Effetti ipoglicemizzanti e ipolipidemici degli antociani del mirtillo mediante attivazione di AMPK: studi in vitro e in vivo Parte 1

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Astratto:I mirtilli sono ricchi di antociani bioattivi, con un alto livello di malvidina, a cui si associano benefici antiossidanti che contribuiscono a ridurre il rischio di diabete. L'obiettivo di questo studio era di indagare gli effetti ipoglicemizzanti e ipolipidemici dell'estratto di antocianine di mirtillo (BAE),malvidina(Mv), malvidina{0}}glucoside (Mv-3-GLC) e malvidina{2}}galattoside (Mv-3-gal) sia nella linea cellulare di epatocarcinoma umano HepG2 che in dieta grassa che combina topi diabetici indotti da streptozotocina. Il trattamento ad alto contenuto di glucosio ha aumentato significativamente lo stress ossidativo epatico fino a 6- volte e ha ridotto la vitalità delle cellule HepG2. Il pretrattamento con BAE, Mv, Mv-3-glc e Mlv-3-gal ha mitigato significativamente questi danni abbassando le specie reattive dell'ossigeno (ROS) dell'87,80,76 e del 91% e aumentando la vitalità cellulare rispettivamente dell'88,79,73 e del 98%. Questi pretrattamenti hanno anche inibito efficacemente l'iperglicemia e l'iperlipidemia, rispettivamente riducendo i livelli di espressione degli enzimi che partecipano alla gluconeogenesi e alla lipogenesi e potenziando quelli coinvolti nella glicogenolisi e nella lipolisi, attraverso la via di segnalazione della proteina chinasi (AMPK) attivata dall'adenosina monofosfato nelle cellule HepG2. Per determinare il ruolo dell'AMPK nella reazione indotta da BAE del metabolismo del glucosio e dei lipidi in vivo, dosi di 100 mg/kg (estratti di antociani di mirtillo -bassa concentrazione, BAE-L) e 400 mg/kg (estratti di antociani di mirtillo -alta concentrazione , BAE-H) sono stati somministrati al giorno a topi diabetici per 5 settimane. I trattamenti BAE hanno avuto un significativo (P<0.05) effect="" on="" body="" weight="" and="" increased="" the="" ampk="" activity,="" achieving="" the="" decrease="" of="" blood="" and="" urine-glucose,="" as="" well="" as="" triglyceride="" and="" total="" cholesterol.="" this="" research="" suggested="" that="">antocianicontribuito all'estratto di mirtillo indottoipoglicemiae gli effetti ipolipidemici nel diabete e nei BAE potrebbero essere un promettente alimento funzionale o una medicina per il trattamento del diabete.

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1. Introduzione

Il diabete mellito (DM) è una malattia ben nota caratterizzata tipicamente dall'incapacità di mantenere normali livelli di glucosio nel sangue. Questo disordine metabolico cronico provoca gravi danni alla salute umana e impone un pesante onere finanziario ai sistemi sanitari mondiali [1]. Questa malattia è classificata in due tipi principali in base alla causa della disregolazione della glicemia. Il diabete di tipo 1 è causato dalla distruzione autoimmune delle cellule beta che porta all'incapacità di produrre insulina mentre il diabete di tipo 2 è caratterizzato da insulino-resistenza recettori dell'insulina, avendo una funzione ridotta, non consentono alle cellule di rispondere adeguatamente all'aumento della glicemia.

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Oltre all'iperglicemia, i diabetici tendono ad avereiperlipidemiaentrambe le condizioni possono provocare danni agli organi e ai tessuti attraverso un aumento dello stress glicossidativo [2]. La produzione di insulina e il danno del recettore dell'insulina sono tra i fattori che causano l'iperglicemia nei diabetici. Nel fegato, la sovraespressione della gluconeogenesi e la glicogenolisi rilascia il glucosio nel flusso sanguigno [3] mentre, nell'intestino tenue, la sovraespressione del trasportatore del glucosio 2(GLUT2) provoca un aumento del trasporto del glucosio [4]. L'iperlipidemia causata dalla sovraespressione della lipogenesi nel tessuto adiposo [5] può anche causare una ridotta captazione del glucosio stimolato dall'insulina e la sintesi del glicogeno che porta all'insulino-resistenza e quindi contribuisce alla progressione del diabete 6]. Le complicanze a lungo termine legate al diabete colpiscono vari organi e comprendono ipertensione, aterosclerosi, retinopatia, nefropatia, ulcere del piede e neuropatia periferica [7].

