La causa della malattia renale cronica (CKD) - Anemia

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PARTE I.:P roteinurica cronica renale è associata ad alterazione della durata della vita dei globuli rossi, deformabilità e metabolismo

Rosi Bissinger, Travis Nemkov & et al.

Lo sviluppo dianemiaè una complicanza tipica di advancedmalattia renale cronica(CKD) ed è associato a una qualità della vita compromessa¹e aumento del rischio di eventi cardiovascolari²e ricovero ospedaliero,³così come il declino cognitivo.⁴La gravità dianemiaè stato visto come un predittore indipendente di mortalità nella CKD dipendente dalla dialisi e non dialisi (malattia renale cronica) pazienti.⁵La fisiopatologia della malattia renale associataanemiaè complesso e comporta una carenza di ferro ed eritropoietina (EPO) nel contesto di un'infiammazione di basso grado, che, a sua volta, compromette la normale eritropoiesi nella CKD (malattia renale cronica) pazienti.⁶In CKD avanzata (malattia renale cronica), la risposta dell'UEB è insufficientemente bassa rispetto al grado dianemia.^7,8L'alta prevalenza di carenza di ferro concomitante nella CKD (malattia renale cronica) è una conseguenza dell'omeostasi del ferro disturbata.⁹Un meccanismo trascurato di perdita di ferro nella CKD (malattia renale cronica) è la proteinuria, che può portare a perdite urinarie di ferro legato alla transferrina (fino a 0,3 mg/d) quando la proteinuria raggiunge l'intervallo nefrosico.¹⁰Un altro fattore che si pensa contribuisca aanemiain CKD (malattia renale cronica) è la durata ridotta della vita dei globuli rossi (RBC), descritta per la prima volta >60 anni fa.^6,11,12

Beneficio di Cistanche: trattamento delle malattie renali e miglioramento della funzionalità renale

Un recente studio che utilizza un test del respiro del monossido di carbonio ha dimostrato che la durata della vita dei globuli rossi è progressivamente diminuita da 120 giorni nei pazienti con CKD di stadio 1 (malattia renale cronica) a 60 giorni in pazienti con CKD in stadio 5 (malattia renale cronica).¹³In particolare, la trasfusione di globuli rossi allogenici da donatori sani a CKD (malattia renale cronica) è stata seguita da una rapida clearance dei globuli rossi trasfusi senza evidenza di emolisi.¹²Un meccanismo plausibile per questa osservazione potrebbe essere la stimolazione della morte cellulare simile all'apoptosi nei globuli rossi anucleati, denotando un modello di lesione in cui l'integrità della membrana cellulare non è compromessa e il contenuto citoplasmatico rimane intatto.¹⁴I globuli rossi sottoposti a morte cellulare presentano varie alterazioni morfologiche derivanti da danni citoscheletrici, come la formazione di bleb superficiali, la perdita di elasticità della membrana e / o la disidratazione cellulare.¹⁵A livello molecolare, la morte dei globuli rossi è associata all'accumulo intracellulare di Ca2þ, allo stato energetico cellulare alterato e alla rottura dell'asimmetria fosfolipidica, portando infine all'esternalizzazione della fosfatidilserina (PS) sulla membrana plasmatica esterna.^15,16Di conseguenza, i macrofagi e le cellule dendritiche specializzate riconoscono rapidamente i globuli rossi esternalizzati da PS, portando alla fagocitosi dell'eritrosi e al loro catabolismo nella milza e nel fegato.¹⁷A causa della fisiopatologia confondente dimalattia renale–associatoanemianell'uomo, gli studi sugli animali sono giustificati per individuare i meccanismi che contribuiscono. Nefropatia indotta da doxorubicina (DIN) nei topi 129S1/SvImJ¹⁸e topi con deficit inducibile di podocina (Nphs2Dipod)¹⁹sono 2 modelli caratterizzati dall'induzione della proteinuria nefrosica entro pochi giorni, dalla progressione verso l'insufficienza renale dopo 3 settimane e dalla morte in 6-7 settimane.^19–21Entrambi i modelli murini ricapitolano efficacemente tutte le fasi della CKD umana (malattia renale cronica). Nel presente studio, abbiamo testato se l'insufficienza renale progressiva in questi topi con proteinuricomalattia renaleinfluisce sulla durata della vita dei globuli rossi e contribuisce aanemia. In parallelo, abbiamo esaminato il fenotipo RBC nel sangue prelevato dalla CKD (malattia renale cronica) pazienti con proteinuria nefrosica.

