Espressione umana di Alpha Defensin 5 nel rene umano e nelle vie urinarie
Mar 16, 2022
Per ulteriori informazioni: ali.ma@wecistanche.com
John David Spencer et al
Astratto
Sfondo:I meccanismi che mantengono la sterilità nel tratto urinario sono compresi in modo incompleto. Studi recenti hanno implicato l'importanza dei peptidi antimicrobici (AMP) nella protezione del tratto urinario dalle infezioni. Qui, caratterizziamo l'espressione e la rilevanza dell'alfa-defensina 5 (HD5) umana AMP nell'uomorenee delle vie urinarie in soggetti normali e infetti.
Metodologia/risultati principali:Utilizzando RNA isolato dall'uomorene, dell'uretere e del tessuto vescicale, abbiamo eseguito la PCR quantitativa in tempo reale per dimostrare che DEFA5, il gene che codifica per HD5, è costitutivamente espresso in tutto il tratto urinario. Con la pielonefrite, l'espressione di DEFA5 è aumentata significativamente nelrene. Utilizzando l'analisi immunoblot, anche la produzione di HD5 è aumentata con la pielonefrite. Immunocolorazione HD5 localizzata all'urotelio della vescica e dell'uretere. Nel rene, HD5 è stato prodotto principalmente nel nefrone distale e nei tubuli collettori. Utilizzando i test immunoblot ed ELISA, l'HD5 non è stato rilevato di routine in campioni di urina umana non infetta, il che significa che la produzione urinaria di HD5 è aumentata con l'infezione del tratto urinario da E.coli.
Conclusioni/Significato:DEFA5 è espresso in tutto il tratto urinario nei soggetti non infetti. In particolare, HD5 è espresso in tutto l'urotelio delle basse vie urinarie e nei tubuli collettori delrene. Con l'infezione, l'espressione di HD5 aumenta nelrenee i livelli diventano rilevabili nelle urine. A nostra conoscenza, i nostri risultati rappresentano i primi a quantificare l'espressione e la produzione di HD5 nel rene umano. Inoltre, questo è il primo report a rilevare la presenza di HD5 in campioni di urina infetta. I nostri risultati suggeriscono che l'HD5 può avere un ruolo importante nel mantenimento della sterilità del tratto urinario.
introduzione
Le vie urinarie, a parte il meato uretrale, sono generalmente sterili nonostante la vicinanza con la flora fecale. I meccanismi precisi attraverso i quali il tratto urinario mantiene la sua sterilità non sono ben compresi. I meccanismi proposti che contribuiscono alla difesa delle vie urinarie comprendono il flusso urinario, le alterazioni del pH e dell'osmolarità delle urine, lo svuotamento regolare della vescica, i componenti della difesa chimica dell'uroepitelio e la diffusione/afflusso epiteliale delle cellule immunitarie effettrici con stimolazione batterica [1]. Inoltre, è stato recentemente dimostrato che i peptidi antimicrobici (AMP) hanno un ruolo importante nel mantenimento della sterilità del tratto urinario [2]. Gli AMP, che fungono da antibiotici naturali prodotti da quasi tutti gli organismi, sono un componente onnipresente del sistema immunitario innato. Gli AMP sono molecole cationiche espresse dai globuli bianchi fagocitici e dalle cellule epiteliali. Negli esseri umani e in altri mammiferi, le defensine sono una delle principali famiglie di AMP. Le defensine hanno tipicamente un'attività antimicrobica ad ampio spettro contro batteri, virus, funghi e protozoi gram-positivi e gram-negativi [2,3]. Le defensine sono inizialmente sintetizzate come preproproteine e subiscono l'elaborazione per diventare peptidi maturi e biologicamente attivi [4]. Nell'uomo, le defensine sono classificate in una delle due famiglie a seconda del loro modello di ponte disolfuro: le alfa-defensine o le beta-defensine [5].
