Kuwanon T e Sanggenon A isolati da Morus Alba esercitano effetti antinfiammatori regolando le vie di segnalazione NF-κB e HO-1/Nrf2 nelle cellule BV2 e RAW264.7

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Astratto: Abbiamo precedentemente studiato l'estratto metanolico della corteccia di Morus alba e caratterizzato 11 composti dall'estratto: kuwanon G(1), Kuwana E (2), Kuwana T(3), sanggenon A(4), sanggenon M(5), sanggenol A(6), mulberofuran B(7), mulberofuran G(8), moracina M(9), moracina O(10) e norartocarpanone (11). Qui, abbiamo studiato ilantinfiammatorioeffetti di questi composti sulle cellule microgliali (BV2) e sui macrofagi (RAW264.7). Tra questi, 3 e 4 hanno notevolmente inibito la produzione di ossido nitrico indotta dal lipopolisaccaride (LPS) in queste cellule, suggerendo le proprietà antinfiammatorie di questi due composti. Questi composti hanno inibito la produzione di prostaglandina E2, interleuchina-6 e fattore di necrosi tumorale-c e l'espressione dell'ossido nitrico sintasi e della ciclossigenasi inducibile-2 dopo la stimolazione con LPS. Il pretrattamento con 3 e 4 ha inibito l'attivazione della via di segnalazione del fattore nucleare kappa B in entrambi i tipi cellulari. I composti hanno anche indotto l'espressione dell'eme ossigenasi(HO)-1 attraverso l'attivazione del fattore nucleare eritroide 2-fattore 2 correlato. La soppressione dell'attività di H2O-1 ha invertito gli effetti antinfiammatori causati mediante pretrattamento con 3 e 4, suggerendo che gli effetti antinfiammatori erano regolati da HO-1. Presi insieme, 3 e 4 sono potenziali candidati per lo sviluppo di agenti terapeutici e preventivimalattie infiammatorie.

Parole chiave: Moro alba; kuwanon T; sanggenon A; BV2; celle RAW264.7; effetti antinfiammatori

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1. Introduzione

Morus alba, pianta medicinale appartenente alla famiglia delle Moraceae, è stata utilizzata nella medicina tradizionale per il trattamento di condizioni infiammatorie polmonari [1]. La sua corteccia di radice contiene vari componenti attivi come umbelliferone, scopoletina, mucine, tannini,flavonoidi(morusin, gelso, mulberrichromene, ciclomulberrin, moracin P, moracin O, mulberrofuran Q, Kuwana E e kuwanon H)[2], 2-arilbenzofurani (moracenin D, moracin P, moracin O e mulberrofuran O), e flavonoidi prenilati (licoflavone C, cyclomulberrin, neocyclomorusin, sanggenon I, morusin e Kuwana U)[3,4]. Gli estratti e i composti attivi di M. alba possono alleviare le malattie polmonari, come rivelato da studi recenti [5-7]. Oltre all'effetto farmacologico di M.alba sui polmoni, i flavonoidi isoprenilati (sanggenol Q, Kuwana T, sanggenon N, mulberrofuran G e mulberrofuran C) esercitano effetti epatoprotettivi nelle cellule HepG2 indotte da t-BHP [8]. I prenil-flavonoidi (kuwanon A, Kuwana C, Kuwana T e morusin) e i triterpenoidi (acido betulino, avail e -sitosterolo) inibiscono sostanzialmente la differenziazione degli adipociti 3T3-L1 [9]. L'idrato di morina, il principale costituente flavonoide di M. alba, allevia la compromissione della memoria cronica e imprevedibile indotta da stress, indicando che questo composto potrebbe potenziare il sistema di difesa antiossidante e inibire le vie neuroinfiammatorie [10]. Questi studi suggeriscono che i costituenti contenuti in M.alba sono potenziali candidati per il trattamento di varie malattie.

