Studio preliminare su campioni di pasta caratterizzati da composti antiossidanti e loro attività biologica sui reni

Contatto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Federico Di Marco et al

Astratto:La pasta è uno degli alimenti base dellamediterraneodieta e per questo motivo è stato scelto per questo studio per valutarne le proprietà antiossidanti. Sono stati selezionati tre tipi di pasta: grano saraceno, segale e all'uovo. Le analisi di caratterizzazione quali-quantitativa sono state condotte daHPLC-DADper identificare i composti antiossidanti. I dati hanno mostrato la presenza di carotenoidi come la luteina e polifenoli come l'acido indolacetico, (carotenoidi da {{0}},08 a 0,16 mg/100 g,polifenolida 3,7 a 7,4 mg/100 g). Per valutare l'effetto dei metaboliti rilevati, è stata condotta la sperimentazione in vitrorenemodelli di celle: HEK-293 e MDCK. Standard di estratti di -carotene, acido indolacetico, acido caffeico, idroalcolico e carotenoidi da campioni di pasta sono stati testati in presenza di un agente antiossidante per determinare le variazioni di vitalità. Gli standard di -carotene e acido indoleacetico hanno esercitato un effetto protettivo sulle cellule HEK-293 mentre non è stato rilevato alcun effetto su MDCK. Le concentrazioni testate sono verosimilmente nell'intervallo di quelle raggiunte nell'organismo dopo il consumo di pasti di pasta standard. Gli estratti arricchiti di carotenoidi e gli estratti idroalcolici hanno mostrato effetti diversi, osservando i salvataggi per l'estratto idroalcolico di pasta di segale e l'estratto arricchito di carotenoidi di pasta di grano saraceno, mentre la pasta all'uovo ha mostrato effetti dose dipendenti più lievi assumendo un comportamento pro-ossidante ad alte concentrazioni. I risultati preliminari suggeriscono che comportamenti siano riconducibili all'intero fitocomplesso rispetto alle singole molecole e necessitino di ulteriori indagini.

Parole chiave:pasta;mediterraneodieta; polifenoli; carotenoidi; composti antiossidanti;reneSalute;HPLC/DADanalisi

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1. Introduzione

Nonostante ciò non esiste una definizione univoca dimediterraneodieta — a causa delle variazioni e degli adattamenti delle tradizioni culinarie non solo nell'area mediterranea ma anche nel mondo [1] — si può pensare che la dieta mediterranea contenga diversi componenti che soddisfano criteri importanti per una dieta sana: basso contenuto di grassi saturi acidi grassi, alto contenuto di carboidrati compositi, fibre alimentari e molecole antiossidanti e abbondanza nelle verdure.

È difficile stabilire quali alimenti, o principi attivi in ​​essi contenuti,mediterraneola dieta è la principale responsabile dei benefici per la salute; l'accumulo di dati suggerisce che i suoi principali vantaggi risiedono nella combinazione della complessa e ampia varietà di diversi nutrienti che interagiscono sinergicamente e in modo additivo [2].

Negli ultimi anni, la crescente letteratura (studi osservazionali e studi randomizzati di controllo) ha dimostrato i benefici per la salute associati alla dieta mediterranea, riducendo il rischio di sviluppare molteplici malattie croniche come malattie cardiovascolari [3–5], diabete [6–10], cancro [11,12], obesità [13–15] o salute cognitiva [16–19] e aumento dell'aspettativa di vita [20].

Il miglioramento della pressione sanguigna [21], del profilo lipidico [22,23], della resistenza all'insulina [24] e della protezione contro lo stress ossidativo, l'infiammazione, l'aggregazione piastrinica e la disfunzione endoteliale [25-28] sembrano essere i meccanismi d'azione responsabili della gli effetti benefici sulla salute generale. Tutti questi effetti biologici promossi dall'adesione allo stile di vita mediterraneo potrebbero essere rilevanti non solo per le suddette malattie croniche ma anche per la prevenzione della carie renale nella popolazione generale. La malattia renale cronica (CKD) rappresenta un problema di salute pubblica globale, che colpisce oltre 750 milioni di persone in tutto il mondo e agisce spesso in silenzio e senza ostacoli grazie alla sua presentazione clinica asintomatica. Diverse linee di evidenza hanno sottolineato la forte relazione tra la dieta mediterranea e la conservazione renale [29].

Considerando tutti gli effetti sopra citati come fattori di rischio per il declino della funzione renale, il rene può essere considerato uno dei bersagli primari. Una recente meta-analisi di studi di coorte ha dimostrato che le diete a base vegetale come la dieta mediterranea o l'approccio dietetico per fermare l'ipertensione (DASH) erano associate a un minor rischio di incidentiinsufficienza renale cronicae albuminuria nella popolazione generale [30]. Una spiegazione potrebbe essere che frutta e verdura contengono composti bioattivi che proteggono dall'infiammazione e dalla disfunzione endoteliale che promuovono cambiamenti dinamici della frazione di filtrazione, con conseguente riduzione progressiva della velocità di filtrazione glomerulare, espansione del volume del fluido extracellulare, equilibrio ionico anormale e ipossia renale, in definitiva portando alla perdita della funzionalità renale [31-33]. Inoltre, l'aumento del consumo di verdura, frutta, cereali e legumi potrebbe aver portato a una diminuzione del consumo di proteine ​​animali influenzando positivamente l'equilibrio acido-base e l'emodinamica glomerulare delrene, proteggendolo dalla sclerosi glomerulare e dalla perdita di funzione [34-37].