CKD (malattia renale cronica) eanemia: CISTANCHE

METODI

Informazioni dettagliate sui materiali e sui metodi sono fornite nei Materiali e metodi supplementari.

Studi sui topi

Gli esperimenti sono stati eseguiti su topi 129S1 / SvImJ di tipo selvatico di 8 settimane di entrambi i sessi (Charles River). La DIN è stata indotta da una singola iniezione di doxorubicina (14,5 mg/g di peso corporeo), come descritto in precedenza.^18,22Per controllare l'effetto mielotossico della doxorubicina non correlato allo sviluppo della nefropatia, anche i topi C57BL/6 resistenti alla doxorubicina sono stati sottoposti allo stesso protocollo di trattamento.²³Inoltre, esperimenti simili sono stati condotti su topi di 8 settimane con delezione inducibile di podocina (B6-Nphs2tm3.1Antc*Tg [Nphs1-rtTA*3G] 8Jhm*Tg[tetO-cre]1Jaw) o topi Nphs2Dipod, che sono stati trattati con doxiciclina per 14 giorni.¹⁹Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti secondo la Guida nazionale degli istituti sanitari per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e la legge tedesca per il benessere degli animali, con l'approvazione delle autorità locali (Regierungspräsidium Tübingen, numeri di approvazione M12/17 e M17/19G). Il disegno sperimentale degli studi sui topi è delineato nella Figura supplementare S1.

Pazienti

Lo studio sui pazienti è stato condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki ed è stato approvato dal comitato etico locale dell'Ospedale universitario di Tubinga (556/2018BO2). Campioni di sangue e urina di litio-eparina sono stati ottenuti da pazienti con proteinuria dell'intervallo nefrotico e velocità di filtrazione glomerulare conservata (GFR; stadi 1-2; n 1/4 10) e pazienti con GFR ridotta (CKD (malattia renale cronica) fase 3–5; n 1/4 15) presso l'Ospedale universitario di Tubinga. Come gruppo di controllo, il sangue di volontari sani abbinati all'età e al sesso (n 1/4 25) è stato fornito dalla banca del sangue dell'Ospedale universitario di Tubinga. Tutti i campioni umani sono stati raccolti dopo il consenso informato. Le caratteristiche cliniche dei pazienti sono indicate inTabella 1.

Tabella 1 | Caratteristiche dei pazienti con CKD (malattia renale cronica) e donatori di sangue sani

Analisi citometriche a flusso

Diversi parametri di morte delle cellule RBC sono stati determinati dalla citometria.¹⁴Per determinare la durata della vita dei globuli rossi in vivo, 25 ml di colorante 5,6-carbossifluoresceina diacetato succinimidile estere [5(6)-CFDA, SE] sono stati iniettati ad una concentrazione di 9,96 mM (solubilizzato in dimetilsolfossido) nel plesso retroorbitale di topi wild-type 129S1/SvImJ e doxorubicina iniettati, come descritto in precedenza.24 Nei punti temporali indicati, il sangue è stato prelevato dal plesso retroorbitale dei topi, e la percentuale di 5(6)-CFDA, cellule SEþ è stata rilevata da altre analisi citometriche. Infine, i dati sono stati analizzati utilizzando il software FlowJo (FlowJo LLC).

Deformabilità RBC ed ektacitometria a gradiente osmotico

La deformabilità dei globuli rossi è stata misurata utilizzando l'analizzatore ottico di celle rotazionali assistite da laser (LORCA Max Sis; RR Mechatronics), che è stato descritto in dettaglio altrove.²⁵Anche le analisi di ektacitometria a gradiente osmotico (cosmos can) sono state eseguite utilizzando il LORCA Max Sis e misurano la deformabilità in varie condizioni osmotiche.²⁶

Esame istologico

Per la colorazione di ematossilina ed eosina, milza e femori sono stati colorati con ematossilina ed eosina. Tutti i vetrini sono stati colorati con l'anticorpo primario Ter119 (BD Pharmingen; diluizione 1:500). Per la colorazione periodica acida-Schiff, fette spesse 2,5 mm delrenisono stati colorati con reagente periodico acido-Schiff (Carl Roth) ed ematossilina (Abcam). La colorazione May-Grünwald-Giemsa (metodo Pappenheim) è stata eseguita per determinare i cambiamenti di forma dei globuli rossi, come descritto in precedenza.²⁷L'isolamento dei glomeruli è stato fatto utilizzando un approccio di biotinilazione e smistamento cellulare.¹⁹Per il rilevamento proteico di podocina, è stato applicato un anticorpo di Sigma (P0372).¹⁹Roti-Mount Fluor Care 4,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI; Carl Roth) è stato usato per macchiare i nuclei.