Infiammazione, una complessa risposta di autodifesa a stimoli dannosi, svolge un ruolo importante nella difesa immunitaria attraverso l'attivazione di diverse cellule immunitarie, inclusi macrofagi, monociti, leucociti, mastociti e altri tipi cellulari [11]. I macrofagi sono le cellule immunitarie più abbondanti e ampiamente distribuite nel corpo e le microglia sono macrofagi residenti nel sistema nervoso centrale (SNC)[12]. I macrofagi e le cellule microgliali sono attori chiave nella risposta infiammatoria. Possono essere attivati ​​in risposta a stimoli come lipopolisaccaridi (LPS), citochine e chemochine e indurre condizioni infiammatorie [13]. In condizioni infiammatorie, i macrofagi e le cellule microgliali eccessivamente attivati ​​causano una regolazione anormale dei mediatori pro-infiammatori (ossido nitrico (NO), prostaglandina E2(PGE,), ossido nitrico sintasi inducibile (iNOS) e ciclossigenasi (COX)-2 ) e citochine pro-infiammatorie (interleuchina (IL)-6 e fattore di necrosi tumorale (TNF)-a), attraverso l'attivazione della via di segnalazione del fattore nucleare kappa B (NF-B)[14,15]. L'aumento dei livelli di mediatori pro-infiammatori esacerba ulteriormente la progressione delle malattie infiammatorie, che aumentano ulteriormente l'attivazione dei fattori infiammatori, determinando così un circolo vizioso[16]. Pertanto, la regolazione dei mediatori dell'infiammazione è essenziale per il trattamento e la prevenzione delle malattie infiammatorie.

L'eme ossigenasi (HO)-1 è un enzima limitante la velocità che catalizza la degradazione dell'eme in biliverdina, ione ferroso (Fe2 plus) e monossido di carbonio (CO)[17]. L'induzione di HO-1 è regolata dall'attivazione del fattore nucleare correlato all'eritroide 2-fattore 2 (Nrf2). HO-1 può essere indotto in risposta allo stress ossidativo e all'infiammazione per proteggere i tessuti e mantenere l'omeostasi nel corpo[18]. Pertanto, prendere di mira l'induzione di HO-1 è una delle potenziali strategie per il trattamento delle malattie infiammatorie.

Nel nostro continuo sforzo per esplorare i candidati dai prodotti naturali per il trattamento delle malattie infiammatorie, qui presentiamo ileffetti antinfiammatoridi composti 11l isolati da M.alba in cellule BV2 e RAW264.7 indotte da LPS.

2. Risultati

2.1.Effetti di 11 composti isolati da M.alba sulla vitalità delle cellule BV2 e RAW264.7

Nello studio precedente, la corteccia della radice di M.alba è stata estratta in metanolo acquoso e gli estratti ottenuti sono stati successivamente ripartiti in EtOAc, n-BuOH e H2O2. La cromatografia su colonna ripetuta di SiO2, ODS e Sephadex LH-20 della frazione EtOAc ha fornito 11 composti, come kuwanon G(1), Kuwana E(2), Kuwana T (3), sanggenon A(4), sanggenon M(5), sanggenolo A(6), mulberofurano B(7), mulberofurano G(8), moracina M(9), moracina O(10) e norartocarpanone (11)[6,19,20]. Le strutture chimiche di 11 composti isolati da M.alba sono illustrate nella Figura 1. Per determinare gli effetti citotossici di questi composti, un 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl){{ 26}}.5-è stato eseguito il test di difeniltetrazolio bromuro (MTT), le cellule BV2 e RAW264.7 sono state trattate con le concentrazioni indicate dei composti per 48 ore, a concentrazioni fino a 80 μM. (Figura 2). I composti 2, 3 e 4 avevano effetti tossici a 80 μM, il composto 5 aveva effetti tossici a 40 μM. Sulla base del risultato della valutazione di tossicità, è stato selezionato un intervallo di concentrazione non tossico per studi successivi sugli effetti antinfiammatori (composto 2, 3,4 a 40 uM, composto 5 a 200 μM e altri composti a 80 μM） .

