle cellule, dove una cellula era considerata un singoletto se l'espressione di un singolo HTO rappresentava più oltre il 70 percento dell'espressione totale di HTO in quella cellula; in caso contrario, la cella era considerata un doppietto e rimossa. I valori di espressione genica per ogni cella sono stati log2 -normalizzati utilizzando la funzione "NormalizeData", in cui l'espressione di un gene è stata normalizzata all'espressione totale di tutti i geni in quella cella e ridimensionata di un fattore 10,{{8 }}. I punteggi dell'UMI, del contenuto mitocondriale e del gene dell'emoglobulina e del contenuto del gene ribosomiale sono stati "regrediti" utilizzando la funzione "ScaleData" di Seurat.

Riduzione della dimensionalità e clustering. I geni variabili sono stati rilevati utilizzando il metodo "mean.var.plot" nella funzione "FindVariableFeatures" con cutoff predefinito, che calcola l'espressione media e la dispersione (log[variance/mean]) per gene, seguita dal raggruppamento dei dati in 20 bin in base alla loro espressione media. I geni variabili sono stati quindi selezionati in base alla dispersione con punteggio z all'interno di ciascun bin. Questi geni variabili sono stati utilizzati per la riduzione della dimensionalità basata sull'analisi dei componenti principali (PCA) utilizzando la funzione "RunPCA". "ElbowPlot" è stato utilizzato per valutare i primi 50 componenti principali e i componenti principali che rappresentavano la maggiore variabilità nei dati sono stati selezionati per un'ulteriore riduzione dimensionale UMAP e analisi di clustering.

Per identificare gruppi distinti di cellule, è stato eseguito il clustering non supervisionato utilizzando la funzione "FindClusters", che calcola i vicini k più vicini in base all'espressione genica variabile in tutte le cellule, costruendo così un grafico del vicino più vicino condiviso utilizzando l'algoritmo di Louvain. Per evitare l'overclustering, abbiamo testato diversi parametri di risoluzione ("res"), che vanno da 0.1 a 2 con incrementi di 0.1, e la progressione del clustering è stata valutata e visualizzata utilizzando "Cluster " (v 0.4.3) (57). La risoluzione ottimale è stata determinata sulla base della continua separazione prima del "over clustering" come osservato dal crescente crossover tra i cluster. Il clustering a bassa risoluzione è stato quindi definito come l'analisi di tutte le celle all'interno di un'intera coorte, mentre il clustering ad alta risoluzione è stato definito come clustering su una sottopopolazione preselezionata, ad esempio cellule CD4 plus, CD8 plus o Treg precedentemente definite nel nostro studio a bassa risoluzione. analisi. Sulla base di queste osservazioni abbiamo scelto le risoluzioni 0.9, 1.4, {{20}}.6 e 0.9, rispettivamente, per Main-Seq, CD4 plus , CD4 plus Treg sub e CD8 plus dalla coorte 1 e risoluzione 0,7 per le cellule T CD8 plus della coorte unita. I cluster cellulari sono stati visualizzati utilizzando grafici di riduzione dimensionale UMAP.

La funzione "FindAllMarkers" con impostazioni predefinite è stata utilizzata per trovare i DEG in ciascun cluster, rispetto a tutti gli altri cluster, utilizzando il test Wilcoxon rank-sum con i geni rilevati in un minimo dell'10 percento delle cellule, un minimo di 0.25 variazione media della piega logaritmica e un minimo di 0,01 valore P corretto per Bonferroni.

Analisi dell'armonia. Per l'UMAP combinato nella Figura 8, le 3 coorti gestite in modo indipendente sono state unite utilizzando Harmony (58) con le impostazioni dei parametri predefinite.

Valutazione del ciclo cellulare. La funzione "CellCycleScoring" in Seurat è stata utilizzata per calcolare il punteggio di espressione dei marcatori di fase G1, G2/M e S in ciascuna cella utilizzando la strategia di punteggio descritta in precedenza (59). Il numero di cellule determinate per essere nella fase G1, G2/M o S è stato calcolato in base al cluster e la deviazione dalla distribuzione complessiva è stata valutata mediante analisi χ2.

GSEA e mappatura delle espressioni. I valori P per GSEA sono stati determinati utilizzando il test Wilcoxon per le firme del set di geni pubblicati come definito nella Tabella 1 supplementare. Utilizzando "ggplot2" in Seurat, i valori P –log10 sono stati tracciati sugli UMAP.

Analisi aggiuntive. Grafici a barre, grafici a punti e grafici PCA sono stati costruiti utilizzando ggplot2 in R. Le mappe di calore sono state generate utilizzando la funzione "mappa termica" in R.

