In che modo l'estratto di Cistanche riduce l'iperplasia infiammatoria

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Riduzione dell'iperplasia infiammatoria nell'intestino nei topi inclini al cancro del colon mediante estratto acquoso di Cistanche deserticola

Yamin Jia,1,2 et al

Cistanchedeserticola è stata comunemente usata nella medicina tradizionale cinese per trattare molti problemi di salute tra cui la sindrome dell'intestino irritabile o la stitichezza. Questo studio è stato progettato per testare l'efficacia di un estratto acquoso di C. deserticola nella prevenzione del cancro del colon-retto in un modello murino. L'estratto di acqua ricca di polisaccaridi di C. deserticola è stato preparato facendo bollire la sua polvere di stelo in acqua distillata. I topi nulli Tgfb1Rag2 sono stati usati come modello sperimentale. Qui abbiamo dimostrato che l'alimentazione dell'estratto di acqua di C. deserticola ha ridotto significativamente il numero di mucoseiperplasiae infezione intestinale da Helicobacter nei topi. Questo effetto benefico è correlato con una significativa stimolazione del sistema immunitario, evidenziata dall'ingrossamento della milza con un aumento del numero di macrofagi splenici e cellule natural killer, e con una più potente citotossicità degli splenociti. L'estratto di acqua in vitro di C. deserticola ha migliorato la citotossicità degli splenociti naïve contro una linea cellulare di cancro del colon umano e nelle colture di macrofagi ha sovraregolato l'espressione dell'ossido nitrico sintasi II e stimolato la fagocitosi. In conclusione, i nostri dati indicano che la somministrazione orale dell'estratto di C. deserticola si riduceinfiammatorioiperplasticopolipi ed infezione da helicobacter nei topi per la sua attività immunostimolante, suggerendo che l'estratto di C. deserticola potrebbe avere il potenziale per prevenire i disturbi dell'infiammazione intestinale, incluso il cancro del colon-retto. Copyright © 2011 John Wiley & Sons, Ltd.

Parole chiave: immunomodulazione a base di erbe;Cistancheestratto; polisaccaridi; elicobatterio;infiammatorioiperplasia; cancro colorettale.

Cistancheestrattopuò ridurreinfiammatorioiperplasia

INTRODUZIONE

Il cancro del colon-retto è il terzo tumore più comune negli uomini e il secondo nelle donne in tutto il mondo e si classifica come la quarta causa di morte per cancro più comune (8% di tutti i decessi per cancro; Ferlay et al., 2010). Studi epidemiologici suggeriscono che molti fattori di rischio associati a questa malattia, inclusi fattori genetici (es. storia familiare di cancro al colon) (Strate e Syngal, 2005) e dietetici (es. carne rossa e basso contenuto di fibre; Chao et al., 2005; Park et al., 2005), einfiammatoriomalattie intestinali (IBD; Eaden et al., 2001; von Roon et al., 2007; Lukas, 2010). Ad oggi, nonostante i numerosi nuovi farmaci citotossici e il miglioramento delle tecniche chirurgiche e radioterapiche utilizzate per il trattamento di questa malattia (Cunningham et al., 2010), un'ampia percentuale di pazienti con cancro del colon-retto rimane ancora incurabile; circa 608000 decessi per questa malattia sono stimati in tutto il mondo nel 2008 (Ferlay et al., 2010). Quindi, sono necessarie nuove terapie e un candidato è l'immunoterapia. Vari approcci immunoterapici sono stati valutati per il trattamento del cancro del colon-retto e i risultati finora sono incoraggianti (Burgdorf et al., 2009). È stato dimostrato che i polisaccaridi vegetali hanno attività immunoregolatorie specifiche (Jiang et al., 2010), suggerendo che questi prodotti erboristici potrebbero essere usati come adiuvanti immunostimolanti specifici contro il cancro del colon-retto.

Cistanchedeserticola Ma, noto come Rou Cong Rong nella medicina erboristica cinese, è stato incluso nelle formule a base di erbe per molti problemi di salute, tra cui impotenza, leucorrea morbosa e sindrome/stitichezza dell'intestino irritabile (Jiang e Tu, 2009). Studi sperimentali hanno rivelato diverse attività biologiche da parte di diversi estratti di C. deserticola; l'estratto di glicosidi feniletanoidi di questa erba ha attività antifatica nei topi (Cai et al., 2010) e analgesica e anti-infiammatorioeffetti nei roditori (Lin et al., 2002), mentre i suoi polisaccaridi stimolano la proliferazione dei linfociti T e B nelle colture di linfociti (Wu et al., 2005; Dong et al., 2007). Tuttavia, l'efficacia dell'estratto di polisaccaridi di C. deserticola nella stimolazione della risposta immunitaria in vivo non è stata ancora esaminata.

Rag2^-/-i topi mancano di linfociti T e B maturi e sullo sfondo misto (~97% 129 S6 e ~3% CF-1) sviluppano spontaneamente l'infiammazione associataiperplasianell'intestino (Engle et al., 1999). L'introduzione genetica dell'allele nullo Tgfb1 (gene del fattore di crescita b1 (TGF-b1)) a questo ceppo di topi provoca un'ulteriore progressione diiperplasiaad adenoma e carcinoma (Engle et al., 2002) e la colite patogena microflora-dipendente è necessaria per lo sviluppo del cancro del colon (Engle et al., 2002), suggerendo che questo ceppo di topi fornisce un modello ideale per l'esame di una potenziale terapia nel trattamento dell'infiammazione/cancro colorettale indotto da IBD. In questo studio, dimostriamo per la prima volta l'efficacia dell'estratto acquoso ricco di polisaccaridi di C. deserticola nella riduzione diinfiammatorioiperplasiain questo modello.