2.2.Effetti dei composti isolati da M. alba sull'espressione dei fattori infiammatori e della proteina iNOS nelle cellule BV2 e RAW264.7

NO è un radicale libero nel sistema cardiovascolare, nervoso esistemi immunitari. Mantiene l'omeostasi intracellulare, trasporta i neurotrasmettitori e regola l'attività antinfiammatoria e la citotossicità. Tuttavia, quando viene prodotta una grande quantità di NO, ha effetti dannosi sul corpo, tra cui vasodilatazione, citotossicità e danno tissutale [21,22]. Abbiamo quindi esaminato gli effetti di questi composti sulla produzione di nitriti nelle cellule BV2 e RAW264.7 indotte da LPS. Le cellule sono state trattate con diverse concentrazioni di composti per 2 ore prima della stimolazione con LPS (1 ug/mL) per 24 ore. Tra i composti, solo il composto 3 (kuwanonT) e 4 (sanggenon A) ha inibito significativamente la produzione di nitriti sia nelle linee cellulari BV2 che RAW264.7 (Figura 3). Inoltre, abbiamo condotto un ulteriore esperimento per confrontare l'effetto inibitorio della produzione di nitriti tra il gruppo trattato con LPS dopo il pretrattamento del composto e il gruppo trattato con il composto dopo il pretrattamento con LPS. Di conseguenza, non vi era alcuna differenza nell'effetto inibitorio della produzione di nitriti tra i due gruppi sperimentali (Figura supplementare S1). Pertanto, in questo studio, sono stati condotti i seguenti esperimenti utilizzando il pretrattamento con composti entro 2 ~ 3 ore prima del trattamento dell'LPS.

La produzione di NO è aumentata dalle proteine ​​pro-infiammatorie inducibili ossido nitrico sintasi (iNOS). Tuttavia, la sovraespressione di iNOS compromette gravemente la fisiopatologia della malattia [23]. I composti 3 e 4 hanno inibito l'espressione di iNOS in modo dipendente dalla concentrazione (Figura 4). Abbiamo esaminato gli effetti dei composti 3 e 4 sull'espressione indotta da LPS di fattori infiammatori nelle cellule BV2 e RAW264.7. Le cellule sono state trattate con diverse concentrazioni di composti 3 e 4 per 2 ore prima della stimolazione con LPS (1 ug/mL) per 24 ore. Entrambi i composti hanno inibito significativamente l'espressione indotta da LPS di PGE2, TNF e IL-6 nelle cellule BV2 e RAW264.7 (Figura 5). I risultati sembravano mostrare che il pretrattamento con i composti 3 e 4 sopprimeva l'infiammazione indotta da LPS nelle cellule BV2 e RAW264.7.

2.3. Effetti dei composti 3 e 4 sulla traslocazione NF-xB nelle cellule BV2 e RAW264.7

NF-kB è un fattore di trascrizione che regola l'espressione di iNOS [24]. NF-kB normale rimane nella sua forma inattiva formando complessi con proteine ​​regolatrici come IKB. Tuttavia, quando viene attivato da LPS, IkBa viene degradato dalla fosforilazione e NF-kB (come p65) viene traslocato nel nucleo [25], che promuove il gene del mediatore infiammatorio e induce l'espressione di fattori infiammatori [26]. Per esaminare ulteriormente l'effetto inibitorio dei composti 3 e 4 sulla produzione di fattori pro-infiammatori nelle cellule BV2 e RAW264.7 attivate da LPS, abbiamo studiato la traslocazione nucleare di espressione di p65 nelle cellule trattate con i composti 3 e 4, LPS o entrambi utilizzano un anticorpo marcato con FITC anti-p65. DAPI è stato utilizzato per la colorazione nucleare. Nel gruppo di controllo, l'espressione di p65 è stata rilevata nel citosol. Tuttavia, nelle cellule indotte da LPS, è stato rilevato l'accumulo di p65 nel nucleo, come indicato nelle immagini unite della colorazione DAPI e p65. Inoltre, rispetto alle cellule indotte da LPS, i composti 3 e 4 hanno notevolmente ridotto l'aumento mediato da LPS dell'attività di legame del DNA di NF-KB (p65) (Figura 6A, B) e della traslocazione nucleare (Figura 6C-F). Questi risultati indicano che i composti 3 e 4 sono regolatori negativi della traslocazione nucleare NF-kB stimolata da LPS.