Nel tratto urinario, le beta-defensine sono ampiamente espresse in tutto l'uroepitelio. Le cellule epiteliali che rivestono ilrenel'ansa di Henle, il tubulo distale e il dotto collettore esprimono costitutivamente la beta-defensina 1 umana (hBD1). Sebbene i livelli urinari di hBD1 siano insufficienti per uccidere i batteri invasori, hBD1 fornisce un rivestimento antimicrobico ad azione rapida dei lumi tubulari e previene l'infezione inibendo l'attaccamento batterico all'urotelio [6]. Studi recenti indicano che lo stato redox di hBD1 influisce in modo significativo sulla potenza antimicrobica, in modo tale che il peptide ridotto è molto più potente della forma ossidata legata al disolfuro [7]. Il significato di questo sulla superficie uroteliale non è stato determinato. Un'altra defensina, la beta-defensina 2 umana (hBD2) non è costitutivamente espressa nel tessuto renale sano; tuttavia, l'espressione di hBD2 è indotta dall'infezione [8].
A differenza delle beta-defensine, il ruolo delle alfa-defensine di derivazione epiteliale non è ben descritto nel tratto urinario. L'espressione e la funzione delle alfa-defensine HD5 e HD6 sono state riportate principalmente nell'intestino tenue dove sono secrete dalle Panethcells nelle cripte intestinali e contribuiscono all'equilibrio del microbiota intestinale [9]. HD5 è stato anche localizzato nei tratti genitali maschili e femminili, con prove che suggeriscono che è inducibile e importante nell'eradicare l'infezione [10,11,12]. L'HD5 urinario è stato rilevato in pazienti che hanno subito una ricostruzione ileale della neovescica e una deviazione urinaria del condotto ileale per cui la fonte della produzione di HD5 è stata principalmente attribuita alle cellule di Paneth ileale [13,14]. HD5 ha attività antibatterica contro i comuni batteri gram-positivi uropatogeni e batteri gram-negativi [15]. HD5 ha anche attività antimicrobica contro i virus uropatogeni come l'adenovirus e il virus BK [16,17,18]. In questo studio, forniamo la descrizione iniziale e la quantificazione dell'espressione di HD5 nell'uomorenee definire ulteriormente la sua espressione nel tratto urinario inferiore durante la sterilità e l'infezione.
Risultati
L'mRNA di DEFA5 è espresso costitutivamente nella vescica, nell'uretere e nel rene umani
La PCR quantitativa in tempo reale dimostra che tutti i test di vescica, uretere erenei campioni senza infezione esprimevano costitutivamente DEFA5. L'espressione di DEFA5 era significativamente maggiore nel tratto urinario inferiore rispetto al tratto urinario superiore (p= 0.014). Nella vescica (n=4), l'espressione media di DEFA5 era 4,656637 trascrizioni per 10 ng di RNA e nell'uretere (n=4) l'espressione media di DEFA5 era di 4,1126170 trascrizioni per 10 ngRNA (Figura 1A) . Nel rene (n=6), l'espressione media di DEFA5 era di 2.9376274 trascrizioni per 10 ng di RNA. L'espressione di DEFA5 è stata analizzata separatamente nella corteccia renale, nel midollo e nel bacino. L'espressione di DEFA5 non variava significativamente in base alla regione renale (p= 0.45).
L'espressione di DEFA5 e l'espressione del peptide HD5 aumentano con la pielonefrite
Analisi PCR quantitativa in tempo reale eseguita sutessuti renali conla pielonefrite ha dimostrato un aumento significativo dell'espressione di DEFA5 rispetto ai tessuti renali non infetti. Con pielonefrite (n= 6), l'espressione media di DEFA5 è aumentata a 7.82961.052 trascrizioni per 10 ng di RNA (p= 0.019) (Figura 2A).
Per valutare ulteriormente questo aumento dell'espressione con pielone-frite, abbiamo eseguito l'analisi immunoblot sullo stessorenetessuto utilizzato per l'analisi PCR in tempo reale per valutare aumenti simultanei nella produzione di peptidi HD5 (Figura 2B, pannello centrale). L'analisi immunoblot, utilizzando antisieri policlonali HD5, ha dimostrato una produzione di peptidi HD5 significativamente maggiore nei tessuti renali con pielonefrite (n {{5} }) rispetto ai non infettirenetessuti(n=6). Non infettorenetessuti espressi 300625 ng HD5/grammo di peso del tessuto umido mentrerenetessuto con pielonefrite espresso 600621 ng HD5/grammo di peso del tessuto umido (p,0,0001). Le macchie sono state nuovamente sondate con GAPDH per fungere da controllo di caricamento (Figura 2B, pannello centrale) ed è stata eseguita anche una colorazione d'argento per confermare un carico proteico uguale (Figura 2B, pannello superiore).