Attualmente non esiste una cura per il diabete, tuttavia, i suoi effetti possono essere alleviati [8]. Per le persone con diagnosi di diabete di tipo 1, il trattamento comune è una combinazione di regolazione della dieta e un'appropriata assunzione di insulina in base ai carboidrati consumati. Le sfide attuali per i diabetici di tipo 1 includono l'incapacità o le difficoltà nella stima dei carboidrati totali e della dose di insulina appropriata; tuttavia, quasi idealeglicemicolivelli sono possibili dato il progresso tecnologico, compresi i microinfusori per insulina [9]. Per i pazienti affetti da diabete di tipo 2, il trattamento può essere più complesso, includendo combinazioni di regolazione della dieta, esercizio fisico, insulina e altri farmaci con una varietà di meccanismi d'azione che agiscono per abbassare la glicemia[10]. La raccomandazione dietetica comune è di seguire una dieta a basso contenuto di carboidrati [11,12].

Il mirtillo è uno dei frutti che i pazienti diabetici possono consumare e potrebbe ridurre il rischio di diabete mellito di tipo 2 (DM2)[13,14]. I mirtilli sono ricchi di un'ampia varietà di composti benefici per la salute umana tra cui minerali, fibre di acidi organici, acidi fenolici e flavonoidi tra cui flavonoli e antociani [15,16]. Tuttavia, i profili tipici degli antociani includono i galattosidi, i glucosidi e l'arabinoside di delfinidina, malvidina, cianidina, petunidina e peonidina [17] con malvidina e delfinidine che di solito sono i principali contributori al contenuto totale di antociani [18,19]. Nel nostro studio precedente [20], la malvidina era l'antocianidina più abbondante trovata nell'estratto di frutti di mirtillo a occhio di coniglio insieme a delfinidina, cianidina, petunidina e peonidina, il che è in accordo con altri autori che hanno anche riscontrato che la malvidina contribuisce in modo importante al contenuto totale di antociani in diversi tipi di mirtilli [17,21].

Gli antociani del mirtillo possono migliorare la sensibilità all'insulina attraverso la capacità antiossidante e attraverso altre interazioni regolatorie poiché i loro effetti non possono essere spiegati interamente dai primi [13,22]. Gli studi hanno anche scoperto i benefici degli antociani del mirtillo per altri problemi legati al diabete. In uno studio in vitro, Huang et al. [23] hanno scoperto che gli antociani del mirtillo avevano effetti antinfiammatori e antiossidanti sulle cellule retiniche umane in condizioni di alto glucosio. Le cellule esposte a livelli elevati di glucosio avevano una vitalità del 64% mentre quando esposte all'estratto di antocianina di mirtillo, alla malvidina, al malvidina-glucoside o alla malvidina-galattoside, la loro vitalità era del 7-9 percento ,83 percento ,91- percento o { {11}} percento , rispettivamente. D'altra parte, Song et al. [24] hanno scoperto che gli antociani del mirtillo riducono lo stress ossidativo e l'infiammazione nella retina del ratto diabetico. Ai ratti diabetici sono stati somministrati 20, 40 e 80 mg/kg di antociani di mirtillo per via orale per 12 settimane. I ratti con alte dosi di antociani di mirtillo avevano una glicemia più bassa, una maggiore capacità antiossidante e una minore infiammazione nella retina e specie di ossigeno reattive inferiori rispetto a quelli senza antociani di mirtillo.