Cromatografia liquida ad altissime prestazioni-spettrometria di massa metabolomica da globuli rossi di topo

Le analisi sono state eseguite come precedentemente pubblicato.²⁸In breve, la piattaforma analitica utilizza un sistema di cromatografia liquida ad altissime prestazioni Vanquish (Thermo Fisher Scientific) accoppiato online a uno spettrometro di massa Q Exactive (Thermo Fisher Scientific).

Cistanche trattare la malattia renale causata da anemia

Analisi statistiche

I dati sono forniti come mezzi aritmetici SEM o come mediana con intervallo interquartile (25 ° -75 ° percentile) con n che rappresenta rispettivamente il numero di animali utilizzati o pazienti inclusi. I dati sono stati testati per la normalità con il test kolmogorov-Smirnov, il test D'Agostino e il test Shapiro-Wilk. Le varianze sono state analizzate dal test di Bartlett per variazioni uguali. Il posttest di confronto multiplo Tukey o Dunn, il t-test Student non accoppiato o il test Mann-Whitney U sono stati eseguiti da GraphPad Prism 8 (GraphPad Software). P< 0.05="" with="" 2-="" tailed="" testing="" was="" considered="" statistically="" significant.="" additional="" graphs="" were="" plotted="" through="" graphpad="" prism="">

RISULTATI

La malattia renale proteinurica sperimentale induceanemianei topi Dopo l'induzione, i topi 129S1/SvImJ con din e Nphs2Dipod hanno sviluppato proteinuria nefrosica (Figura 1a e Figura supplementare S2C) e insufficienza renale progressiva caratterizzata da elevati livelli plasmatici di urea dal giorno 20 in poi (Figura 1b e Figura supplementare S2D). Durante i primi 10 giorni, i topi hanno sperimentato un aumento di peso corporeo con ascite (Figura 1c e Figura supplementare S2E), riflettendo la ritenzione di sodio causata dall'escrezione di serina proteasi o proteinuria.¹⁸Dopo l'inversione spontanea della ritenzione di sodio, questi topi hanno costantemente perso peso. Nei topi con DIN e nei topi Nphs2Dipod, le immagini al microscopio ottico, catturate dopo 10 giorni, hanno rivelato tipici cambiamenti istomorfologici coerenti con la sclerosi glomerulare segmentale focale (Figura 1d e Figura supplementare S2B). Questi erano assenti nei topi C57BL/6 iniettati con doxorubicina (Figura 1d). Il trattamento con doxorubicina ha indotto un forte calo dell'emoglobina, della conta dei globuli rossi e dell'ematocrito (Figura 1e-g) dal giorno 10 in poi nei topi 129S1/SvImJ e C57BL/6, che in questi ultimi sono stati normalizzati ai giorni 20 e 30. Al contrario, nei giorni 20 e 30, i topi con iniezione di doxorubicina 129S1/SvImJ e podocin-carenti hanno sviluppato progressi progressivianemia, caratterizzata da ridotto volume corpuscolare medio (Figura 1h) e ridotta emoglobina (Figura supplementare S2F), suggerendo cheanemiaè associato a insufficienza renale progressiva e non al trattamento con doxorubicina per vedere.

Figura 1 | Funzione renale e anemia conclamata nei topi 129S1/SvImJ iniettati con doxorubicina.(a–d) I topi 129S1/SvImJ iniettati con doxorubicina hanno sviluppato (a) elevata proteinuria, (b) aumento progressivo della concentrazione plasmatica di urea, (c) aumento transitorio del peso corporeo e (d) tipici cambiamenti istomorfologici indicativi della sclerosi glomerulare segmentale focale al giorno 10 (colorazione periodica acido-Schiff; bar 1/4 10 mm). (e–h) Inoltre, questi topi hanno sviluppatoanemiariflfzionato da (e) un livello di emoglobina diminuito, (f) numeri più bassi di globuli rossi (RBC), (g) livelli di ematocrito diminuiti e (h) diminuzione del volume corpuscolare medio. (a–d) I topi C57BL/6 iniettati con doxorubicina non hanno mostrato alcun segno di danno renale e (e–g)anemiail giorno 10 è stato normalizzato nei giorni 20 e 30. Aritmetica significa che vengono mostrati SEM. *P< 0.05,="" **p="">< 0.01,="">< 0.001,and="" ****p="">< 0.0001="" indicate="" signifificant="" difference="" between="" healthy="" 129s1/svimj="" and="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" mice;="" #p=""><0.05, ##p="">< 0.01,="" ###p="">< 0.001,="" and="" ####p="">< 0.0001="" indicate="" signifificant="" difference="" to="" the="" baseline="" of="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" mice;="" and="" §p="">< 0.05,="" §§p="">< 0.01,="" §§§p="">< 0.001,="" and="" §§§§p="">< 0.0001="" indicate="" signifificant="" difference="" between="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" and="" doxorubicin-injected="" c57bl/6="" mice.="" crea,="">