Il peptide HD5 è prodotto in tutto il rene umano e nel tratto urinario
L'immunocolorazione è stata eseguita per localizzare la produzione di HD5 nel tratto urinario. L'immunoistochimica (IHC) ha mostrato che l'immunoreattività dell'HD5 era presente in tutto l'urotelio dell'uretere e della vescica di tutti i campioni esaminati (n=4, Figura 3). L'IHC ha anche mostrato che l'HD5 è stato prodotto nei tubuli della corteccia renale e nel midollo di tutti campioni (n= 6, Figura 4). L'immunofluorescenza (IF) ha dimostrato che l'espressione di HD5 era maggiore nel nefrone distale e nei tubuli collettori (Figura 5). L'interstizio e i glomeruli non hanno mostrato immunoreattività HD5. L'immunocolorazione mostrata nelle Figure 3, 4 e 5 è stata eseguita utilizzando un anticorpo monoclonale murino anti-HD5 (8C8) che riconosce il propeptide HD5 (Abcam, Cambridge, MA). I risultati erano simili quando si utilizzava l'anticorpo policlonale di coniglio anti-HD5 che riconosce il propeptide HD5 e il peptide maturo (dati non mostrati), suggerendo che l'HD5 è immagazzinato come propeptide.
Con la pielonefrite, l'immunocolorazione HD5 è notevolmente aumentata. L'immunoreattività dell'HD5 è aumentata in tutto il nefrone prossimale, il nefrone distale e i tubuli collettori (Figura 4 e Figura 5). Come nei campioni non infetti, i glomeruli e l'interstizio non hanno mostrato alcuna espressione di HD5 con l'infezione. I controlli negativi non hanno mostrato immunoreattività HD5.
L'urina umana infetta contiene concentrazioni misurabili del peptide HD5
L'analisi dell'immunoblot, utilizzando l'antisiero policlonale di coniglio che rileva il precursore proHD5 e le forme ulteriormente elaborate, hanno identificato livelli misurabili di HD5 in 13 dei 15 campioni di urina testati infettati da E.coli uropatogeno (Figura 6A e B). Quando presenti, i livelli di HD5, normalizzati alla creatinina urinaria, variavano da 299,8–669,7630 ng HD5/mg Cr urinario (110,67 ng/mL–276,67 ng/mL), che corrisponde a 11,10–27,67 nmol/L. Campioni di urina non infetti (n=15), HD5 era pari o inferiore al limite di rilevamento di (,50 ng). Il test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) sugli stessi campioni di urina, utilizzando l'anticorpo monoclonale murino (8C8) che rileva solo il precursore proHD5, ha rilevato livelli misurabili di proHD5 in 13 dei 15 campioni infetti testati. Le concentrazioni urinarie di proHD5 variavano da 122,78–490.060,03 ng HD5/mg di Cr urinario (30,02 ng/mL–200,5 ng/mL) quando presente (Figura 7).
Discussione
In questo studio, forniamo la caratterizzazione iniziale di HD5 nell'uomorene, uretere e vescica. HD5 ha dimostrato di essere un importante AMP che previene l'infezione invasiva nell'intestino ed è sovraregolato nel tratto genitale durante l'infezione[11,18,19,20,21]. Gli AMP di derivazione epiteliale, come l'HD5, hanno dimostrato di essere importanti nel mantenimento della sterilità del tratto urinario[8,22,23,24]. Le carenze di queste difese innate della mucosa possono causare infezioni acute e/o croniche [25,26].
I nostri risultati quantitativi della PCR in tempo reale dimostrano che DEFA5 è costitutivamente espresso nell'uomoreni, ureteri e vescica. L'espressione di DEFA5 aumenta dal tratto urinario superiore al tratto urinario inferiore, a seguito del flusso del flusso urinario e della crescente vicinanza al punto di invasione del microbiota. A nostra conoscenza, questo è il primo studio a quantificare l'espressione di DEFA5 nel rene e nella vescica umani. Recentemente, Townes et al hanno dimostrato che il normale uretere distale può esprimere DEFA5 [14]. I nostri risultati suggeriscono anche che DEFA5 è costitutivamente espresso dall'uretere distale. Sebbene l'espressione di DEFA5 nel tratto urinario sia quasi 100- volte inferiore a quella riscontrata nei tessuti gastrointestinali, l'espressione uroepiteliale basale di DEFA5 è paragonabile all'espressione di amplificatori delle vie urinarie precedentemente descritti come catelicidina, hBD-1, hBD -2 e ribonucleasi 7[6,8,22,24,27].