MATERIALI E METODI

Estratto acquoso ricco di polisaccaridi del preparato di C. deserticola.

Herbal C. deserticola è stata raccolta dal Dr. Y. Guo (China Agricultural University) nella regione autonoma della Mongolia Interna, in Cina. La polvere di steli interi essiccati (300 g) è stata fatta bollire in acqua bidistillata due volte: prima per 1 ora in 500 mL di acqua, seguita da una raccolta del supernatante, poi per 45 minuti in 400 mL di acqua. I supernatanti sono stati filtrati attraverso una carta da filtro Whatman (medio veloce) dopo ogni tempo di ebollizione e raggruppati insieme. La soluzione di estratto è stata essiccata mediante liofilizzazione ed è stata mantenuta a 80°C. Il prodotto finale era di circa 10 g (resa: ~3 percento).

Topi e colture cellulari. Topi carenti di TGF-b1 (Tgfb1 plus /- Rag2^-/-) sullo sfondo misto (~97% 129 S6 e ~3% CF-1) sono stati ricevuti da una colonia riproduttiva mantenuta in condizioni esenti da agenti patogeni nella struttura per animali del Jack Bell Research Center (Vancouver, BC). Questi topi provenivano dal Repository Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) (National Cancer Institute a Frederick, MD, USA). I topi C57BL/6 J (B6) (maschio, 8-10 settimane) sono stati acquistati dal Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA). Tutti gli animali per gli esperimenti sono stati tenuti in stabulazione e dieta convenzionali (5001 Rodent Diet, LabDiet) dopo lo svezzamento a 4 settimane di età, e il trattamento a base di erbe e la raccolta dei campioni sono stati eseguiti in conformità con le linee guida del Canadian Council on Animal Care ai sensi
protocolli approvati dall'Animal Use Subcommittee presso l'Università della British Columbia.

Sia la linea cellulare di adenocarcinoma del colon umano SW480 che la linea cellulare di macrofagi leucemici di topo RAW 246.7 sono state coltivate in Eagle's Medium modificato di Dulbecco (DMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) contenente l'10 percento di bovino fetale siero (FBS) (mezzo DMEM completo) a 37-C in un'incubatrice umidificata al 5% di CO2/95% ad aria. Gli splenociti sono stati isolati rompendo delicatamente frammenti di milza in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), seguita dalla rimozione degli eritrociti utilizzando tampone di lisi (0.15 M NH4Cl, 1,0 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH 6,8). Dopo il lavaggio di nuovo con PBS, gli splenociti sono stati sospesi nel mezzo RPMI 1640 integrato con il 10% di FBS (mezzo RPMI completo).

Cistancheestrattopuò ridurreinfiammatorioiperplasia

Estrarre il trattamento.

L'estratto di erbe, chiamatoCistancheestrattoin questo studio, è stato infine preparato mediante ricostituzione di polvere essiccata con acqua bidistillata sterilizzata e conteneva il 2–3 percento (p/p) di feniletanoidi, il 65–70 percento (p/p) di polisaccaridi e 0.6–1 percento (p/p) di proteine ​​in base ai seguenti saggi: il numero di feniletanoidi è stato determinato mediante assorbanza a 332 nm utilizzando una spettrofotometria precedentemente descritta (Ouyang et al., 2005); il contenuto di polisaccaridi è stato misurato utilizzando un metodo standard dell'acido fenolo-solforico (Dubois et al., 1956) dopo precipitazione con etanolo; e la proteina è stata determinata mediante dosaggio proteico Bio-Rad seguendo il protocollo del produttore (Bio-Rad Lab, Hercules, CA, USA). Il dosaggio dell'estratto di Cistanche era di 0,4 g/kg/giorno in base al nostro studio pilota. L'assunzione media di acqua al giorno per topo adulto era di circa 4 ml e se 1 ml di acqua da bere conteneva 3 mg diCistancheestratto, ogni topo ha ricevuto la somministrazione orale di 12 mg dell'estratto al giorno. Sulla base del fatto che il peso corporeo medio di un topo adulto era di 30 g, l'acqua da bere conteneva 3 mg/mL diCistancheestrattoha somministrato ai topi un dosaggio di 0,4 g/kg/giorno. I topi sono stati trattati somministrando acqua potabile ad labium contenente 3 mg/mL diCistancheestrattoche è stato rifornito almeno una volta ogni due giorni, dall'età di due mesi per tre mesi in una stanza convenzionale della struttura di cura degli animali.

Classificazione istologica del cancro del colon-retto.

Alla fine del trattamento di tre mesi, i tessuti intestinali sia piccoli che grandi sono stati raccolti e aperti longitudinalmente, seguiti da un lavaggio delicato del contenuto con PBS. È stato raccolto un totale di sei pezzi (ciascuno lungo 2 cm) di tessuto intestinale da ciascun topo: tre dall'intestino tenue in posizione prossimale, media e distale; due dall'intestino crasso in posizione prossimale e distale e uno dal cieco. Tutti i tessuti sono stati fissati in formalina al 10% e inclusi in paraffina. Ogni sezione è stata colorata con ematossilina ed eosina (HE) per la classificazione istologica del cancro del colon-retto. La classificazione della malattia è stata eseguita in base ai caratteri patologici diiperplasia, adenoma o carcinoma all'interno di ciascun campione, come descritto in precedenza (Engle et al., 1999) in modo cieco. Il numero totale di ogni cambiamento patologico (iperplasia, adenoma e carcinoma) è stato contato in due sezioni del tessuto intestinale per ciascun topo.

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Rilevazione di Helicobacter hepaticus (H. hepaticus) nelle feci di topo.