Nonostante ciò, ci sono diversi studi con dati contrastanti sull'impatto di una dieta ricca di proteine ​​sul declino della funzione renale nella popolazione generale [38-41] prove crescenti suggeriscono che la fonte proteica svolge un ruolo importante nella conservazione della funzione renale e che un passaggio dalla fonte di proteine ​​animale a quella vegetale potrebbe essere utile [42,43].

La pasta è uno degli alimenti più consumati al mondo ed è uno degli alimenti base della dieta mediterranea. Tradizionalmente, l'Italia è il principale produttore e leader nel consumo di pasta, anche se la pasta è consumata in tutto il mondo per il basso costo, l'appetibilità e la durata di conservazione più lunga rispetto ad altri prodotti da forno [44]. La pasta è una buona fonte di carboidrati ed energia (100 g di pasta cotta contengono circa 31 g di carboidrati e circa 158 kcal) ma è tipicamente povera di lipidi, proteine, fosforo e potassio che sono componenti nutritivi limitati nella maggior parte delle diete renali per malattia renale (disponibile online all'indirizzo https://fdc.nal.usda.gov, accesso il 1° dicembre 2020). La pasta di frumento naturalmente arricchita, che rappresenta la maggior parte della pasta disponibile in commercio, offre anche buoni livelli di tiamina, riboflavina, niacina, acido folico, ferro e selenio, oltre a polifenoli. Inoltre, la pasta viene sempre consumata in combinazione con altri alimenti che potrebbero essere considerati una fonte più forte di polifenoli, come olio d'oliva e verdure. La pasta viene solitamente prodotta con semola di grano duro, per le sue ottime proprietà reologiche, il colore superiore della pasta, la qualità della cottura, e l'accettazione da parte del consumatore, ma ultimamente la pasta può essere prodotta anche partendo da altri cereali come riso, grano saraceno, segale, farro.

Negli ultimi anni i consumatori sono diventati più consapevoli che una dieta equilibrata, come quella mediterranea, può incidere positivamente sulla salute, motivo per cui l'industria alimentare cerca di soddisfare queste esigenze producendo alimenti e ingredienti alimentari di qualità e funzionali.

Nonostante gli alimenti fortificati siano stati prodotti per scopi salutari, le persone potrebbero essere indotte ad assumerli invece di una dieta equilibrata. Questo è un argomento così importante da spingere la FDA a pubblicare un documento ad hoc intitolato "FDA's fortification policy" per dare una risposta da un lato all'industria alimentare e dall'altro al mondo accademico [44].

Una dieta equilibrata, adeguata e varia è un passo importante verso uno stile di vita felice e sano senza il rischio di sovraccaricarsi con alcuni componenti aggiunti contenuti negli alimenti fortificati. Proprio per questo sono stati riscoperti cereali e pseudocereali non tradizionali che hanno aperto la strada al loro utilizzo come ingredienti alimentari funzionali in quanto possiedono alcune qualità nutritive e funzionali assenti o carenti nei cereali tradizionali. Il grano saraceno e la segale sono ricche fonti di sostanze fitochimiche come i polifenoli, composti fortemente correlati con attività antiossidanti [45,46].

Avviato nel marzo 2005, il progetto MOLI-SANI ha coinvolto circa 25,000 cittadini residenti in Molise (Italia), per valutare i fattori ambientali e genetici alla base di malattie cardiovascolari, tumori e malattie neurodegenerative. Secondo uno studio del progetto MOLI-SANI, l'assunzione di pasta è associata a un BMI più basso e livelli più bassi di obesità centrale. Molti studi hanno confermato che le diete ipercaloriche portano ad un aumento di peso e non una dieta che includa carboidrati. Infatti, se la porzione di pasta è corretta e il sugo non è troppo calorico, un piatto di pasta può avere un contenuto calorico che rispetta il fabbisogno energetico giornaliero [47]. La pasta è tenuta in grande considerazione in quanto le sue caratteristiche sono state associate non solo al controllo del peso corporeo ma anche a diverse proprietà salutari positive [48]. Uno studio randomizzato e controllato condotto su soggetti sani ha dimostrato che i prodotti a base di segale migliorano la regolazione glicemica, aumentano gli ormoni intestinali coinvolti nella regolazione dell'appetito e del metabolismo. La segale riduce i livelli di appetito postprandiale riducendo il desiderio di mangiare ai pasti successivi, aumentando la sazietà e riducendo la fame aumentando gli ormoni della sazietà GLP-1 (peptide simile al glucagone-1) e il peptide YY (PYY). Una risposta glicemica postprandiale inferiore è stata osservata in un gruppo di persone che consumavano cibi a base di segale rispetto a un gruppo di soggetti che consumavano grano raffinato. Ciò accade perché la segale è un cereale a basso indice glicemico che può essere utilizzato anche nei pazienti diabetici [49]. La segale può migliorare il profilo lipidico plasmatico, infatti l'assunzione di segale intera è inversamente associata alla concentrazione di colesterolo LDL, al rapporto LDL/HDL e alla concentrazione di trigliceridi. Questo effetto è dovuto alla presenza di fibre e -glucani [50].