Sebbene gli antociani di mirtillo forniscano benefici per la salute al fegato e ad altri organi per i diabetici, le azioni ipoglicemizzanti e ipolipidemiche dell'estratto di antocianine di mirtillo (BAE) nelle cellule epatiche umane non sono chiare. Nel presente studio, è stato ipotizzato che BAE, così come Mv, Mv-3-glc e Mv-3-gal, abbiano attività ipoglicemizzanti e ipolipidemiche nelle cellule dell'epatocarcinoma umano (HepG2) e nei topi e che potrebbe mantenere l'omeostasi dei glucolipidi alleviando così lo sviluppo del diabete.

2. Materiali e metodi

2.1. Chimica e reagenti

I mirtilli occhi di coniglio Brightwell (Vaccinium ashei sono stati raccolti da Fujiabian Orchard Picking (Nanchino, Cina) e i loro estratti di antociani sono stati quindi ottenuti e conservati al buio a {{0}} gradi . Il reagente 3- (4,5 dimetiltiazol-2-il)-2,5 difenil-2H-tetrazolio bromuro (MTT) e gli standard malvidina (Mv), malvidina-3-glucosio (Mv{ {11}}glc) e malvidina-3-galattosio(Mv-3-gal) sono stati acquistati da Sigma Aldrich (Shanghai, Cina). Le cellule primarie HepG2, il kit per il dosaggio delle proteine ​​dell'acido bicinconinico (BCA) e I reagenti per il rilevamento del western blotting a chemiluminescenza (ECL) sono stati acquistati da CW Biotechnology (Pechino, Cina).Il siero fetale bovino (FBS), il terreno Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco e la penicillina-streptomicina sono stati acquistati da Gibco (Auckland, Nuova Zelanda). la streptozotocina (STZ) è stata acquistata da Saiguo Biotech (Guangzhou, Cina), mentre il kit di rilevamento del dicloro-diidro-fluoresceina diacetato (DCFH-DA) è stato acquistato dal Beyo-time Institute of Technology (Shan). ghai, Cina). L'albumina sierica bovina (BSA) è stata acquistata da Shyuanye (Shanghai, Cina). Il mangime ricco di grassi e zuccheri (35,5% di grassi, 20% di proteine, 36,4% di carboidrati, 0,1% di cellulosa) e il mangime normale (4,5% di grassi, 23% di proteine, 31,9% di carboidrati, 3,7% di fruttosio e 5,3% cellulosa) per topi sono stati ottenuti da Xietong Bioengineering Co., Ltd (Nanchino, Cina). I kit di test di insulina, trigliceridi (TG), colesterolo totale (TCHD, glutatione perossidasi (GSH-Px) e superossido dismutasi (SOD) sono stati acquistati dal Jiancheng Bioengineering Research Institute (Nanchino, Cina). AndyGene human Forkhead Box O1 (FOXO1) , glucosio-6-fosfatasi(G6Pase), glicogeno sintasi-fosforilazione (p-GS), glicogeno sintasi chinasi-3 beta-fosforilazione (p-GSK3 ), trasportatore del glucosio 2(GLUT2), acetil coenzima A carbossilasi (ACC), lipasi dei trigliceridi ormono-sensibili (HSL),3-idrossi{53}}metilglutaril-coenzima reduttasi (HMGCR) e test immunoassorbenti legati agli enzimi dell'insulina a digiuno del topo (ELISA) sono stati tutti acquistati da Bluegene Biotech (Shanghai, Cina) Le sostanze chimiche ei reagenti utilizzati in questo studio erano tutti di qualità analitica pura.

2.2. Anticorpi

Anticorpi primari contro GS, p-GS (Ser641), proteina legante gli elementi regolatori degli steroli-1c(SREBP-1c) e fosfoenolpiruvato carbossichinasi (PEPCK) sono stati acquisiti da Abcam (Cambridge, Regno Unito) . Anticorpi primari contro la proteina chinasi alfa attivata dall'adenosina monofosfato (AMPKa), p-AMPK a (Thr172), recettore-y-coattivatore attivato dal proliferatore del perossisoma-1 (PGC-1), ACC, p- Gli anticorpi secondari coniugati con ACC (Ser79) e perossidasi di rafano (HRP) sono stati acquistati da Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). L'anticorpo contro la gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) è stato acquistato da Nanjing Beidi Biomed Technology (Nanchino, Cina) mentre l'anticorpo contro l'actina è stato acquistato da Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). Gli anticorpi primari sono stati utilizzati a diluizioni 1:1000 mentre per gli anticorpi secondari sono state utilizzate diluizioni 1:4000.