Per esaminare l'effetto diCistancheestrattosulla crescita della microflora patologica nell'intestino, H. hepaticus nelle feci è stato determinato mediante reazione a catena della polimerasi (PCR) con primer 16S rDNA specie-specifici come descritto in precedenza (Shames et al., 1995). Circa 200 mg di feci fresche sono stati disciolti in 1 μL di PBS e incubati a 50 gradi per 30 minuti, seguiti da centrifugazione a 8000 giri/min per 10 minuti. Il supernatante (200 mL) è stato raccolto e miscelato con una quantità uguale di soluzione di proteinasi K contenente il 5 percento (v/v) di 18,7 mg/mL di soluzione di proteinasi K (Fermentas Canada, Burlington, ON, Canada) in un tampone di digestione (50 μM Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 M EDTA, 0,5% di sodio dodecil solfato) e incubato a 70 C per 30 min. Il DNA nella soluzione risultante è stato estratto utilizzando il kit QIAprep Miniprep seguendo il protocollo del produttore (QIAGEN, Mississauga, ON, Canada).
L'amplificazione della reazione a catena della polimerasi del DNA batterico è stata eseguita in una miscela contenente {{0}},75 μL di 10 tampone PCR, 0,5μL di 50 mM MgCl2, 0,5 μL di ciascun primer (senso: 5'-GCA TTT GAA ACT GTT ACT CTG; antisenso: 5'-GGG GAGCUUGAAAACAG, 100 mM ciascuno), 0,5 μL di Taq polimerasi, 18,75 μL di H2O priva di nucleasi e 1μL di soluzione di DNA di feci non quantificata. La miscela PCR è stata riscaldata a 94 gradi per 5 minuti, seguiti da 40 cicli di denaturazione a 94 gradi per 1 minuto, ricottura a 55 gradi per 1,25 minuti ed estensione a 72 gradi per 1,5 minuti. La PCR è stata terminata con una fase di allungamento di 10 minuti a 72 gradi. Il prodotto PCR risultante (25 μL) è stato sottoposto a elettroforesi su un gel di agarosio all'1% in tampone Tris-acetato-EDTA (TAE) contenente 0,5 mg/mL di bromuro di etidio e visualizzato alla luce UV.

Determinazione dei macrofagi e delle cellule natural killer (NK).

Le percentuali di macrofagi e cellule NK in sospensione di splenociti sono state determinate mediante analisi di ordinamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS). Un milione di splenociti nel tampone FACS sono stati incubati con un'appropriata combinazione di anticorpi per diversi fenotipi di cellule nel ghiaccio: anti-CD3-isotiocianato di fluoresceina (FITC) e anti-CD49b-ficoeritrina (PE) (BD Biosciences, Mississauga, ON, Canada) per CD3 CD49b più cellule NK e anticorpo di topo F4/80 plus come anticorpo primario e IgG-FITC anti-ratto come anticorpo secondario (eBioscience, San Diego, CA, USA) per F4/80 più macrofagi. L'intensità della fluorescenza per ciascun tipo di cellula è stata misurata mediante citometria a flusso e analizzata per confronto con i controlli di fondo utilizzando il software CELLQUEST (BD Biosciences).

Saggio di citotossicità calcina-acetossimetil (calceina-AM).

L'attività litica degli splenociti effettori contro le cellule SW480 bersaglio è stata valutata mediante saggio di citotossicità della calceina-AM utilizzando un sistema di co-coltura come descritto in precedenza (Neri et al., 2001). In breve, le cellule SW480 sono state etichettate con colorante fluorescente calceina-AM come segue: 1 x10⁶le cellule/mL di cellule SW480 nel mezzo DMEM completo sono state incubate con 15 μM di calceina-AM a 37 gradi con agitazione occasionale. Dopo 30 minuti di incubazione, le cellule sono state ampiamente lavate con un mezzo DMEM completo per rimuovere il colorante extracellulare. Le cellule SW480 marcate con colorante fluorescente nel mezzo DMEM completo (0,2 x 10⁶cellule/{{0}}.25 ml/pozzetto) sono stati seminati in 24-piastre a pozzetti. In base ai diversi rapporti (12:1, 6:1, 3:1 e 1,5:1) di E (effettore): T (bersaglio), splenociti in 0.25 ml di terreno RPMI completo per pozzetto sono stati aggiunti ai pozzetti con cellule bersaglio in triplicato. Le co-colture sono state incubate a 37 gradi nel 5% di CO2 per 24 ore. I surnatanti sono stati raccolti dopo che la piastra è stata centrifugata a 2000 rpm per 5 min. Il rilascio di calcio-AM al surnatante è stato determinato utilizzando uno spettrofluorimetro a micropiastre (Fluoroskan Ascent FL, Thermo Labsystems) a un'emissione di 527 nm sotto eccitazione a 485 nm. Le cellule bersaglio, incubate con una miscela di 0,25 mL di mezzo DMEM completo e 0,25 mL di mezzo RPMI completo, sono state utilizzate come controlli di fondo o a rilascio spontaneo e, in presenza del 2%, è stato utilizzato Triton X-100 come controlli di massimo rilascio. La citotossicità degli splenociti è stata calcolata come segue:

Misurazione dell'ossido nitrico (NO). L'ossido nitrico secreto dalle cellule è stato rapidamente ossidato a nitrito nel mezzo di coltura. Pertanto, le concentrazioni di nitrati nel mezzo sono state determinate utilizzando il metodo di Griess come misura della produzione di NO. Celle RAW264.7 (0.25 x 10⁶

cellule/pozzetto in 0,5 ml di mezzo DMEM completo) in 24-piastre a pozzetti sono state stimolate conCistancheestratto(50–200 mg/mL) e lipopolisaccaride (LPS) (10 ng/mL) come controllo positivo. Dopo 24 ore di trattamento, 50 ml di surnatante di coltura sono stati prima miscelati con 50 ml di 1%
sulfanilamide in acido fosforico al 5% in 96-piastre a pozzetti in triplicato e sono state incubate per 10 min, quindi sono stati aggiunti 50 ml di naftil etilendiammina dicloridrato allo 0,1% in acqua distillata per pozzetto. L'assorbanza è stata letta a 550 nm dopo incubazione per 10 minuti e il livello di NO/nitrito è stato calcolato utilizzando una curva standard con concentrazioni note di nitrito di sodio.