La pasta è nota come fonte di carboidrati, ma può contenere anche composti minori, come i carotenoidi [51], in particolare la luteina, e altre specie antiossidanti come i polifenoli. Queste molecole bioattive possono essere arricchite in diversi tipi di pasta, a seconda delle materie prime. Ad esempio, il contenuto di carotenoidi del grano duro è superiore a quello del grano tenero [52] e il livello di antiossidanti può essere aumentato incorporando la frazione di crusca e l'intero chicco di grano duro nei prodotti a base di pasta [53]. Il grano saraceno è una fonte sostanziale di composti fenolici, vitamine e aminoacidi essenziali [54], mentre l'aggiunta dell'uovo nella preparazione della pasta veicola carotenoidi e luteina. I carotenoidi partecipano all'attività di prevenzione, soprattutto nella sindrome infiammatoria e il loro ruolo è dovuto alle loro proprietà antiossidanti [55] contro i radicali liberi e l'ossigeno singoletto [56]. La pasta contiene diversi tipi di molecole antiossidanti e per i consumatori abituali, un grande consumo può essere considerato un'importante fonte di tali composti salutari.

Qui mostriamo che diversi tipi di pasta, vale a dire grano saraceno, segale e pasta all'uovo, contengono varie quantità di composti antiossidanti, che hanno un ruolo nel migliorare la vitalità delle cellule renali allo stato stazionario o all'induzione dello stress ossidativo.

2. Materiali e metodi

2.1. Campioni

Sono stati analizzati e testati tre campioni di pasta cotta: un campione di pasta integrale di grano saraceno (1), un campione di pasta integrale di segale (2) e un campione di pasta all'uovo di farina di grano duro dl macinata a pietra (3).

2.2. Preparazione dei campioni di pasta

Un totale di 50 g di pasta integrale di grano saraceno o pasta integrale di segale sono stati cotti in 500 ml di acqua per 7 minuti; 50 g di pasta all'uovo di semola di grano duro macinata a pietra sono stati cotti in 500 ml di acqua per 1 min, come indicato dal produttore.

Per ottenere estratti arricchiti in carotenoidi, 10 g di pasta cotta sono stati sciolti in 100 ml di acetone, sonicati a freddo per 30 min. Il campione è stato centrifugato per 5 min a 5000 rpm, il supernatante è stato evaporato a secco con un evaporatore rotante e il residuo è stato sciolto in acetone o DMSO a seconda dell'analisi a valle. Per ottenere estratti arricchiti in polifenoli, 10 g di ciascun campione di pasta cotta sono stati sciolti in 50 mL di EtOH/H2O 70:30 a pH 3,2. I campioni sono stati agitati per 24 h, centrifugati per 5 minuti a 1400 rpm. Il campione è stato centrifugato per 5 minuti a 5000 rpm e il surnatante è stato raccolto e analizzato in HPLC-DAD, mentre un'aliquota è stata evaporata a secco e il residuo sciolto in DMSO per il trattamento cellulare.

2.3. Analisi HPLC-DA-MS

Le analisi quali-quantitative di carotenoidi e polifenoli sono state eseguite utilizzando una cromatografia liquida HP 1100 dotata di un rilevatore DAD e gestita da una workstation HP 9000 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) e collegata a uno spettrometro di accumulo con interfaccia API/elettrospray (Agilent Technologies). Le condizioni operative dello spettrometro di massa erano le seguenti: temperatura del gas, 350 ◦C; portata di azoto, 11,0 l/min; pressione del nebulizzatore, 40 psi; temperatura del quadrupolo, 100 ◦C; e tensione capillare, 4000 V. Lo spettrometro di massa è stato utilizzato in modalità positiva e negativa a 80–180 eV.

I composti sono stati separati utilizzando una colonna LUNA C18 da 250 × 4,6 mm, 5 µm (Phenomenex, Torrance, CA, USA). Gli spettri UV/Vis sono stati registrati nell'intervallo 190–600 nm e i cromatogrammi sono stati acquisiti a 250, 280, 330, 350 e 450 nm. I campioni sono stati analizzati mediante eluizione in gradiente a una velocità di 0,8 mL/min. La fase mobile per i carotenoidi era un sistema a gradiente di solvente lineare multistadio (solvente A: acetone, solvente B: H2O, pH 3,2 di acido formico), a partire dall'80% di acetone fino al 100% in 30 minuti. i polifenoli sono stati eluiti utilizzando il seguente gradiente: dal 90 percento di H2O (regolato a pH 3,2 mediante acido formico) al 100 percento di CH3CN in 40 minuti. Tutti i solventi utilizzati erano di purezza di grado HPLC (BDHLaboratory Supplies, Poole, Regno Unito).