2.3. Preparazione dell'estratto di antocianine di mirtillo (BAE)

L'estrazione degli antociani del mirtillo è stata eseguita utilizzando il nostro precedente metodo di Huang et al. [25]. I mirtilli congelati a occhio di coniglio sono stati mantenuti a temperatura ambiente fino allo scongelamento. Quindi, sono stati battuti a 10 000 rpm per 30 s utilizzando un omogeneizzatore di base ULTRA-TURRAX T18 (IKA Works Guangzhou, Cina). Una quantità di 250 g di mirtilli è stata quindi immersa in una soluzione di 1000 mL di metanolo contenente l'1% di HCl per 24 ore. L'estratto è stato poi raccolto dopo centrifugazione a 5000×g per 15 min. Dopo evaporazione del solvente a 40 gradi sotto vuoto, il residuo è stato estratto con acetato di etile 1:1 (v/v) tre volte. La fase acquosa contenente antociani è stata raccolta e concentrata mediante evaporazione sotto vuoto per ottenere l'estratto di antociani grezzi. L'estratto è stato ulteriormente purificato con resina macroporosa AB-8 (Sigma Aldrich, Shanghai, Cina). Per rimuovere fruttosio e proteine, l'estratto è stato sottoposto a cromatografia su colonna su 1000 g di resina macroporosa AB-8 per 24 ore di assorbimento e quindi eluito con acqua bidistillata. La frazione antocianica è stata eluita con etanolo all'80% contenente una soluzione di HCl all'1%, concentrata sotto vuoto e quindi essiccata utilizzando un liofilizzatore Eyela FDU-1200 (Tokyo Rikakikai, Giappone) per ottenere un estratto di antocianina di mirtillo (BAE) polvere.

2.4. Colture cellulari e trattamenti

Le linee cellulari HepG2, derivate da un carcinoma epatocellulare distinto in modo specifico, hanno un'alta percentuale di proteine ​​specifiche del fegato. Per questo motivo, sono comunemente usati come modelli di laboratorio per studi sulle cellule epatiche umane [26]. Le cellule HepG2 sono state coltivate in DMEM contenente D-glucosio normale (5,5 mM) integrato con il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina e mantenute a 37 gradi C e incubatrice in atmosfera di CO2 al 5% (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Dopo aver raggiunto il 70-80 percento di confluenza, le cellule HepG2 sono state sottocolture. Quattro ore prima dell'esperimento, le cellule HepG2 sono state messe a riposo in un mezzo di siero ridotto. Dopo il pretrattamento con 5 ug/mL di Mv, Mv-3-glc, Mv-3-gal o BAE per 24 h, le cellule sono state esposte a concentrazioni di glucosio normali (5,5 mM) o elevate (30 mM) a imitano condizioni normali e diabetiche. Le cellule sono state preparate per l'analisi Western Blot e i surnatanti sono stati raccolti per l'analisi ELISA.