In contrasto con il tratto gastrointestinale maturo in cui DEFA5 è espresso a livelli elevati sia negli stati di salute che in quelli di infezione/infiammazione, i nostri dati quantitativi di PCR in tempo reale dimostrano che l'espressione di DEFA5 nelreneè significativamente sovraregolato con l'infezione [27,28,29]. Questo modello di espressione inducibile è analogo all'espressione di DEFA5 nel tratto riproduttivo femminile dove l'espressione di DEFA5 aumenta con la salpingite [30]. Nel tratto urinario, Townes et al hanno mostrato una tendenza verso una maggiore espressione ureterale di DEFA5 nei pazienti con IVU che hanno subito una deviazione urinaria del condotto ileale [14]
La nostra analisi immunoblot integra i dati della PCR in tempo reale dimostrando che la produzione del peptide HD5 aumenta con la pielonefrite. Questo modello inducibile di produzione di HD5 è simile a quello osservato in alcuni membri della famiglia delle beta-defensine. hBD2 mostra un modello inducibile di produzione con infezione del tratto urinario e/o pielonefrite cronica [8,31,32]. È stato dimostrato che la produzione del peptide HD5 aumenta nel tratto genitale femminile superiore e nell'uretra maschile con infiammazione [11,30].
Utilizzando l'immunocolorazione, dimostriamo che l'HD5 è prodotto uniformemente in tutto l'urotelio dell'uretere e della vescica. Poiché la stragrande maggioranza delle UTI deriva dalla flora fecale che risale nella vescica, questi risultati suggeriscono che l'espressione di HD5 è presente nei luoghi in cui l'esposizione microbica si verifica più frequentemente [33]. Pertanto, HD5 è posizionato idealmente per prevenire un'infezione microbica ascendente. Nelrene, HD5 è prodotto principalmente nel nefrone distale e nel tubulo collettore. Questi risultati suggeriscono che l'HD5 viene prodotto in luoghi in cui sarà posizionato per avere un'attività antimicrobica ottimale. Studi precedenti hanno dimostrato che le proprietà antimicrobiche delle defensine dipendono dalla concentrazione di sale, con concentrazioni di sale più elevate che riducono l'attività antimicrobica [23,34,35]. Ipotizziamo che le basse concentrazioni di sale del nefrone distale e dei tubuli di raccolta forniscano un ambiente favorevole per l'attività antimicrobica dell'HD5.
L'immunoblot e l'analisi ELISA dimostrano anche che l'HD5 viene secreto nelle urine a bassi livelli. Date le dimensioni (8,1 kDa e 3,7 kDa) e la carica positiva di proHD5 e HD5 completamente processato, è possibile che alcuni peptidi urinari HD5 provengano, almeno in parte, dal filtrato plasmatico. Tuttavia, ci sono poche prove che suggeriscono che l'HD5 persista nel plasma [27]. Inoltre, per apparire nelle urine, l'HD5 dovrebbe sfuggire agli efficienti meccanismi di assorbimento dei peptidi nel tubulo prossimale [6,36]. Infine, i campioni di urina utilizzati sono stati sottoposti a centrifugazione prima dell'esecuzione dei test, rimuovendo le fonti cellulari di HD5.
Alle concentrazioni rilevate, è improbabile che l'HD5 urinario sia direttamente antimicrobico contro i microrganismi uropatogeni poiché l'HD5 completamente processato ha una concentrazione inibitoria minima (MIC) compresa tra 6 e 10 mg/mL contro i comuni batteri uropatogeni Gram-negativi [15]. Tuttavia, è probabile che le concentrazioni della superficie della mucosa siano più elevate. Inoltre, l'analisi immunoblot dimostra che le concentrazioni di HD5 sono significativamente maggiori nelrene. Questi risultati suggeriscono che l'HD5 è coinvolto nella difesa della mucosa delle vie urinarie. Un pattern analogo si osserva con hBD1, dove le concentrazioni urinarie di hBD1 sono insufficienti per esibire attività antimicrobica ma si rilevano concentrazioni peptidiche più elevate vicino ai tubuli renali [6,31].