Analisi dei dati TCR. I dati TCR sono stati elaborati utilizzando cell ranger vdj with–reference {{0}} refdata-cellranger-vdj-GRCm38-alts-ensembl-3.1.0 per assemblare TCR e catene e determinare i clonotipi . Le cellule con 1 TCR produttivo ( e ) sono state mantenute per ulteriori analisi, mentre le catene TCR non produttive sono state escluse. Le cellule T clonali sono state definite come cellule che esprimono recettori TCR- e - condivisi con sequenze CDR3 identiche a livello di nucleotidi.

Analisi della traiettoria pseudotemporale. L'analisi della traiettoria utilizzando i conteggi genici elaborati da Seurat è stata eseguita utilizzando Monocle 3 (versione 0.1.3) per modellare la differenziazione delle cellule CD4 più T. Il metodo di incorporamento del grafico inverso DDRTree è stato utilizzato per ridurre la dimensionalità, le celle sono state ordinate lungo una traiettoria utilizzando la funzione "orderCells" e la traiettoria è stata visualizzata nello spazio dimensionale ridotto.

Per modellare la differenziazione delle cellule CD8 più T, abbiamo usato Slingshot con "start. club" impostato come cluster B6/ingenuo. Le celle sono state ordinate in base allo pseudo tempo di Slingshot e raggruppate come ammassi Seurat per proiettare la traiettoria dell'ammasso. Il risultato del lignaggio della traiettoria di Slingshot è stato tracciato sulla cella CD8 plus Seurat UMAP.

Analisi della rete regolatoria TF. Il flusso di lavoro SCENIC v.1.1.2 è stato utilizzato in R per identificare i regulons utilizzando il conteggio e i cluster elaborati da Seurat come da uno studio precedente (60). Le mappe di calore sono state quindi create come descritto sopra.

Punteggio istologico. La preparazione e il punteggio dell'istologia renale sono stati eseguiti come definito in precedenza (61).

Disponibilità di dati e materiali. Tutte le analisi e le visualizzazioni sono state eseguite in R. La metodologia e l'analisi specifiche utilizzando i programmi Seurat pubblicati sono dettagliate nella sezione Metodi. I dati, i metadati e gli output di analisi come l'identificazione dei cluster sono depositati nel Gene Expression Omnibus (GSE197339) del National Center for Biotechnology Information.

Statistiche. Le statistiche sono state calcolate in R come indicato nelle sezioni specifiche dell'analisi o GraphPad Prism mediante 1-way ANOVA con il test di Tukey per confronti multipli, 2-way ANOVA con misure ripetute o analisi χ2 come definito nelle legende delle figure, con i valori P rappresentati come *P < 0.05, **P < 0.{{10}}1, ***P < 0,001, **** P < 0,0001. P <0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

Approvazione dello studio. Tutto il lavoro è stato approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università di Pittsburgh o dell'Università di Yale.

Contributi d'autore

JST e MJS hanno ideato lo studio. SS, MC, JST e MJS hanno sviluppato una metodologia. JST e SS sono stati studiati. JST e SS hanno visualizzato i dati. JST e MJS hanno acquisito finanziamenti. JST e MJS hanno fornito l'amministrazione del progetto. JST e MJS hanno fornito la supervisione. JST e MJS hanno scritto la bozza originale. JST, MJS, SS e MC hanno rivisto e modificato la bozza.

Ringraziamenti

Vorremmo ringraziare Minjung Kim per i suoi instancabili sforzi in laboratorio, consentendo il completamento di questo lavoro, e riconoscere la visione critica del progetto da parte di Kevin Nickerson, Rachael Gordon e Peter Lipsky e la revisione critica di questo lavoro da parte di Fadi Lakkis e Warren Shlomchik. Inoltre, vorremmo ringraziare l'Università di Pittsburgh Single Cell Core e in particolare Tracy Tabib, che ci hanno aiutato a completare la preparazione della libreria e la tecnologia 10x Genomics.

Il finanziamento è stato fornito da Lupus Research Alliance, Novel Research Grant (a JST); NIH/National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases sovvenzione K08AR075056 (a JST); e NIH/National Institute of Allergy and Infectious Diseases grant R01 AI137132 (a MJS).

Indirizzare la corrispondenza a:Jeremy S. Tilstra, 3500 Terrace Street, BST S705A, Pittsburgh, Pennsylvania 15261, USA. Telefono: 412.383.8861; O a Mark J. Shlomchik, W1052 Biomedical Science Tower, 200 Lothrop Street, Pittsburgh, Pennsylvania 15261, USA. Telefono: 412.648.8771.

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