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Macchia occidentale.

I livelli cellulari di ossido nitrico sintasi II (NOS 2 o iNOS) sono stati esaminati mediante Western blot come descritto in precedenza (Du et al., 2006). In breve, i campioni di proteine ​​(circa 100 mg/campione) sono stati frazionati del 7% di SDS-PAGE e sono stati trasferiti sulla membrana di nitrocellulosa. Le bande proteiche NOS II sono state identificate con l'anticorpo primario policlonale di coniglio anti-NOS II (N-20) (diluizione 1:500; Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA, USA) e l'anticorpo secondario IgG di capra anti-coniglio ( diluizione 1:10000; Vector Laboratory, Burlingame, CA, USA). Il complesso proteina-anticorpo NOS II è stato visualizzato mediante un saggio di chemiluminescenza potenziato (ECL, Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, Inghilterra). Le macchie sono state riproposte utilizzando IgG anti-b-actina (Sigma-Aldrich Canada, Oakville, ON, Canada) per la conferma della proteina caricata in ciascun campione.

Saggio di fagocitosi. La fagocitosi è stata misurata dalla quantità di sfere di lattice marcate con fluorescenza (SigmaAldrich Canada, L-3030, modificate con carbossilato, dimensione media 2 mm) inghiottite dalle cellule RAW264.7 come descritto in precedenza (Wu et al., 2{{ 9}}07). In breve, le cellule RAW264.7 (0,1 106 cellule/0,5 mL/pozzetto) nel mezzo DMEM completo sono state seminate in 24-piastre a pozzetti e stimolate con 100 mg/mL diCistancheestrattoo completare il supporto DMEM solo come controllo. Dopo la stimolazione notturna, 2,5 mL di sfere di lattice fluorescenti per pozzetto sono stati aggiunti alle colture di macrofagi e incubati per 2 ore. Per l'analisi della citometria a flusso, le cellule sono state staccate mediante pipettaggio dopo il lavaggio in PBS e l'intensità della fluorescenza delle cellule fagocitiche è stata misurata da un citometro a flusso e analizzata per confronto con i controlli di fondo (senza sfere) utilizzando il software CELLQUEST (BD Biosciences).

Analisi statistica.

I dati sono stati presentati come media più deviazione standard (DS). L'analisi della varianza (ANOVA) o il test t di Student è stata eseguita in modo appropriato per confrontare i dati tra i gruppi. Un p-value di < 0.05="" è="" stato="" considerato="">

RISULTATI

Trattamento conCistancheestrattoriduce la frequenza diiperplasiae infezione intestinale da H. hepaticus Durante il periodo di trattamento (3 mesi), il peso corporeo e l'assunzione di acqua potabile sono stati monitorati una volta ogni 2 giorni nei topi del gruppo trattato con l'estratto rispetto al gruppo trattato con il veicolo, nessuna differenza significativa è stata annotato (dati non mostrati). L'analisi istologica, tuttavia, ha mostrato che la somministrazione orale diCistancheestrattiridotto significativamente il numero diinfiammatorioiperplasianell'intestino (Fig. 1), evidenziato dal fatto che i topi che ricevevano acqua con estratto ne avevano menoiperplasia(5.00 più -2.83/topo, n=15) rispetto a quelli che bevono acqua naturale o veicolo (7,53 più -3.09/topo, n {{9 }}) (estratto vs. veicolo: p=0.0133, t-test). La differenza nel numero di adenoma e carcinoma tra i topi trattati con estratto e veicolo non era statisticamente significativa perché solo pochi topi avevano queste fasi di cambiamenti patologici (dati non mostrati).

Figura 1. Riduzione dell'incidenza di iperplasia mediante trattamento con estratto acquoso di C. deserticola (Cistancheestratto). Tgfb1 plus /-Rag2-/- sono stati nutriti con topiCistancheestrattoin acqua potabile (gruppo Estratto) rispetto a quelli con sola acqua potabile (gruppo Veicolo). Le lesioni cancerose nell'intestino sono state esaminate dall'istologia con una colorazione H&E. (A) Un'immagine tipica della sezione del tessuto sano. (B) Un'immagine tipica dell'iperplasia nella sezione, indicata da una freccia. (C) Il numero di iperplasia nell'intestino di ciascun animale è stato contato dall'istologia (p=0.0133, estratto rispetto al veicolo, n=15). Questa figura è disponibile a colori online su wileyonlinelibrary.com/journal/ptr

È stato dimostrato che il contenuto microbico intestinale, in particolare l'infezione da H. hepaticus, è necessario per lo sviluppo di tutti gli stadi del cancro del colon, inclusa l'iperplasia in Rag2^-/- topi (Engle et al., 2002; Erdman et al., 2003). Per esaminare se il trattamento conCistancheestrattiridotta microflora patologica nell'intestino, presenza di H. hepaticus nelle feci dei topi trattati conCistancheestrattoè stato determinato mediante PCR rispetto ai controlli del veicolo. In ogni esperimento, tre topi per gabbia sono stati trattati con estratto o veicolo di Cistanche. I campioni di feci sono stati raccolti al termine di un periodo di 14-h durante la notte dopo la pulizia della gabbia. Come mostrato in Fig. 2, l'rDNA di H. hepaticus 16S nelle feci è stato efficacemente rilevato dalla tecnica PCR. In tre esperimenti separati (Tabella 1), solo il 20-40 percento dei campioni daCistanche-estratto- i topi trattati sono stati rilevati come positivi alla PCR, mentre il 60-80% dei controlli del veicolo era positivo (estratto vs. veicolo: p=0.0189, t-test, n=3), suggerendo che il trattamento con L'estratto di Cistanche ha ridotto l'infezione intestinale da H. hepaticus nei topi.