2.4.Effetti dei composti 3 e 4 sul percorso Nrf2/HO-1 in BV2 e RAW264.7

Cellule L'eme ossigenasi-1(HO-1)è un bersaglio del fattore nucleare E2-correlato al fattore 2(Nrf2), la via Nrf2/HO-1 è un potente sistema di segnalazione antiossidante per promuovere il ferro libero nel monossido di carbonio (CO), nella biliverdina e nell'eme [27]. Il monossido di carbonio, un metabolita gassoso del catabolismo dell'eme, mostra effetti regolatori di vasodilatazione e risposte proinfiammatorie [28]. Inoltre, HO-1 è anche noto per svolgere un ruolo importante nella protezione delle cellule dall'infiammazione e dallo stress ossidativo e per regolare la produzione di nitriti nei macrofagi attivati ​​[29]. Abbiamo eseguito il Western blotting per indagare se i composti 3 e 4 aumentano il livello di espressione di HO-1, in cui il noto induttore di HO-1 cobalto protoporfirina (CoPP) è stato utilizzato come controllo positivo aumentando HO{{ 16}} espressione proteica. [30]. I risultati hanno rivelato che anche i composti 3 e 4 sovraregolavano l'espressione di H O-1 (Figura 7). Abbiamo ulteriormente esplorato se i composti 3 e 4 regolano l'attivazione di Nrf2. La traslocazione di Nrf2 nel nucleo è stata aumentata in modo dipendente dal tempo, indicando che i composti 3 e 4 sovraregolavano significativamente il percorso Nrf2/HO-1 nelle cellule BV2 e RAW264.7 (Figura 8).

Per esaminare ulteriormente se gli effetti antinfiammatori e antinfiammatori dei composti 3 e 4 sono correlati con l'espressione di HO-1 nelle cellule BV2 e RAW264.7, abbiamo eseguito una serie di esperimenti con la protoporfirina di stagno-IX (SNPP) che è un inibitore selettivo dell'attività di HO-1. Utilizzando SNPP che può sottoregolare l'espressione di HO-1, abbiamo cercato di determinare se HO-1 media l'effetto inibitorio dei composti di cui sopra sulla risposta infiammatoria indotta da LPS 【31】. Dopo aver trattato le cellule con 20 μM di composti 3 e 4 per 2 ore con o senza 50 μM di SNPP, sono state trattate con LPS per 24 ore. Sebbene i composti 3 e 4 abbiano ridotto la produzione di nitriti nelle cellule BV2 e RAW264.7 indotte da LPS, i loro effetti antinfiammatori sono stati invertiti dal trattamento SNPP (Figura 9). SNPP da solo non ha influenzato la produzione di ossido nitrico (NO) dopo la stimolazione con LPS, suggerendo che gli effetti antinfiammatori dei composti 3 e 4 sono regolati dall'espressione di HO-1.

3. Discussione

Il presente studio ha dimostrato che il Kuwana T e il sanggenon A esercitano l'infiammazione indotta da LPS soppressa nelle cellule BV2 e RAW264.7. Questi composti hanno inibito la produzione indotta da LPS di NO, PGE2 e citochine pro-infiammatorie, tra cui IL{7}} e TNF-, e l'espressione di iNOS e COX-2 nelle cellule BV2 e RAW264.7. Questi risultati hanno indicato che il Kuwana T e il sanggenon A esercitavano i loro effetti antinfiammatori inattivando la via di segnalazione NF-kB. Inoltre, questi composti hanno indotto l'espressione di HO-1 attraverso l'attivazione di Nrf2. Inoltre, questi composti hanno indotto l'espressione di HO-1 tramite l'attivazione di Nrf2 e questo effetto è stato anche confermato essere correlato a l'attività antinfiammatoria.