2.4. Analisi quantitativa

La quantificazione dei singoli composti polifenolici è stata eseguita direttamente mediante HPLC-DAD utilizzando una curva di regressione a cinque punti (R2 maggiore o uguale a 0.998) nell'intervallo 0-30 µg sulla base di standard autentici. In particolare, i flavonoli sono stati determinati a 350 divertente quercetina 3- O-glucoside come composto di riferimento mentre i derivati ​​dell'acido caffeico sono stati determinati a 330 nm utilizzando acido clorogenico come composto di riferimento e derivato dell'acido indolo acetico a 280 nm utilizzando 3 acidi indoleacetici (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). I carotenoidi sono stati determinati a 450 nm utilizzando il beta-carotene come composto di riferimento (Extrasynthese, Lione, Francia). In tutti i casi, le concentrazioni effettive dei derivati ​​sono state calcolate dopo aver applicato le correzioni per le differenze di peso molecolare.

2.5. Contenuto fenolico totale

Il contenuto fenolico totale è stato determinato utilizzando il metodo Folin-Ciocalteu, descritto da Singleton et al. [57] e leggermente modificato secondo Dewanto et al. [58]. A 125 µl dell'estratto del campione opportunamente diluito, sono stati aggiunti 0,5 mL di acqua deionizzata e 125 µl del reagente Folin-Ciocalteu. La miscela è stata mantenuta per 6 minuti e poi sono stati aggiunti 1,25 mL di una soluzione acquosa di Na2CO3 al 7%. Il volume finale è stato regolato a 3 ml con acqua. Dopo 90 minuti, l'assorbimento è stato misurato a 760 nm contro l'acqua come bianco. La quantità di fenoli totali è espressa come equivalenti di acido gallico (GAE, mg di acido gallico/100 g di campione) attraverso la curva di calibrazione dell'acido gallico. La curva di calibrazione variava da 20 a 500 µg/mL (R2=0.9969) [57,58].

2.6. Coltura cellulare

Le cellule del rene embrionale umano 293 (HEK-293) e le cellule del rene canino Madin-Darby (MDCK) sono state coltivate in DMEM integrato con GlutaMAX, 10 percento (v/v), siero bovino fetale, 100 U/mL di penicillina e 100 µg /mL di streptomicina a 37 ◦C con il 5% di CO2.

2.7. Saggio MTT

5{{10}}00 cellule/pozzetto MDCK e cellule HEK-293 sono state seminate in piastre da 96 pozzetti e lasciate aderire per 24 ore. Per gli studi di vitalità, le cellule sono state incubate da 24 a 72 ore con beta carotene, acido indolo-3-acetico, acido caffeico (in DMSO) ed estratti di pasta da soli o in presenza di magnesio monoperossi ftalato (MMPP, Sigma-Aldrich , St. Louis, MO, USA). Per i campioni non trattati è stato utilizzato DMSO nel mezzo a concentrazioni uguali a quelle utilizzate per i composti testati. La concentrazione testata per gli standard variava da 2 pM a 10 µM, mentre per MMPP da 0,001 a 0,05 mg/mL. La vitalità cellulare è stata misurata 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio bromuro (MTT, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Le piastre sono state incubate a 37°C per 1 ora e poi il Formazan prodotto dalla riduzione di MTT è stato solubilizzato in DMSO. L'assorbanza è stata determinata su un lettore di micropiastre (Mithras LB 940-Berthold) a 570 nm. La percentuale di vitalità cellulare è stata calcolata utilizzando il rapporto AbsTEST/AbsCTRL.

2.8. Analisi statistica

Ogni esperimento è stato eseguito in quadruplicato e ripetuto almeno tre volte. Le differenze nelle percentuali di vitalità sono state valutate utilizzando il test t di Student accoppiato e l'ANOVA a due vie seguito da un test post hoc con la correzione di Holm per confronti multipli sulle concentrazioni dei metaboliti (p <{2}}.05). i="" risultati="" sono="" stati="" espressi="" come="" media="" ±="" errore="" standard="" e="" l'analisi="" è="" stata="" eseguita="" dall'ambiente="" r-studio="" [59]="" per="" la="" versione="" r="" 3.6.3="" [60]="" utilizzando="" il="" pacchetto="" "tidyverse"="">

3. Risultati e discussioni

3.1. Determination of the Chemical Quality of Pasta Samples

Le informazioni nutrizionali degli alimenti consentono di compiere scelte alimentari e dietetiche informate. La pasta è tradizionalmente preparata con semola, ma anche con altri cereali, tutti contengono amido come costituente principale seguito da proteine, grassi, vitamine, minerali e composti bioattivi [62]. Nella tabella S1 sono riportati i dati nutrizionali.