L'anemia nella malattia renale proteinurica sperimentale non è causata da eritropoiesi compromessa

Entrambi i modelli murini anemici hanno mostrato un aumento significativo della percentuale di reticolociti circolanti (Figura 2a e Figura supplementare S3C). Le concentrazioni plasmatiche di EPO sono aumentate drasticamente al giorno 10 in 129S1/SvImJ con DIN e topi sani C57BL/6, ma sono state nuovamente normalizzate nei giorni 20 e 30 (Figura 2b). Nei topi carenti di podocin, le concentrazioni plasmatiche di EPO sono aumentate al giorno 10 e sono rimaste aumentate ai giorni 20 e 30 (Figura supplementare S2H). Nelle analisi istologiche del midollo osseo e della milza, il numero di cellule precursori eritroidi rispetto ai precursori mieloidi è aumentato al giorno 30 (Figura 2d-g), indicando l'eritropoiesi stimolata nei topi anemici 129S1/SvImJ con DIN.

Figura 2 | L'eritropoiesi è stimolata nei topi 129S1/SvImJ iniettati con doxorubicina con anemia.a)Anemianei topi 129S1/SvImJ iniettati con doxorubicina si sono verificati nonostante l'aumento del numero di reticolociti ai giorni 20 e 30. (b) La concentrazione plasmatica di eritropoietina è risultata fortemente aumentata al giorno 10 nei topi 129S1/SvImJ e C57BL/6 iniettati con doxorubicina, ma è stata nuovamente normalizzata nei giorni 20 e 30. (c–e) Quantificazione del numero assoluto di (c) cellule mieloidi e (d) eritroidi nel midollo osseo. Il rapporto (e) tra cellule mieloidi ed eritroidi in topi 129S1/SvImJ sani e iniettati con doxorubicina nel midollo osseo ha mostrato un numero maggiore di cellule precursori eritroidi nei topi 129S1/SvImJ iniettati con doxorubicina al giorno 30. (f,g) L'istologia (f) della milza e (g) del midollo osseo ha mostrato un aumento delle cellule precursori eritroidi, osservate anche a ingrandimenti inferiori, nei topi 129S1/SvImJ iniettati con doxorubicina (pannelli di destra) rispetto ai topi sani (pannelli di sinistra) al giorno 30. (f,g) L'immunoistochimica Ter119 (pannelli inferiori) ha supportato i risultati dell'ematossilina e dell'eosina (H & E). Ter119 è positivo nei precursori eritroidi (cellule nucleate) e nei globuli rossi (cellule nonnucleate). Barra 1/4 100 mm; inserti 1/4 25 mm. Aritmetica significa che vengono mostrati SEM. *P< 0.05,="" **p="">< 0.01,="" and="" ***p="">< 0.001="" indicate="" significant="" difference="" between="" healthy="" 129s1/svimj="" and="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" mice;="" ##p="">< 0.01="" and="" ####p="">< 0.0001="" indicate="" significant="" difference="" to="" baseline="" of="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" mice;="" and="" §p="">< 0.05,="" §§p="">< 0.01,="" and="" §§§§p="">< 0.0001="" indicate="" significant="" difference="" between="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" and="" doxorubicin-injected="" c57bl/6="">

Vantaggi diCistanche: trattare le malattie renali e migliorare la funzione renale

La ridotta durata della vita dei globuli rossi è la causa principale dell'anemia nella malattia renale proteinurica sperimentale