Perché IHC dimostra che proHD5 è una delle principali forme di HD5 nelrenee poiché sia la maturità che la proHD5 vengono rilevate nelle urine, ipotizziamo che l'HD5 sia principalmente secreta da una molecola precursore e quindi subisca un'elaborazione proteolitica per generare forme mature, simili ai tratti gastrointestinale e genitourinario [11,30,37]. Nell'intestino tenue, le cellule di Paneth producono tripsina, che scinde il propeptide HD5 in modo che il peptide completamente trasformato sia la forma predominante nel lume intestinale [37]. Nell'uretra maschile, gli enzimi chiave per l'elaborazione e l'attivazione dell'HD5 sono le proteasi dei neutrofili fornite dai neutrofili reclutati nel sito di infezione [11]. Restano da determinare i contributi del tripsinogeno epiteliale, della tripsina urinaria e/o delle proteasi dei neutrofili sull'elaborazione dell'HD5 nel tratto urinario durante l'infezione. Rimangono inoltre da determinare gli effetti dei cambiamenti nell'ambiente urinario sulla funzione dell'HD5 (alterazioni di osmolarità, pH e concentrazioni cationiche).
In conclusione, questo è il primo studio per identificare e quantificare l'espressione e la produzione di HD5 nel tratto urinario. I nostri risultati suggeriscono che l'HD5 è un AMP di derivazione epiteliale che può svolgere un ruolo importante nell'immunità innata dell'uroepitelio umano prevenendo la traslocazione di agenti patogeni invasori nella circolazione. Il chiarimento dei fattori che regolano la produzione di HD5 può fornire nuove informazioni sulla patogenesi delle UTI nei pazienti a rischio di UTI e nei pazienti con infezioni croniche.
Metodi
Approvazione dello studio
Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i pazienti che hanno partecipato a questo studio. Per i soggetti di età inferiore ai 18 anni è stato ottenuto il consenso scritto del genitore/tutore. Il comitato di revisione istituzionale del NationwideChildren's Hospital (NCH) ha approvato questo studio insieme al processo di consenso e ai documenti (IRB07-00383).
Campioni di tessuto umano e urina
Il tessuto non infetto dell'uretere distale e della vescica (n= 4) è stato ottenuto da bambini sottoposti a reimpianto dell'ureterale per ragioni diverse dall'infezione ricorrente. Non infettorenecampioni (n=6) sono stati ottenuti da pazienti sottoposti a nefrectomia per tumori renali. I campioni di tessuto erano privi di segni macroscopici di malattia o infiammazione.Renetessuto da pazienti con pielonefrite cronica è stato fornito dal Cooperative HumanTissue Network (n=6) [38]. Due patologi indipendenti hanno confermato la diagnosi istopatologica di pielonefrite. I campioni di tessuto sono stati congelati a scatto o conservati come sezioni neutre fissate in formalina e incluse in paraffina. Sezioni di tessuto renale non infetto sono state sezionate nella corteccia, nel midollo o nella pelvi renale prima della conservazione (n=4).
Sono stati ottenuti campioni di urine non infette e infette da bambini che si presentavano al pronto soccorso dell'NCH o alla clinica nefrologica. La diagnosi di UTI è stata fatta da un'urinocoltura positiva secondo l'American Academy of PediatricsGuidelines [39]. Tutti i campioni di urina infettati avevano 0,106 UFC/mL di E.coli. I valori di pH urinario variavano da 5,5 a 8,5 (urina media 6,9). La composizione ionica urinaria non è stata misurata. I campioni di urina sono stati centrifugati per rimuovere i sedimenti urinari ed è stato aggiunto un cocktail di inibitori della proteasi (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA).
Isolamento dell'acido ribonucleico e trascrizione inversa
L'RNA totale è stato isolato dal tessuto congelato utilizzando il sistema di isolamento dell'RNA PromegaTotal (Promega, Madison, WI, USA). Sintesi di ForcDNA, 4–8 mg di RNA totale sono stati trascritti inversamente con la trascrittasi inversa Superscript III utilizzando un oligo-(dT) 12–18primer secondo il protocollo del fornitore (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).