Per confrontare i valori nutrizionali di diversi tipi di pasta arricchiti in composti bioattivi dovuti alle diverse fonti di cereali o all'integrazione di ingredienti specifici, abbiamo analizzato la pasta di grano saraceno, la pasta di segale e la pasta all'uovo. Al fine di ottenere estratti arricchiti nelle varie sottoclassi di composti presenti nei campioni di pasta, sono state effettuate ed analizzate estrazioni sia idroalcoliche che acetoniche. I singoli polifenoli sono stati provvisoriamente identificati utilizzando i dati dell'analisi HPLC-DAD-MS confrontando e combinando i loro tempi di ritenzione e spettrometria di massa e spettri UV (vedere le figure S1–S5 per lo stesso esempio di spettri MS) e confrontando i risultati con gli standard (kaempferol, quercetina, rutina e acido ferulico) e precedenti opere bibliografiche. In particolare, negli estratti idroalcolici sono stati individuati i derivati ​​flavonoidi, caffeico e dell'acido indoleacetico (Tabella 1): il derivato dell'acido indoleacetico è il composto principale come descritto prima anche per la semola. [63]. Considerando le composizioni relative, la pasta di grano saraceno ha mostrato livelli più elevati di flavonoidi, in particolare i derivati ​​della quercetina sono i principali flavonoli come precedentemente riportato nel grano saraceno [64,65], e una presenza trascurabile di derivati ​​dell'acido caffeico; la pasta di segale ha mostrato livelli più elevati di derivati ​​dell'acido caffeico, in particolare acido ferulico [66] e basso contenuto di flavonoidi; la pasta all'uovo presentava solo una bassa concentrazione di flavonoidi (derivato dell'apigenina [67]) e nessuna presenza di derivati ​​dell'acido caffeico.

A titolo di esempio, in Figura 1 sono presentati i profili cromatografici dei campioni di pasta cotta, registrati a 350 nm. La figura mostra la composizione qualitativa dei campioni analizzati.

La luteina era il principale carotenoide identificato negli estratti di acetone, con contenuto relativo simile rispetto alla specie complessiva di carotenoidi, come mostrato nella Tabella 2, in linea con studi precedenti [68]. I carotenoidi non sono stati rilevati nella pasta di segale.

Anche nei campioni di pasta è stata valutata la presenza di metaboliti secondari antiossidanti (Tabella 3). È stata valutata la capacità antiossidante totale dei biocomponenti, probabilmente dovuta all'attività del fenolo/polifenolo ed è stato dedotto il numero di tali molecole.

3.2. Effetto dell'acido indolo-3-acetico,8-Carotene e acido caffeico sulla vitalità cellulare

La dieta mediterranea è stata riconosciuta come fonte di molecole antiossidanti, che proteggono l'organismo dallo stress ossidativo e supportano lo stato di salute [2]. Pertanto, ci siamo chiesti se le biomolecole rilevate nei nostri campioni di pasta possono influenzare la vitalità cellulare e in che misura. Abbiamo utilizzato cellule renali sane HEK-293 e MDCK per determinare l'attività dei composti standard dell'acido indolacetico, del -carotene e dell'acido caffeico. Il rene è particolarmente suscettibile allo stress ossidativo e l'accumulo di radicali liberi porta a una funzione renale compromessa [69]. Le cellule sono state incubate con una concentrazione scalare dei composti standard e la vitalità cellulare è stata misurata in diversi momenti (Figura 3 e Figura S6).

È stato riscontrato che non esercitano alcun effetto tossico sulle cellule HEK{{0}} per tutte le concentrazioni testate al momento dell'incubazione. Solo il -carotene ha ridotto la vitalità cellulare a forma di U sulle cellule HEK-293 e in modo dose-dipendente nelle cellule MDCK (Figura 3). Sorprendentemente, le concentrazioni probabilmente raggiunte nell'organismo dopo il consumo di un pasto di pasta standard (di solito 80 gr) sono nell'intervallo più basso testato (2 × 10_5 –2 × 10_4 uM, [70 ,71]), che ha fornito un debole miglioramento della vitalità su entrambe le linee cellulari. D'altra parte, a concentrazioni superiori a 0,2 uM, ottenibili solo farmacologicamente, l'acido caffeico ha mostrato un miglioramento significativo della vitalità cellulare, mentre l'acido indolacetico e -carotene hanno mostrato effetti comparabili insieme all'aumento della concentrazione (2-20 uM ) in celle HEK-293 lungo il tempo.