Il trattamento con estratto di Cistanche aumenta il numero di macrofagi splenici e cellule NK

La risposta immunitaria gioca un ruolo chiave nell'eliminazione dell'infezione da helicobacter. Per esaminare seCistanche estrattoil trattamento ha influenzato il sistema immunitario in questi topi inclini al cancro del colon, alla fine del trattamento è stata determinata la dimensione della milza (12 topi in ciascun gruppo) e il numero di splenociti (sei topi selezionati casualmente da ciascun gruppo). Le milze di 12 topi in ciascun gruppo sono state pesate, gli altri tre topi nell'esperimento iniziale non sono stati inclusi. Come illustrato nella tabella 2,Cistanche-estrattoi topi trattati (0.055 più -0,022 g/milza) erano più pesanti rispetto al gruppo del veicolo (0,038 più -0,01 g/milza; estrarre rispetto al veicolo: p=0.04, t-test). Questi dati sono stati ulteriormente supportati da un aumento del numero di splenociti nei topi trattati conCistancheestratto, indicato da 7.095 più -1.353 (x10⁶ cellule/milza) rispetto a 2,941 più -1,492 (x10⁶cellule/milza) topi di controllo all'interno del veicolo (estratto vs. veicolo: p=0.002, t-test).

Per valutare ulteriormente seCistancheestrattoil trattamento ha interessato un particolare sottotipo di splenociti nei topi, il numero di cellule NK spleniche (CD3^-CD49b^piùcellule) e macrofagi (FT/80^piùcellule) è stato contato mediante analisi FACS. La percentuale di CD3^-CD49b^piùcellule negli splenociti diCistanche-estrattotopi trattati (32,06 più -2,13 percento) non era significativamente diverso da quello dei topi trattati con veicolo (28,47 più -2,74 percento; estratto vs. veicolo: p=0. 3741, t-test, n=6), ma il numero totale di cellule NK nella milza diCistanche-estrattotopi trattati (2,22 più - 0.44x10⁶/spleen) era superiore a quel gruppo di controllo a bordo del veicolo (0.83 più -0.17x10⁶/milza; estratto vs. veicolo: p=0.01, t-test, n=6; Fig. 3B). Risultati simili sono stati osservati nell'esame delle cellule spleniche FT/80 plus; come nella popolazione di cellule NK spleniche, la differenza nella percentuale di cellule FT/80 più spleniche tra topi trattati con estratto (35,25 più -7,28 percento) e topi di controllo del veicolo (31,74 più -5. 07 percento) non era significativo (estratto vs. veicolo: p=0.407, n=6), ma il numero totale di macrofagi splenici nel gruppo trattato con estratto (2,439 più -0 .452x10⁶cellule/milza) era superiore a quello dei gruppi di controllo (1,114 più -0,685x10⁶cellule/milza; estratto vs. veicolo: p=0.001, t-test, n=6; Fig. 3D). Presi insieme, questi dati suggeriscono che il trattamento conCistancheestrattopuò aumentare il numero totale, ma non la percentuale o la proporzione, dei sottotipi di splenociti effettori, cellule NK e macrofagi nella milza.

Figura 3. Aumento del numero di cellule NK spleniche e macrofagi dal trattamento conCistancheestratto. Le cellule NK o i macrofagi in sospensione di splenociti sono stati determinati mediante analisi FACS con una colorazione combinata di anticorpi FITC-anti-CD3e e marcatore di cellule APC-anti-CD49b/Pan-NK (per cellule NK) o con una singola colorazione di FITC-anti- FT/80 (per i macrofagi). (A) Un grafico rappresentativo della percentuale di cellule NK spleniche (CD3^-CD49b^più) negli splenociti dei topi trattati conCistancheestrattocontro veicolo. (B) Il numero totale di cellule NK per milza. I dati sono presentati come media più -SD in ciascun gruppo (p= 0.01, n= 6). (C) Un grafico rappresentativo della percentuale di macrofagi splenici (FT/80 plus) negli splenociti di topi trattati conCistancheestrattocontro veicolo. (D) Il numero totale di macrofagi per milza. I dati sono presentati come media più -SD in ciascun gruppo (p= 0.001, n=6).