Clonazione di plasmidi gene specifici per curve standard
Il cDNA codificante DEFA5 e GAPDH sono stati clonati in un 4-vettore plasmidico topo (Invitrogen) secondo le istruzioni del produttore. I plasmidi sono stati sequenziati per confermare che fosse corretto
sono stati ottenuti costrutti. Le diluizioni seriali di plasmidi gene-specifici sono state quantificate (mediante assorbanza spettrofotometrica a 260 ed elettroforesi su gel di agarosio colorato con bromuro di etidio) e utilizzate nella PCR in tempo reale per generare curve standard per ciascuna reazione.
PCR quantitativa in tempo reale
La PCR quantitativa in tempo reale è stata eseguita utilizzando cDNA a filamento singolo dall'uomorene, uretere e tessuto vescicale con coppie di primer oligonucleotidici specifici utilizzando il sistema 7500 Real-Time PCR (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Sono stati progettati primer a giunzione esone della PCR e le sequenze sono state confermate utilizzando DNAstarH Laser Gene SeqBuilder (DEFA5 forward primer : 59- TCC CTC CTG CAG GTG ACC CCA-39 e DEFA5 reverse primer 59-GTG GCT CTT GCC TGA GAA CCT GA-39).
In breve, il cDNA corrispondente a 10 ng RNA è servito da modello in una reazione da 25 ml contenente 2.{21}} mM di ciascun primer e 16 mix Light-Cycler-Fast Start DNA Master SYBR Green. Le condizioni della PCR erano: denaturazione iniziale a 95 uC per 10 minuti, seguita da 40 cicli con ciascun ciclo consistente in denaturazione a 94 uC per 30 secondi, ricottura a 64 uC per 30 secondi ed estensione a 72 uC per 30 secondi. L'emissione di fluorescenza da ciclo a ciclo è stata monitorata a 530 nm e analizzata utilizzando 7500Software V2.0.3 (Applied Biosystems). Standard plasmidici gene-specifici sono stati inclusi in ogni serie di reazioni. Come controllo positivo, l'RNA dell'ileo terminale è stato incluso in ciascuna serie di reazioni e i risultati sono stati confrontati con gli standard precedentemente pubblicati [27].
Per confermare l'amplificazione PCR del prodotto previsto, il campione rappresentativo è stato analizzato mediante elettroforesi su un gel di agarosio all'1,5%. I prodotti sono stati visualizzati mediante colorazione con bromuro di etidio e confrontati con gli standard di dimensione del DNA per confermare la dimensione del prodotto prevista (non mostrata). Inoltre, alla fine di ciascuna reazione è stata determinata una curva del profilo della temperatura di fusione di ogni reazione PCR.
Anticorpi HD5
Il propeptide HD5 (AA20-94) e le forme parzialmente elaborate (AA36-94 e 56-94) sono stati identificati utilizzando un anticorpo monoclonale murino (8C8) anti-HD5 disponibile in commercio (Abcam). Il propeptide HD5 e il peptide maturo (AA63-94) è stato identificato utilizzando un antisiero policlonale di coniglio precedentemente descritto[13,40].
Immunoblot
Sezioni dello stessorenei campioni utilizzati per l'analisi PCR quantitativa in tempo reale (3-6 mg di peso umido) sono stati polverizzati utilizzando un mortaio e un pestello in azoto liquido e disciolti in tampone RIPA con inibitori della proteasi. Le proteine urinarie sono state estratte dai campioni di urina utilizzando il micro kit per la concentrazione di proteine urinarie ProteospinTM (Norgen Biotek Corporation, Thorold, ON, Canada). Le concentrazioni di proteine renali e urinarie sono state quantificate utilizzando un saggio Bradford modificato e confermate utilizzando una lettura di anOD280 nm. Concentrazioni uguali di tessuto renale o proteine urinarie sono state caricate su gel con gradiente di sodio dodecil solfato al 18% e sottoposte a elettroforesi. Per garantire un carico proteico uguale, è stata eseguita una colorazione d'argento.