3.3. Effetto dell'acido indolo-3-acetico, -carotene e acido caffeico sulle cellule trattate con MMPP

Ci siamo poi chiesti se l'acido indoleacetico, il -carotene e l'acido caffeico possono contrastare lo stress indotto dall'agente ossidante MMPP. Innanzitutto, abbiamo testato l'effetto MMPP esponendo le cellule HEK-293 e MDCK a diluizioni seriali (0.005–0,05 mg/mL) al farmaco ed è stata determinata la vitalità cellulare. È stata notata una diminuzione dose-dipendente dopo il trattamento con MMPP e l'IC50 era comparabile nelle due linee cellulari testate. Dopo l'incubazione con 20–25 µg/mL di MMPP, la vitalità cellulare è stata significativamente ridotta a circa il 50–60 percento (Figura 4) e la concentrazione inibitoria semimassima (IC50) è stata calcolata in 26 µg/mL per HEK{{16} } e 22 µg/mL per MDCK.

Quindi, abbiamo testato l'attività protettiva delle nostre molecole antiossidanti sulle cellule trattate con MMPP, integrando il supporto cellulare con 2 × 10_5 nM indolacetico, -carotene o acido caffeico. Un effetto leggermente positivo sulla vitalità cellulare di HEK-293 e MDCK è stato confermato dall'impiego degli standard in quanto tali alla dose probabilmente derivata da una porzione di pasta (Figura 5).

Come previsto, MMPP ha ridotto la vitalità cellulare al 60–65%; il trattamento con acido in-indoleacetico o -carotene contrasta l'effetto MMPP e ha ripristinato la vitalità cellulare rispettivamente del 30 percento (p < 0,001)="" e="" del="" 27="" percento="" (p=""> 0,01) sulle cellule HEK-293, mentre l'acido caffeico non ha esercitato alcun effetto significativo. In presenza di un agente ossidante, il beta-carotene e l'acido indolacetico hanno mostrato un effetto protettivo sulle cellule a bassa concentrazione, mentre l'acido caffeico non ha contrastato lo stress ossidativo alla concentrazione necessaria per aumentare la vitalità cellulare. Tali effetti positivi sono probabilmente dovuti alle proprietà antiossidanti dell'acido indolacetico e dei carotenoidi che possono controbilanciare significativamente la citotossicità mediata da MMPP alla dose utilizzata in questa condizione sperimentale. Tuttavia, non è stato osservato alcun salvataggio significativo sulle cellule MDCK trattate con MMPP, suggerendo che, anche se gli standard da soli hanno mostrato un effetto significativamente positivo sulla vitalità cellulare, non sono sufficienti per affrontare lo stress ossidativo indotto da MMPP. Le cellule HEK 293 embrionali sembrano essere più pronte a organizzare una linea di difesa contro lo stress rispetto all'MDCK adulto, presumibilmente a causa di ulteriori sistemi di omeostasi redox cellulare.

3.4. Effetto della frazione arricchita con carotenoidi derivati ​​dalla pasta sulla citotossicità indotta da MMPP

Per valutare gli effetti delle frazioni arricchite di carotenoidi derivate dall'estrazione con acetone di pasta di grano saraceno e pasta all'uovo sulle cellule renali in presenza di stress ossidativo, le cellule HEK-293 sono state incubate con diverse concentrazioni di estratti classificate da 2 × { {3}} uM a 2 × 10_3 uM in presenza di MMPP per 72 h (Figura 6 e Tabella S2). La concentrazione utilizzata si riferisce alla concentrazione di -carotene rilevata nell'estratto (Tabella2). Il contenuto di luteina variava da 1,5 × 10_6 uM a 1,5 × 10_3 uM nella pasta di grano saraceno e da 1,34 × 10_6 uM a 1,34 × 10_3 uM nella pasta all'uovo.

In entrambi gli estratti acetonici, la presenza di fitocomplessi naturali, ha mostrato effetti diversi rispetto al singolo standard, determinando una maggiore attività a concentrazioni inferiori. All'aumentare della concentrazione di estratti di pasta all'uovo, è stata osservata una riduzione della vitalità cellulare. La concentrazione più bassa di estratti di carotenoidi (2 × 10-6 µM) ha indotto un modesto effetto positivo da solo o in presenza di MMPP sulle cellule HEK-293. L'estratto di pasta di grano saraceno ha generato un miglioramento della vitalità cellulare come l'estratto da solo, ma anche in presenza di MPP che varia dal 32 ± 5 percento alla concentrazione più bassa al 21 ± 9 percento per 2 × 10-4 µM.

L'attività degli estratti di acetone è stata valutata anche su cellule MDCK in presenza o assenza di MMPP e confrontata con quella ottenuta in cellule HEK-293 (Figura 7 e Tabella S2).

Gli estratti arricchiti di carotenoidi hanno fornito un effetto complessivo di pro-vitalità a tutte le concentrazioni testate per entrambi i tipi di pasta. Per quanto riguarda il grano saraceno HEK-293, l'estratto di pasta ha fornito un migliore salvataggio durante il trattamento MMPP per tutte le dosi comprese tra il 50 ± 7% e l'82 ± 5% rispetto alle cellule HEK-239; estratti di pasta all'uovo hanno esercitato un piccolo salvataggio solo alla più bassa concentrazione di carotenoidi 2 × 10_6 uM in presenza di MMPP, suggerendo che la composizione specifica degli estratti gioca un ruolo chiave nella risposta. Pertanto, la pasta di grano saraceno ha mostrato una maggiore capacità di salvataggio sulla vitalità cellulare rispetto alla pasta all'uovo e poiché gli esperimenti sono stati condotti utilizzando la stessa quantità di -carotene, la differenza potrebbe essere dovuta alla presenza di composti minori, come i flavonoidi, più nel primo.