Il trattamento con estratto di Cistanche stimola la citotossicità degli splenociti in vivo e in vitro

La risposta immunitaria dipendeva non solo dal numero di splenociti ma anche dalla loro funzione, come la citotossicità. L'effetto diCistancheestrattoil trattamento sulla funzione degli splenociti (es. citotossicità) è stato esaminato in co-colture con cellule SW480. Come mostrato in Fig. 4A, la citotossicità degli splenociti dei topi trattati conCistancheestrattoera superiore a quella delle cellule di topi trattati con veicolo, indicata da 39,38 più -2,64 percento del rilascio di calceina-AM nelle co-colture di splenociti trattati con estratto con cellule SW480 a 6 Rapporto :1, 51,11 più -2,6 percento con un rapporto di 3:1 e 57,33 più -2,53 percento con un rapporto di 1,5:1, rispetto a 27.75- 0.18 percentuale nelle co-colture di splenociti trattati con veicolo con cellule SW480 con un rapporto 6:1, 40.97 =-2.85% con un rapporto 3:1 e 45,16 più -0.18% con un rapporto Rapporto 1,5:1 (estratto vs. veicolo: p < 0,0001,="" anova="" a="" due="" vie).="" per="" confermare="" ulteriormente="" l'effetto="" stimolante="">Cistancheestrattosulla citotossicità degli splenociti, la citotossicità diCistanche-estrattosplenociti naïve trattati da topi B6, contenenti cellule T e B funzionali, sono stati esaminati nelle co-colture con cellule SW480. Come mostrato in Fig. 4B, aggiunta diCistancheestratto(100 mg/mL) ha aumentato significativamente il rilascio di calceina-AM nelle co-colture in modo dipendente dagli splenociti: 57,64 più -3,41 percento con un rapporto 12:1, 52,25 più { {11}},77 percento con un rapporto di 6:1 e 45,72 più -2,43 percento con un rapporto di 3:1, rispetto a 14,36 più -0,05 percento con un rapporto di 12:1 , 20,67 più -2,03 percento con un rapporto di 6:1 e 23,1 più -3,73 percento con un rapporto di 3:1 in co-colture non stimolate (estratto vs. veicolo: p < 0,0001,="" due="" -via="" anova).="" questi="" risultati="" lo="">Cistancheestrattostimola l'attività litica degli splenociti. Il motivo per cui è stata osservata una minore citotossicità quando sono stati aggiunti più splenociti effettori è sconosciuto. Una possibilità era che il livello di rilascio di calceina-AM in questo sistema di co-coltura potesse non riflettere esattamente la morte cellulare bersaglio perché la calceina-AM potrebbe essere riassorbita dagli splenociti effettori dopo un lungo periodo di incubazione.

L'estratto di Cistanche attiva i macrofagi

L'attivazione dei macrofagi è una delle risposte immunitarie critiche contro lo sviluppo di infezioni e tumori (Mantovani et al., 2002, 2008). Per rivelare ulteriormente la comprensione dei meccanismi attraverso i qualiCistancheestrattotrattamento ridotto iperplasia intestinale e contenuto microbico, l'effetto diCistancheestrattosulla produzione di NO e sulla fagocitosi dei macrofagi, sono state esaminate le cellule RAW264.7. Come mostrato in Fig. 5A, l'espressione proteica di NOS II è stata sovraregolata nelle colture dopo l'incubazione conCistancheestratto. Questi risultati sono stati ulteriormente supportati dall'aumento della produzione di NO inCistanche stimolato con estrattocolture (Fig. 5B), evidenziato da 3,88 più -0,13 mM di nitrito in 50 mg/mL diCistancheestrattocolture cellulari RAW264.7 stimolate rispetto a 0.11 più -0.12 mM di nitrito in colture di controllo non stimolate (ANOVA unidirezionale, p<>

La fagocitosi è un processo cellulare di inglobamento di particelle solide, come i batteri. Come mostrato in Fig. 5C e D, l'aggiunta diCistancheestrattifagocitosi dei macrofagi stimolati, come indicato da più cellule fagocitiche (9,8 più -0,1 percento) che si trovano inCistanche-estratto-colture di macrofagi stimolate rispetto a quelle (5,2 più -0,4 percento) in colture stimolate da veicolo (estratto vs. veicolo: p=0.0007, t-test, n=3) dopo 2 h di incubazione. Questi dati lo suggerisconoCistancheestrattopuò attivare direttamente i macrofagi mediante la sovraregolazione della produzione locale di NO e la stimolazione della fagocitosi dei macrofagi nell'intestino dei topi.

DISCUSSIONE

Il presente studio dimostra per la prima volta che la somministrazione orale diCistancheestrattoriduce significativamente la frequenza dell'iperplasia e dell'infezione da H. hepaticus nell'intestino dei topi inclini al cancro del colon. L'effetto benefico diCistancheestrattoil trattamento è associato ad un aumento del numero e della citotossicità delle cellule NK e dei macrofagi splenici. In vitro aggiunta diCistancheestrattostimola la produzione di NO e la fagocitosi nei macrofagi. TGF-b1 carente Rag2^-/-è stato dimostrato che i topi sviluppano il cancro del colon (iperplasia, adenoma o adenocarcinoma) da 3 a 6 mesi di età ed è stato dimostrato cheinfiammatorioi focolai sono sempre associati a queste lesioni tumorigeniche (Engle et al., 1999). Ulteriori studi hanno dimostrato che in questi topi è necessario lo sviluppo del cancro del colon per la presenza dell'infezione della flora microbica patogena perché il cancro del colon viene completamente eliminato alloggiando topi in condizioni prive di germi (Engle et al., 2002) e H. hepaticus l'infezione induce anche colite e carcinoma dell'intestino crasso in Rag2-/-topi (Erdman et al., 2003). Allo stesso modo, nell'uomo, lo stato microbico e l'immunità dell'ospite sono i fattori chiave per la progressione dell'IBD (Fiocchi, 1998) ed è stato riportato che il carcinoma gastrico è associato a infezioni o infiammazioni croniche indotte da H. pylori (Parsonnet et al., 1991; El-Omar e Malfertheiner, 2001). I risultati di questi studi suggeriscono che l'infezione gastrointestinale può svolgere un ruolo fondamentale nello sviluppo del cancro del colon. Pertanto, prendere di mira l'infezione gastrointestinale può diventare una strategia terapeutica per la prevenzione o il trattamento del cancro del colon e dell'IBD. Il nostro studio dimostra per la prima volta che la somministrazione orale diCistancheestrattoriduce la frequenza diinfiammatorioiperplasianell'intestino e il numero di H. hepaticus nelle feci nei topi con carenza di TGF-b1. L'effetto benefico diCistanche estrattopuò essere dovuto alla sua attivazione dei macrofagi, come si vede da un aumento sia della produzione di NO che della fagocitosi dopo il trattamento conCistancheestratto(Fig. 5), che possono limitare la microflora patogena intestinale compreso l'helicobacter (Mantovani et al., 2002, 2008). Di conseguenza, la lesione diinfiammatorioiperplasiaè stato ridotto.