L'esternalizzazione di PS sul foglietto esterno della membrana plasmatica RBC è un indicatore di morte cellulare e un promotore di eritrofagocitosi.¹⁴La morte cellulare RBC è stata quantificata utilizzando analisi di selezione cellulare attivate dalla fluorescenza della PS superficiale legata all'annessina fluorescente legata al V.¹⁴Nel sangue appena prelevato, la percentuale di cellule che espongono al PS era >4 volte superiore al giorno 20 nei topi con DIN (4,16% e 0,86%) rispetto ai topi sani (1,00% e 0,11%) (Figura 3a). Allo stesso modo, i topi Nphs2Dipod hanno mostrato un aumento approssimativo di 2 volte dell'esposizione al PS (1,27% e 0,20%) rispetto ai topi sani (0,58% e 0,05%) al giorno 30 (Figura supplementare S3A). È noto che i globuli rossi vengono eliminati dalla circolazione dai macrofagi residenti nella milza.17 Questa osservazione può, quindi, spiegare il più alto rapporto milza/peso corporeo dei topi Nphs2Dipod (Figura supplementare S2G), in cui il doppio dei globuli rossi viene degradato rispetto ai topi sani C57BL/6. Poiché la proteinuria nefrosica porta alla disproteinemia,29 abbiamo ulteriormente studiato se una maggiore morte delle cellule RBC possa essere stimolata da un componente nel plasma dei topi con DIN. Come illustrato nella Figura 3b, l'esposizione alla PS ai giorni 10 e 20 è stata due volte più alta dopo l'incubazione (30 minuti a 37^OC) di globuli rossi sani nel plasma di topi 129S1/SvImJ iniettati con doxorubicina rispetto all'incubazione nel plasma di topi sani. Afflusso di Ca2þ nei globuli rossi, mediato da canali cationici non selettivi voltaggio-dipendenti e indipendenti dalla tensione,^30,31è uno dei regolatori chiave della morte cellulare RBC. Nei globuli rossi raccolti ai giorni 20 e 30 da topi 129S1/SvImJ con DIN, le concentrazioni intracellulari di Ca2þ sono aumentate (Figura 3c); questo fenomeno è stato ricapitolato nei topi Nphs2Dipod al giorno 20 (Figura supplementare S3B). In entrambi i modelli murini, c'è stata una significativa correlazione negativa della percentuale di globuli rossi PS-positivi, con la gravità dianemiariflessi dai livelli di emoglobina (Figura 3d e Figura supplementare S3D). Inoltre, vi è stata una correlazione significativa con il danno renale riflesso dalla concentrazione plasmatica di urea (Figura 3e e Figura supplementare S3E) e in misura minore con la proteinuria (Figura 3f e Figura supplementare S3F). Per compensare la perdita di globuli rossi inanemia, la formazione di nuovi globuli rossi è stata stimolata in entrambi i topi, come indicato dall'aumento della percentuale di reticolociti circolanti, ed è stata significativamente correlata con l'entità dei globuli rossi esposti alla PS (Figura 3g e Figura supplementare S3G).

Figura 3 | I topi con nefropatia indotta da doxorubicina sviluppano una maggiore morte dei globuli rossi (RBC) mediata da un aumento dei livelli di calcio intracellulare.(a) L'esternalizzazione della fosfatidilserina (PS), che riflette la morte dei globuli rossi, è stata migliorata nei giorni 20 e 30 dopo l'induzione della nefropatia indotta da doxorubicina. (b) L'incubazione di globuli rossi sani nel plasma assunto nei giorni 10 e 20 da questi topi ha portato all'esternalizzazione della PS. (c) L'esternalizzazione della PS è stata accompagnata da un aumento dei livelli di calcio intracellulare dei globuli rossi assunti nei giorni 20 e 30 dopo l'induzione. (d–g) La (d) percentuale di globuli rossi che espongono alla PS era correlata con i livelli di emoglobina, il danno renale indicato da (e) concentrazione plasmatica di urea e (f) proteinuria, nonché con (g) formazione di reticolociti. (d–g) I dati includono ogni punto temporale (0, 10, 20 e 30 giorni) di ogni topo sano 129S1/SvImJ e 129S1/SvImJ con nefropatia indotta da doxorubicina. Aritmetica significa che vengono mostrati SEM. **P< 0.01,="" ***p="">< 0.001,="" and="" ****p="">< 0.0001="" indicate="" significant="" difference="" between="" healthy="" 129s1/svimj="" and="" doxorubicin-injected="" (in.)="" 129s1/svimj="" mice;="" #p="">< 0.05,="" ##p="">< 0.01,="" and="" ####p="">< 0.0001="" indicate="" significant="" difference="" to="" baseline="" of="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" mice;="" and="" §§§§p="">< 0.0001="" indicate="" significant="" difference="" between="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" and="" doxorubicin-injected="" c57bl/6="" mice.="" crea,="" creatinine;="" mfi,="" mean="" fluorescence="">

Vantaggi diCistanche: trattare le malattie renali e migliorare la funzione renale

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