Le specie di carotenoidi sono coinvolte in diverse reazioni chimiche che esercitano una duplice natura di ossidante e di antiossidante a seconda del contesto biologico e delle loro concentrazioni: questa elevata reattività è dovuta alla presenza dei doppi legami coniugati [72]. Il loro ruolo antiossidante era associato alla capacità di delocalizzare gli elettroni dati da specie ossidative e radicali [73,74]. In presenza di condizioni ossidative elevate, la loro attività può essere convertita in pro-ossidante [75]. Nei nostri casi, questo reperto è stato osservato nella pasta all'uovo per le cellule HEK-293 (sia da sole che in presenza di MMPP) e MDCK in presenza di MMPP, dove dosi diverse di estratto di acetone producevano effetti opposti.

3.5. Effetto dell'estratto idroalcolico sulla citotossicità indotta da MMPP

Successivamente, abbiamo valutato gli effetti degli estratti idroalcolici di pasta di grano saraceno, pasta di segale e pasta all'uovo sulle cellule renali testando diverse concentrazioni che vanno da 5 × 10_5 uM a 5 × 10_1 uM con o senza MMPP (Figura 8 e Tabella S3). La concentrazione utilizzata si riferisce alla concentrazione del contenuto fenolico totale rilevata nell'estratto (Tabella 3). Secondo il contenuto dei campioni di pasta riportati nella tabella 1, per la pasta di grano saraceno la concentrazione di acido indoleacetico era classificata da 1,85 × 10_5 uM a 1,85 × 10_1 uM, per i derivati ​​dell'acido caffeico era classificata da 3,5 × 10_6 uM a 3,5 × 10_2 uM e per il contenuto di flavonoidi è stato classificato da 2,8 × 10_5 uM a 2,8 × 10_1 uM; per la pasta di segale, la concentrazione di acido indoleacetico era classificata da 2,2 × 10_5 uM a 2,2 × 10_1 uM, per i derivati ​​dell'acido caffeico da 1,95 × 10_5 uM a 1,95 × {{37} } uM e per le specie di flavonoidi da 8,5 × 10_6 uM a 8,5 × 10_2 uM; per la pasta all'uovo, la concentrazione di acido indoleacetico era classificata da 4,25 × 10_5 uM a 4,25 × 10_1 uM, per le specie di flavonoidi da 7,5 × 10_6 uM a 1,85 × 10_2 uM mentre non erano presenti derivati ​​dell'acido caffeico.

L'estratto idroalcolico della pasta all'uovo non ha esercitato alcun effetto significativo sulla vitalità dell'HEK- 293 indipendentemente dalla presenza di stress ossidativo. L'estratto di pasta di grano saraceno ha mostrato un miglioramento della vitalità cellulare dopo il trattamento con MMPP solo alla concentrazione più alta (28 ± 6 percento). Il solo estratto di pasta di segale ha mostrato un miglioramento generale della vitalità cellulare per tutte le dosi che vanno dal 14 ± 7 percento al 18 ± 1 percento nonché in presenza di MMPP dal 27 ± 3 percento al 13 ± 3 percento. Il Phytocomplesso presentato negli estratti è risultato essere più attivo dei singoli standard, esercitando un effetto sulla vitalità cellulare a concentrazioni inferiori rispetto a quest'ultimo. Questi risultati suggeriscono che negli estratti idroalcolici il ruolo principale nel salvataggio potrebbe essere attribuito alla presenza di derivati ​​dell'acido caffeico, osservando un maggiore salvataggio per la pasta di segale e un effetto inferiore/trascurabile per la pasta all'uovo, in cui non sono rilevabili.

L'estratto idroalcolico è stato quindi testato su cellule MDCK nelle stesse condizioni di prima ed è stata valutata la vitalità cellulare (Figura 9 e Tabella S4).

L'estratto idroalcolico di grano saraceno e pasta all'uovo ha mostrato effetti contrastanti sulla vitalità cellulare: il primo la aumenta, il secondo la riduce; nessun effetto sul trattamento MMPP è stato rilevato per entrambi. L'estratto di pasta di segale da solo non ha mostrato alcun effetto notevole sulla vitalità cellulare, ma rivela un forte effetto protettivo contro lo stress ossidativo mediato da MMPP a tutte le concentrazioni che vanno dal 50 ± 7 percento al 61 ± 21 percento. In condizioni standard.