Dopo la separazione elettroforetica, le proteine sono state trasferite su una membrana di nitrocellulosa. Dopo la fissazione con 0,05% di glutaraldeide in TBS, le membrane sono state bloccate in latte scremato al 5% per 30-60 minuti e incubate in una diluizione 1:1,000 di antisiero policlonale HD5 di coniglio durante la notte . Dopo il lavaggio, l'anticorpo secondario, un anti-coniglio IgG coniugato con perossidasi di rafano diluito 1:10,000 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), è stato applicato per 1 ora a temperatura ambiente. Immunoblot darenei tessuti sono stati anche sondati con l'anticorpo anti-GAPDH (Sigma Aldrich) per due ore a temperatura ambiente e quindi incubati con l'anticorpo secondario descritto sopra. Le proteine sono state visualizzate utilizzando un sistema di rilevamento ECL e un film di chemiluminescenza secondo le istruzioni del produttore (BioExpress, Kaysville, UT, USA).
L'HD5 è stato quantificato confrontando le intensità di banda risultanti con una diluizione seriale della proteina proHD5 standard ricombinante (Peptides International, Louisville, KY, USA).ReneLe concentrazioni di HD5 sono state standardizzate sul peso del tessuto umido. Le concentrazioni di UrinaryHD 5 sono state divise per la creatinina urinaria per stabilire rapporti standardizzati tra HD5- e creatinina urinaria (mg/mg) per tenere conto della diluizione delle urine. Le concentrazioni di creatinina urinaria sono state determinate utilizzando il dosaggio in micropiastra della creatinina della Oxford Biomedical Research (Rochester Hills, Michigan, USA).
Immunoistochimica
Dopo la deparaffinazione, la reidratazione e il recupero dell'antigene, sono stati eseguiti un blocco della biotina e un blocco proteico privo di siero (Superblock, ScyTek Laboratories, Logan, UT, USA). I vetrini sono stati incubati per una notte a 4uC con anticorpo monoclonale murino HD5(8C8) (1:2{{10}}0; Abcam) o antisiero policlonale di coniglio (1:500) seguito da anticorpo biotinilato anti-polivalente adulterato Streptavidina/HRP (Laboratori ScyTek). Le sezioni sono state sviluppate utilizzando lo 0,1 percento di diamminobenzidina tetracloruro con lo 0,02 percento di perossido di idrogeno e colorate di contrasto con ematossilina. Le sezioni dei controlli negativi sono state incubate con siero non immune al posto dell'anticorpo HD5.
Immunofluorescenza
L'immunofluorescenza a doppia etichetta è stata eseguita per aiutare a localizzare l'espressione di HD5 nelrene. Il dotto collettore è stato contrassegnato in doppia etichetta per le cellule principali con anticorpo policlonale di capra anti-acquaporina umana-2 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) [41]. L'ansa di Henle è stata marcata doppiamente con un anticorpo policlonale murino anti-uromodulina umana (Sigma-Aldrich) e il tubulo prossimale è stato marcato doppiamente con acquaporina policlonale antiumana di capra-1 (Santa Cruz) [41,42]. Anti-capra policlonale asino rodamina (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA), anti-topo capra rodamina (JacksonImmunoResearch Laboratories) e anti-coniglio policlonale asino FITC (Santa Cruz) sono serviti come anticorpi secondari.
Tutte le sezioni sono state preparate come descritto sopra. Sono stati incubati con una miscela di antisieri murini contro HD5 (1:200)(Abcam), AQP-2 (1:500), uromodulina (1:500), AQP-1 (1:400) in camera temperatura per 90 minuti. L'anticorpo secondario è stato applicato per 90 minuti a temperatura ambiente e le sezioni sono state montate utilizzando mezzi di montaggio con DAPI. Il siero non immunitario è stato utilizzato come controllo negativo. I vetrini sono stati esaminati con un microscopio Leica DM4000B e fotografati digitalmente utilizzando la fotocamera/il software Spot RT (Strumenti diagnostici, SterlingHeights, MI, USA).
ELISA
Link Biotin Antibody Labeling Kit, Novus Biologicals) è stato aggiunto un anticorpo monoclonale di topo per 2 ore a temperatura ambiente, streptavidina-perossidasi di rafano (Biolegend, San Diego CA, USA) per 30 minuti. Dopo incubazione con soluzione di substrato TMB per 15 minuti (Kem-En-Tec Diagnostics), la reazione è stata terminata con soluzione STOP (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) e letta a una lunghezza d'onda di 450 nm. Le concentrazioni di HD5 del test ELISA sono state divise per la creatinina urinaria per stabilire rapporti standardizzati tra HD5-e creatinina (mg/mg) per tenere conto della diluizione delle urine come descritto sopra.
Riferimenti
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