Nitric oxide synthase (NOS) has three isoforms: neuronal NOS (nNOS; NOS1), iNOS (NOS2), and endothelial eNOS (NOS3)[32]. iNOS is an inducible form that is upregulated in response to various stimuli, including LPS, cytokines, chemokines, and stress, while nNOS and eNOS are constitutive forms that catalyze continuous NO secretion at basal concentrations J33]. Similar to iNOS, COX-2 is also an inducible form upregulated by various inflammatory stimuli, such as cytokines, growth factors, tumor promoters, and bacterial LPS[34]. Its other isoform, COX-1, is constitutively expressed in most tissues under normal physiological conditions [35].COX-2 exerts an enzymatic effect on the conversion of prostaglandin H2 (PGH2), which converts arachidonic acid to PGE, prostaglandin 12(PGI2), prostaglandin F2a (PGF>.), e il trombossano A2(TXA,)[361. In condizioni infiammatorie, i livelli di iNOS e COX-2 aumentano, determinando rispettivamente la sovrapproduzione di NO e PGE2 e portando all'esacerbazione dei disturbi infiammatori [37]. Nel presente studio, abbiamo prima valutato 11 composti isolati da M.alba per determinare se la produzione di NO è inibita nelle cellule BV2 e RAW264.7 stimolate da LPS. I nostri risultati hanno mostrato che kuwanon T e sanggenon A esercitavano i più forti effetti inibitori sia nelle cellule BV2 che RAW264.7 (Figura 3). Nel nostro studio precedente, la moracina M aveva un effetto antinfiammatorio sui macrofagi alveolari, ma i nostri risultati hanno mostrato un diverso modello. Tuttavia, poiché ogni cellula ha caratteristiche diverse, possono manifestarsi attività diverse anche con lo stesso meccanismo J38]. Pertanto, come nei risultati di questo documento, è stato confermato che la moracina M non aveva attività antinfiammatoria nelle cellule BV2 e RAW264.7 fino alla concentrazione del trattamento. Pertanto, kuwanon T e sanggenon A sono stati selezionati per ulteriori esperimenti.

Le citochine hanno una complessa influenza regolatoria sulle risposte infiammatorie e immunitarie [39]. L'attivazione dei macrofagi e delle cellule microgliali migliora la secrezione delle citochine pro-infiammatorie J40 e questa maggiore secrezione porta a un ulteriore rilascio di citochine [41]. IL-6 è una delle principali citochine ed è un mediatore solubile responsabile dell'infiammazione, della risposta immunitaria e dell'emopoiesi [42]. La segnalazione di IL-6 è regolata attraverso due diversi meccanismi, tra cui il legame al recettore IL{8}} legato alla membrana (mblL6R) e il riconoscimento del recettore solubile IL{10}} (sIL6R)[43]. Entrambi i meccanismi sono associati all'attivazione della glicoproteina (GP)130, che si traduce nell'attivazione di molecole di segnalazione a valle, tra cui la Janus chinasi (IAK)/trasduttore di segnale e attivatore di trascrizione (STAT)chinasi, fosfoinositide 3-chinasi (PI3K ), e la protein chinasi attivata dal mitogeno (MAPK)[44]. IL-6 viene utilizzato per prevedere e valutare i livelli di infiammazione nei pazienti con cancro, infezioni, malattie autoimmuni, malattie del pancreas e malattie cardiovascolari.

Anche il TNF-, un'altra importante citochina, svolge un ruolo importante in molti processi immunitari e infiammatori, come la proliferazione delle cellule immunitarie, l'apoptosi, la necrosi e la sopravvivenza. Gli effetti biologici del TNF- sono regolati dal legame a due diversi recettori, il recettore del fattore di necrosi tumorale (TNFR)1 e il TNFR2. Il TNFR1 è il principale mediatore dell'attività del TNF nella maggior parte delle cellule, perché il TNFR2 ha un'affinità di legame minore per il TNF- , con il risultato che il TNF- si dissocia più facilmente dal TNFR2 che dal TNFR1. Le anomalie nella segnalazione del TNF e la sovrapproduzione di TNF portano allo sviluppo di molte malattie, tra cui l'artrite reumatoide, la psoriasi, il morbo di Crohn, l'aterosclerosi, la sepsi, il diabete e l'obesità [45,46. Pertanto, è importante inibire la produzione di citochine pro-infiammatorie per sopprimere e prevenire le reazioni infiammatorie e lo sviluppo di malattie infiammatorie. Nel presente studio, kuwanon T e sanggenon A hanno inibito la produzione indotta da LPS di IL-6 e TNF- nelle cellule BV2 e RAW264.7.