Una varietà di composti bioattivi è stata identificata negli estratti di C. deserticola inclusi glicosidi feniletanoidi e polisaccaridi (Jiang e Tu, 2009). I glicosidi feniletanoidi sono citoprotettivi, indicato dal fatto che questi composti prevengono la morte cellulare negli epatociti in coltura e nei neuroni dei granuli cerebellari (Xiong et al., 1998; Pu et al., 2003). Mentre i polisaccaridi stimolano la proliferazione dei linfociti T e B indotta dai mitogeni (Wu e Tu, 2005; Wu et al., 2005; Dong et al., 2007). È stato ben documentato che i polisaccaridi vegetali modulano la risposta immunitaria (Jiang et al., 2010).Cistancheestrattocontiene il 2-3% di feniletanoidi e il 65-70% di polisaccaridi, suggerendo che l'effetto di immunomodulazione diCistancheestrattoil trattamento potrebbe essere dovuto all'attività immunoregolatrice dei polisaccaridi, la maggior parte delle sostanze bioattive nell'estratto di Cistanche. Tuttavia, le sue cellule immunitarie bersaglio (ad es. macrofagi o cellule NK, o entrambe) e le vie molecolari richiedono ulteriori indagini. Inoltre, uno studio recente dimostra che la somministrazione di feniletanoide acetonide vegetale, uno dei feniletanoidi bioattivi nell'estratto di C. deserticola (Xiong et al., 1996; Jiang e Tu, 2009), ha un effetto benefico sulla riduzione del destrano colite indotta da solfato di sodio nei topi (Hausmann et al., 2007), evidenziando che i feniletanoidi (2-3 percento) nelCistancheestrattopuò contribuire, almeno in parte, alla sua efficacia nel decrementoinfiammatorioiperplasia, che richiede anche una valutazione in futuro.
In conclusione, il cancro del colon-retto è uno dei tumori più diffusi al mondo ed è prevenibile nella maggior parte dei casi. L'uso di estratti di erbe non tossici può offrire una strategia efficace per la prevenzione dello sviluppo del cancro del colon-retto e può anche essere applicato come chemio-adiuvante, che può favorire il miglioramento dell'efficacia antitumorale chemioterapica e/o la riduzione dell'effetto chemioterapico effetti collaterali. I dati presentati in questo studio dimostrano chiaramente che il trattamento con estratto acquoso di C. deserticola riduce l'iperplasia e l'infezione da H. hepaticus nell'intestino di topi inclini al cancro del colon. Infezione da Helicobacter o intestinoinfiammazioneiperplasiaè un fattore di rischio per lo sviluppo del cancro del colon-retto. Il nostro studio attuale indica che l'uso di questa erba può avere il potenziale per la prevenzione e il trattamento del cancro del colon-retto, in particolare per quegli individui che hanno IBD.

Riconoscimento

YM è stato supportato da una borsa di studio per studenti laureati del China Scholarship Council.

Conflitto d'interesse

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Cistancheestrattopuò ridurreinfiammatorioiperplasia

Da: 'Riduzione diinfiammatorioIperplasianell'intestino nei topi inclini al cancro del colon da acqua-estratto diCistanchedeserticola' di Yamin Jia,1,2 et al

---Copyright © 2011 John Wiley & Sons, Ltd. Phytother. ris. 26: 812–819 (2012) DOI: 10.1002/ptr.3637

RIFERIMENTI

Burgdorf SK, Nielsen HJ, Rosenberg J. 2009. Immunoterapia nel cancro del colon-retto. Scand J Gastroenterol 44: 261–268.
Cai RL, Yang MH, Shi Y, Chen J, Li YC, Qi Y. 2010. L'attività antifatica dell'estratto ricco di feniletanoidi daCistanchedesertico. Phytother Res 24: 313–315.
Chao A, Thun MJ, Connell CJ, et al. 2005. Consumo di carne e rischio di cancro del colon-retto. JAMA 293: 172–182.
Cunningham D, Atkin W, Lenz HJ, et al. 2010. Cancro colorettale. Lancetta 375: 1030–1047.
Dong Q, Yao J, Fang JN, Ding K. 2007. Caratterizzazione strutturale e attività immunologica di due polisaccaridi estraibili in acqua fredda daCistanchedeserticola YC. ma. Carboidr Res 342: 1343–1349.
Du C, Guan Q, Diao H, Yin Z, Jevnikar AM. 2006. L'ossido nitrico induce l'apoptosi nelle cellule epiteliali tubulari renali attraverso l'attivazione della caspasi-8. Am J Physiol Renal Physiol 290: F1044–1054.
Dubois M, Gilles KAJK, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. 1956. Metodi colorimetrici per la determinazione degli zuccheri di sostanze correlate. Chimica anale 28: 350–356.