2.5. Animali e design sperimentale

I topi maschi sani C57BL/6J (20 ± 2 g) di GemPharmatech (Nanchino, Jiangsu, Cina) sono stati mantenuti in condizioni di laboratorio standard, inclusa una temperatura costante di 25 gradi e un 12-h alternanza giorno e notte. La sottocommissione per la ricerca sulla cura e l'uso degli animali dell'Accademia di scienze agrarie del Jiangsu aveva precedentemente approvato tutte le procedure sperimentali sugli animali. Una dieta ricca di grassi e streptozotocina (STZ) sono stati utilizzati per indurre T2DM nei modelli animali secondo il metodo utilizzato da Islam e Loots [27]. Tutti i topi sono stati nutriti con una dieta ricca di grassi e zuccheri ad eccezione del gruppo di controllo che consumava una dieta normale. Dopo 4 settimane, i topi sono stati digiunati per 12 ore e iniettati per via intraperitoneale con 100 mg/kg di STZ disciolti in una soluzione tampone di citrato di sodio (pH 4.2-4.5). Una settimana dopo l'induzione di STZ, sono stati prelevati campioni di sangue dalla vena della coda dei topi che avevano digiunato durante la notte. I topi che presentavano sintomi diabetici tra cui poliuria, polidipsia e iperglicemia (livello di glucosio nel sangue a digiuno > 11,1 mmol/L) sono stati riconosciuti come T2DM e utilizzati per studi futuri. Per verificare la stabilità del modello T2DM, tutti i topi sono stati nutriti con una dieta normale per una settimana. I topi normali sono stati usati come gruppo di controllo. I topi diabetici sono stati quindi divisi casualmente in tre gruppi: modello, BAE a basso dosaggio (100 mg/kg) e BAE ad alto dosaggio (400 mg/kg). Per 6 giorni consecutivi, la somministrazione intragastrica dello stesso volume di solvente (100 μL), 100 mg/kg o 400 mg/kg di BAE sono stati somministrati al gruppo di controllo, al gruppo modello, al BAE a basso dosaggio e al BAE ad alto dosaggio rispettivamente. Il settimo giorno sono stati misurati il ​​peso corporeo e la glicemia a digiuno. La stessa somministrazione intragastrica è continuata per 5 settimane. I topi sono stati quindi lasciati a digiuno durante la notte e campioni di sangue sono stati raccolti per la preparazione del siero dalla vena cava inferiore e conservati a-20 gradi . Dopo il prelievo di sangue, tutti i topi sono stati anestetizzati e sacrificati. I tessuti del fegato, della milza, dei reni e del timo dei topi sono stati rimossi, pesati e conservati a -80 gradi per ulteriori esperimenti.

2.6. Rilevazione della vitalità cellulare

La vitalità cellulare è stata determinata con il metodo MTT. Cinque ug/mL di Mv, Mv{0}}glc, Mv-3-gal o BAE sono stati utilizzati per il pretrattamento delle cellule per 24 ore. Le cellule sono state quindi trattate con 5 mM o 30 mM di glucosio per 24 ore e 10 μL di 0,5 percento (5 mg/mL) di MTT sono stati aggiunti alle cellule che sono state quindi coltivate di nuovo. Dopo 4 ore, la soluzione MTT è stata rimossa e sono stati aggiunti 100 μL di dimetilsolfossido (DMSO) prima che la miscela venisse agitata lentamente per 10 minuti per dissolvere il cristallo cellulare. L'assorbanza a 490 nm è stata misurata su un lettore di micropiastre StatFax-2100 (Awareness Tech-nology Inc., Plam, FL, USA) per ottenere i valori di densità ottica (OD). Le cellule coltivate con livelli di glucosio normali (5,5 mmol/L) sono state utilizzate come gruppo di controllo, mentre i pozzetti senza cellule sono stati usati come bianco. Per determinare la vitalità cellulare è stata utilizzata la formula seguente: Vitalità cellulare( percentuale )=(valore DO del gruppo campione-valore DO del gruppo vuoto)/(valore DO del gruppo di controllo-valore DO del gruppo vuoto)x 100 percento .

2.7. Visualizzazione della fluorescenza ROS

Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) nelle cellule HepG2 sono state valutate utilizzando il kit di rilevamento DCFH-DA. Dopo un trattamento iniziale con 5 ug/mL di Mv, Mv-3-glc, Mv-3-gal o BAE per 24 h, seguito successivamente da un trattamento con 5 mM o 30 mMglucosio per 24 h, le cellule sono state lavate con PBS, quindi sono stati aggiunti 10 μM di DCFH-DA a ciascun pozzetto e lasciati reagire per 20 minuti a 37 gradi. Le cellule sono state nuovamente lavate accuratamente con PBS e quindi un gruppo di queste cellule è stato immediatamente osservato al microscopio a fluorescenza invertito IX53 (Olympus, Tokyo, Giappone) a emissione di 530 nm e filtri di eccitazione a 485 nm. Le immagini sono presentate con un ingrandimento di 200×. Dopo la dissociazione, è stato raccolto un altro gruppo di cellule e la loro fluorescenza è stata registrata da un lettore di micropiastre multimodale Synergy H4 (BioTek Instruments Inc., Winooski, VT, USA). È stata annotata l'intensità di fluorescenza totale delle cellule in ciascun pozzetto e la generazione di ROS è stata misurata come una piega del controllo.