NF-KB è il fattore di trascrizione più diffuso[47] e la segnalazione di NF-kB gioca un ruolo importante nell'espressione dei geni correlati alle risposte infiammatorie, compresi quelli che codificano per iNOS, COX-2 e citochine pro-infiammatorie [ 48]. Nello stato inattivato, nel citoplasma esistono subunità NF-kB legate alla sua proteina inibitrice, l'inibitore kappa B (kB)- . Diversi stimoli, tra cui LPS e citochine, inducono la fosforilazione e la degradazione di IkB-, consentendo la liberazione e la traslocazione delle subunità NF-kB nel nucleo. Le subunità traslocate si legano ai siti kB dei geni bersaglio nel DNA, determinando l'induzione della trascrizione di geni che codificano per mediatori pro-infiammatori [49]. Pertanto, l'inattivazione della via NF-kB può essere un bersaglio terapeutico per le malattie infiammatorie. Nel presente studio, il pretrattamento con kuwanon T e sanggenon A ha inibito l'attivazione indotta da LPS della segnalazione NF-kB inibendo l'attività di legame del DNA e la traslocazione nucleare delle subunità NF-kB (Figura 6). Questi risultati suggeriscono che gli effetti antinfiammatori del kuwanon T e del sanggenon A sono esercitati attraverso la regolazione della via di segnalazione NF-kB.

In condizioni normali, Nrf2 si lega alla proteina 1 associata a ECH simile a Kelch (Keap1) nel citoplasma. Tuttavia, si dissocia da Keapl, si trasloca nel nucleo e si lega ai siti dell'elemento di risposta antiossidante (ARE) sul DNA, portando all'espressione di vari geni antiossidanti, inclusi quelli che codificano per HO-1, NAD(P)H : chinone ossidoreduttasi 1(NQO1), perossiredossina (Prx) e tioredossina (Trx)[50]. In particolare, HO-1 è noto per essere associato ad effetti antinfiammatori e la sua attività è rappresentata dai livelli di CO, uno dei tre sottoprodotti generati dall'eme dall'attività enzimatica di HO{{12 }} [51]. Nel presente studio, abbiamo scoperto che kuwanon T e sanggenon A indotta da HO-1 espressione attivando Nrf2 (Figure 7 e 8). Inoltre, abbiamo verificato la correlazione tra l'effetto antinfiammatorio del kuwanon T e il sanggenon A e l'espressione di HO-1 utilizzando SNPP, un inibitore selettivo dell'attività di HO-1. Gli effetti inibitori di kuwanon T e sanggenon A sulla produzione di NO e TNF e sull'attivazione di NF-kB sono stati parzialmente invertiti dal co-trattamento con SNPP (Figura 9). Questi risultati suggeriscono che gli effetti antinfiammatori del kuwanon T e del sanggenon A sono regolati dall'espressione HO-1.

4. Materiali e metodi

4.1. Materiali

Il Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPI 1640) e il siero bovino fetale sono stati acquistati da Gibco BRL Co. (Grand Island, NY, USA). Tutti i prodotti chimici sono stati ottenuti da Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Gli anticorpi primari anti-iNOS, anti{4}}actina, anti-p65 e anti-HO-1 sono stati acquistati da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA); e anticorpi secondari anti-coniglio e anti-topo di Millipore

(Billerica, MA, USA). I kit per il test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) per PGE, IL-6 e TNF- sono stati acquistati da R&DSystems Inc.(Minneapolis, MN, USA). L'isolamento e la determinazione strutturale degli 11 composti di Morus alba sono stati descritti altrove [19-21].

4.2. Coltura cellulare e saggi di vitalità

Le cellule BV2 e RAW264.7 sono state seminate a una densità di 5 × 105 cellule/mL in RPMI 1640 integrato con l'1% di antibiotico (penicillina-streptomicina) e il 10% di FBS inattivato al calore. Le cellule sono state coltivate a 37 gradi in una CO umidificata al 5%, con un'atmosfera d'aria del 95%, secondo un metodo precedentemente descritto [52].

4.3. Misurazione di NO Produzione

La produzione di nitrito, un prodotto finale stabile dell'ossidazione di NO, è stata misurata come indicatore della produzione di NO nelle cellule. In breve, la concentrazione di nitrito nel mezzo condizionato è stata determinata utilizzando un metodo basato sulla reazione di Griess [53]. I dettagli del test sono stati descritti in precedenza [54].