Eaden JA, Abrams KR, Mayberry JF. 2001. Il rischio di cancro del colon-retto nella colite ulcerosa: una meta-analisi. Intestino 48: 526–535.
El-Omar EM, Malfertheiner P. 2001. Helicobacter pylori e cancro gastrico. Curr Opin Gastroenterol 17(Suppl 1): S24-S27.
Engle SJ, Hoying JB, Boivin GP, ​​Ormsby I, Gartside PS, Doetschman T. 1999. Il fattore di crescita trasformante beta1 sopprime il cancro del colon non metastatico in una fase iniziale della tumorigenesi. Ris. Cancro 59: 3379–3386.
Engle SJ, Ormsby I, Pawlowski S, et al. 2002. Eliminazione del cancro del colon in topi privi di fattori di crescita trasformanti-beta 1-senza germi. Ris. Cancro 62: 6362–6366.
Erdman SE, Poutahidis T, Tomczak M, et al. 2003. CD4 più CD25 più linfociti T regolatori inibiscono il cancro del colon indotto da microbi nei topi con carenza di Rag2-. Am J Pathol 162: 691–702.
Ferlay J, Shin HR, Bray F, Forman D, Mathers C, Parkin DM. 2010. Stime del carico mondiale di cancro nel 2008: GLOBOCAN 2008. Int J Cancer 127: 2893–2917.
Fiocchi C. 1998.infiammatoriomalattie intestinali: eziologia e patogenesi. Gastroenterologia 115: 182–205.
Hausmann M, Obermeier F, Carta DH, et al. 2007. Il trattamento in vivo con l'acteoside feniletanoide a base di erbe migliora l'infiammazione intestinale nella colite indotta da destrano solfato di sodio. Clin Exp Immunol 148: 373–381.
Jiang MH, Zhu L, Jiang JG. 2010. Azioni immunoregolatorie dei polisaccaridi dalla fitoterapia cinese. Expert Opin Ther Targets 14: 1367–1402.
Jiang Y, Tu PF. 2009. Analisi dei costituenti chimici inCistanchespecie. J Cromatogr A 1216: 1970–1979.
Lin LW, Hsieh MT, Tsai FH, Wang WH, Wu CR. 2002. Anti-nocicettivo e anti-infiammatorioattività causata daCistanchedeserticola nei roditori. J Etnofarmaco 83: 177–182.
Lukas M. 2010.infiammatoriomalattie intestinali come fattore di rischio per il cancro del colon-retto. Scava Dis 28: 619–624.
Mantovani A, Allavena P, Sica A, Balkwill F. 2008. Infiammazione correlata al cancro. Natura 454: 436–444.
Mantovani A, Sozzani S, Locati M, Allavena P, Sica A. 2002. Polarizzazione dei macrofagi: macrofagi associati al tumore come paradigma per i fagociti mononucleati M2 polarizzati. Tendenze Immunol 23: 549–555.
Neri S, Mariani E, Meneghetti A, Cattini L, Facchini A. 2001. Saggio di citotossicità calcina-acetossimetil: standardizzazione di un metodo che consente analisi aggiuntive su cellule effettrici e surnatanti recuperati. Clin Diagn Lab Immunol 8: 1131–1135.
Ouyang J, Wang XD, Zhao B, Wang YC. 2005. Miglioramento della produzione di glicosidi feniletanoidi diCistanchecellule deserticola coltivate in un bioreattore di trasporto aereo ad anello interno con un montante setaccio. Tecnologia dei microbi enzimatici 36: 982–988.
Park Y, Hunter DJ, Spiegelman D, et al. 2005. Assunzione di fibre alimentari e rischio di cancro del colon-retto: un'analisi aggregata di studi prospettici di coorte. JAMA 294: 2849–2857.
Parsonnet J, Friedman GD, Vandersteen DP, et al. 1991. Infezione da Helicobacter pylori e rischio di carcinoma gastrico. N Inglese J Med 325: 1127–1131.
Pu X, Song Z, Li Y, Tu P, Li H. 2003. Acteoside daCistanchesalsa inibisce l'apoptosi da parte dello ione 1-metil-4-fenilpiridinio nei neuroni dei granuli cerebellari. Planta Med 69: 65–66.
Vergogna B, Fox JG, Dewhirst F, Yan L, Shen Z, Taylor NS. 1995. Identificazione dell'infezione diffusa da Helicobacter hepaticus nelle feci in colonie di topi commerciali mediante coltura e test PCR. J Clin Microbiol 33: 2968–2972.
Strate LL, Syngal S. 2005. Sindromi da cancro colorettale ereditario. Il cancro provoca il controllo 16: 201–213.
Von Roon AC, Reese G, Teare J, Constantinides V, Darzi AW, Tekkis PP. 2007. Il rischio di cancro nei pazienti con malattia di Crohn. Dis Colon Rectum 50: 839–855.
Wu TF, Hsu CY, Huang HS, Chou SP, Wu H. 2007. L'analisi proteomica degli effetti del picnogenolo nel macrofago RAW 264.7 rivela l'induzione dell'espressione della catepsina D e il miglioramento della fagocitosi. J Agric Food Chem 55: 9784–9791.
Wu XM, Gao XM, Tsim KW, Tu PF. 2005. Un arabinogalattano isolato dai gambi diCistanchedeserticola induce la proliferazione dei linfociti in coltura. Int J Biol Macromol 37: 278–282.
Wu XM, Tu PF. 2005. Isolation and characterization of alpha-(1-->6)-glucani daCistanchedesertico. J Asian Nat Prod Res 7: 823–828.
Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Tani T, Namba T, Kadota S. 1998. Attività epatoprotettiva dei feniletanoidi daCistanchedesertico. Planta Med 64: 120–125.
Xiong Q, Kadota S, Tani T, Namba T. 1996. Effetti antiossidanti dei feniletanoidi daCistanchedesertico. Biol Pharm Bull 19: 1580–1585.