2.8. ELISA

I kit ELISA sono stati utilizzati per quantificare le proteine ​​coinvolte nella gluconeogenesi (FOXO1, G6Pase, p-GS), la glicogenolisi (p-GSK3), il trasportatore del glucosio (GLUT2), la lipogenesi (ACC e HMGCR) e la lipolisi (HSL) nei supernatanti di HepG2 cellule. È stata anche determinata la quantità di GLUT2 nei fegati di topo. Il kit di analisi delle proteine ​​BCA è stato utilizzato per quantificare la proteina cellulare totale del supernatante. L'assorbanza a 450 nm è stata misurata a 37 gradi su un lettore di micropiastre StatFax{10}} (Awareness Technology Inc., Plam, FL, USA) per determinare i livelli di proteine.

2.9. Analisi Western blotting

Il western blotting è stato eseguito su lisati di HepG2 per misurare il livello proteico di AMPK, p-AMPK, gluconeogenesi (PGCl, PEPCK, glicogenolisi (GS, p-GS) e lipolisi (ACC, p-ACC, SREBP{{4} } c) nelle cellule. È stato anche eseguito il western blotting per determinare le quantità di AMPK, p-AMPK sui fegati di topi indotti dal diabete. Come controllo del carico è stato utilizzato GAPDH o -actina. LAS-3000 imaging (Fuji, Tokyo, Giappone) è stato utilizzato per osservare le bande proteiche e la loro densità è stata quantificata utilizzando il software Bio Profile 1D plus plus (Vilbert Lour-mat, Marne La Vallée, Francia).Tutti i dati sono stati espressi come un cambiamento di piega in il controllo.

2.10. Glicemia a digiuno e test di tolleranza al glucosio

La glicemia a digiuno è stata misurata una volta alla settimana per un periodo di 5 settimane dopo un periodo di 12-ora di digiuno. Per il test di tolleranza al glucosio, i topi sono stati a digiuno per 16 ore e alimentati con 2 g/kg di glucosio al 20 percento (200 μL) per via intragastrica(ig) per determinare la glicemia a 0 ,0,5,1,1,5 e 2h. Il sangue è stato raccolto dalla vena della coda e i livelli di glucosio sono stati misurati utilizzando un glucometro (Sinocare, Changsha, Cina). Anche il livello di glucosio nelle urine dei topi che hanno ricevuto ig è stato misurato per un periodo di cinque settimane.

2.11.Stima degli indici biochimici sierici e dell'attività enzimatica nel fegato dei topi

È stata misurata la quantità di insulina, trigliceridi e colesterolo totale nel siero, mentre l'attività degli enzimi SOD e GSH-PX è stata stimata utilizzando i kit commerciali secondo il protocollo del produttore. L'assorbanza a 500 nm per i trigliceridi (TG) e il colesterolo totale (TCH) e a 450 nm per gli altri (insulina, SOD e GSH-PX) è stata misurata a 37 gradi su un lettore di micropiastre StatFax{5}} (Awareness Technology Inc., Plam, FL, USA).

2.12. analisi statistica

Tutti i dati sono presentati come valore medio ± deviazione standard (DS) di almeno tre esperimenti indipendenti. Le cifre sono state ottenute utilizzando GraphPad Prism versione 8 (GraphPad Software, Inc., CA, USA). L'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA), i test t o il test di confronto multiplo di Sidak sono stati eseguiti per determinare le differenze statistiche tra i diversi gruppi. Le differenze sono state considerate significative in P<>

Questo articolo è estratto da https://doi.org/10.1016/j.redox.2021.102100 Ricevuto il 21 luglio 2021; Ricevuto in forma rivista il 9 agosto 2021; Accettato l'11 agosto 2021