4.4. PGE2 Ass4y/

La concentrazione di PGEz in ciascun campione è stata misurata utilizzando un kit ELISA disponibile in commercio, secondo un metodo precedentemente descritto [55].

4.5.Misurazione dei livelli IL-6 e TNF-a

Il mezzo di coltura è stato raccolto per determinare i livelli di IL-6 e TNF- utilizzando un kit disponibile in commercio (BioLegend, San Diego, CA, USA). Il test è stato eseguito secondo le istruzioni del produttore. In breve, le cellule BV2 e RAW264.7 sono state seminate in 24-piastre di coltura di pozzetti a una densità di 20 × 10 cellule/pozzetto. Dopo l'incubazione, il supernatante è stato raccolto e utilizzato per misurare le concentrazioni di IL-6 e TNF- con i kit ELISA.

4.6. Analisi Western Blot

Le cellule BV2 e RAW264.7 pellettate sono state lavate con PBS e lisate in tampone RIPA. Uguali quantità di proteine ​​sono state quantificate utilizzando il concentrato di reagente colorante per analisi proteica ottenuto da Bio-Rad Laboratories (n. 5000006; Hercules, CA, USA), miscelato nel buffer di caricamento del campione e separato utilizzando SDS-PAGE. Le proteine ​​separate sono state quindi trasferite su una membrana di nitrocellulosa. Il legame non specifico alla membrana è stato bloccato mediante incubazione in una soluzione di latte scremato. La membrana è stata incubata con anticorpi primari (tutti usati a 1:1000) a 4 gradi durante la notte e poi ha fatto reagire con un anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano (tutti usati a 1:5000)(Millipore) [ 31].

4.7. Localizzazione NF-xB e analisi dell'immunofluorescenza

Per studiare la localizzazione di NF-kB, le cellule BV2 e RAW264.7 sono state coltivate su vetrini da camera Lab-Tek II e trattate con diverse concentrazioni di composti per 2 ore prima della stimolazione LPS (0.5 ug/mL) per 1 h. Le cellule sono state quindi fissate in formalina e permeabilizzate con acetone freddo e sondate con anticorpi anti-p65 (1:200), seguite da incubazione con un anticorpo secondario marcato con isotiocianato di fluoresceina (1:1000) (Alexa Fluor 488, Invitrogen). Per visualizzare i nuclei, le cellule sono state trattate con 1 ug/mL di 4'6-diamidino-2-fenilindolo （DAPI per 30 minuti, lavate con PBS per 5 minuti e trattate con 50 μL di VectaShield (Vector Laboratories, Burlingame, California, USA). Le cellule colorate sono state visualizzate e le immagini sono state acquisite utilizzando un microscopio a fluorescenza Zeiss (Provis AX70; Olympus Optical Co., Tokyo, Giappone). [31].

4.8. Analisi statistica

I dati sono presentati come media ± deviazione standard di tre esperimenti indipendenti. L'analisi della varianza unidirezionale, seguita dal test di confronto multiplo di Tukey, è stata utilizzata per confrontare le differenze tra i tre gruppi. Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il software GraphPad Prism (versione 5.01, GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA),

5. Conclusioni

Kuwanon T e sanggenon A hanno esercitato effetti antinfiammatori nelle cellule BV2 e RAW264.7 indotte da LPS inibendo la produzione di NO, PGE2, IL-6 e TNF- e l'espressione di iNOS e COX{{8} }. I nostri risultati hanno dimostrato che questi effetti inibitori sono stati mediati attraverso l'inattivazione della via NF-KB dal trattamento con kuwanon T e sanggenon A. Inoltre, questi composti hanno indotto l'espressione di HO-1 attivando la traslocazione di Nrf2 nel nucleo . I nostri risultati hanno dimostrato che l'espressione HO-1 indotta da kuwanon T e sanggenon A era associata agli effetti soppressivi contro l'infiammazione indotta da LPS. Presi insieme, i nostri risultati forniscono la prova che il Kuwana T e il sanggenon A isolati da M. Albu potrebbero essere candidati per lo sviluppo di agenti terapeutici e preventivi per malattie neuroinfiammatorie come il morbo di Alzheimer e il morbo di Parkinson.