In assenza di MMPP, l'alto contenuto di acido indolacetico nell'estratto di pasta all'uovo sembra esercitare un effetto tossico sulla vitalità cellulare. Confrontando i modelli a due cellule, abbiamo osservato comportamenti diversi rispetto alla pasta di grano saraceno e di segale in assenza di MMPP. In particolare, HEK-293 ha mostrato un aumento di vitalità con il secondo, mentre MDCK con il primo. Le differenze sono legate all'azione dei fotocomplessi che sono caratterizzati da un maggior contenuto di flavonoidi per la pasta di grano saraceno. Il salvataggio sulla vitalità cellulare tra i campioni, come osservato per entrambe le linee cellulari, corrisponde all'aumento del contenuto di derivati ​​dell'acido caffeico nella pasta di segale.

Lo studio dell'interazione tra polifenoli contenenti fitocomplessi e cellule renali potrebbe aiutare a indagare gli importanti effetti noti sulla fisiologia renale esercitati da tali composti [76], concentrandosi su uno dei possibili veicoli, la pasta, tipicamente associato ad una sana alimentazione renale. Come regola generale, i metaboliti dei polifenoli hanno un'emivita plasmatica di alcune ore e vengono rapidamente eliminati dal rene e dal fegato: la via di escrezione urinaria e biliare. La quantità totale di metaboliti polifenolici escreti nelle urine è correlata non solo alla loro concentrazione plasmatica massima, ma anche alla loro capacità di essere escreti dalle vie biliari piuttosto che dalle vie urinarie. Ad esempio, l'escrezione urinaria di quercetina e dei suoi glicosidi rappresenta il 0,3–1,4% della dose ingerita [77]; l'acido caffeico e l'acido ferulico rappresentano rispettivamente il 5,9% e il 27%. Pertanto, i polifenoli derivati ​​dalla pasta possono avere un impatto positivo sulle cellule renali a seconda della loro

quantità e metabolismo. Sono necessari ulteriori studi per definire meglio il loro contributo alla salute dei reni.

Materiali supplementari:Quanto segue è disponibile online all'indirizzo https://www.mdpi.com/article/ 10.3390/nu13041131/s1, Tabella S1: Tabella nutrizionale. Tabella S2: rilevamento della variazione della vitalità cellulare di HEK-293 e MDCK incubati con una quantità crescente di frazione arricchita di carotenoidi da pasta di grano saraceno e pasta all'uovo su terreno medio e MMPP per 72 (HEK-293) e 24 ( MDCK) ore. * p < {{20}}.5,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< {{30}}.001="" .="" tabella="" s3:="" rilevamento="" della="" variazione="" della="" vitalità="" cellulare="" di="" hek-293="" incubato="" con="" la="" quantità="" crescente="" di="" estratto="" idroalcolico="" da="" pasta="" di="" grano="" saraceno,="" pasta="" di="" segale="" e="" pasta="" all'uovo="" su="" terreno="" medio="" e="" mmpp="" per="" 72="" h.="" *="" p="">< 0,5,="" **="" p="">< 0,01,="" ***="" p="">< 0,001.="" tabella="" s4:="" rilevamento="" della="" variazione="" della="" vitalità="" cellulare="" di="" mdck="" incubato="" con="" una="" quantità="" crescente="" di="" estratto="" idroalcolico="" da="" pasta="" di="" grano="" saraceno,="" pasta="" di="" segale="" e="" pasta="" all'uovo="" su="" terreno="" e="" mmpp="" per="" 24="" h.="" *="" p="">< 0,5,="" **="" p="">< 0,01,="" ***="" p="">< 0,001.="" figura="" s1:="" spettri="" ms="" di="" kaempferol="" in="" estratto="" idroalcolico="" di="" pasta="" cotta="" con="" grano="" saraceno.="" figura="" s2:="" spettri="" ms="" della="" quercetina="" nell'estratto="" idroalcolico="" di="" pasta="" cotta="" con="" grano="" saraceno.="" figura="" s3:="" spettri="" ms="" della="" rutina="" nell'estratto="" idroalcolico="" di="" pasta="" cotta.="" figura="" s4:="" spettri="" ms="" dell'acido="" ferulico="" nell'estratto="" idroalcolico="" di="" pasta="" cotta="" di="" segale.="" figura="" s5:="" spettri="" ms="" di="" glicosidi="" dell'apigenina="" nell'estratto="" idroalcolico="" di="" pasta="" cotta="" all'uovo.="" figura="" s6:="" rilevazione="" vitalità="" cellulare="" di="" hek-293="" incubate="" con="" una="" quantità="" crescente="" di="" acido="" indoleacetico,="" -carotene="" e="" acido="" caffeico="" per="" 24="" (a)="" e="" 48="" (b)="" ore="" i="" valori="" riportati="" corrispondono="" alla="" media="" della="" vitalità="" cellulare="" con="" errore="" standard="" su="" tre="" repliche="" biologiche.="" la="" percentuale="" di="" vitalità="" cellulare="" è="" stata="" calcolata="" utilizzando="" il="" rapporto="">

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