Le interazioni tra gli antiossidanti polifenolici, la quercetina e la naringenina, determinano il comportamento chimico e biologico distintivo delle loro miscele in relazione all'ossidoriduzione Parte 2

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Q a una concentrazione pari a 1 μM tendeva anche a diminuire l'espressione di ALOX12 e MT3 (0.05<><0.09) as="" well="" as="" sod2="" and=""><><0.09).the latter="" gene="" codes="" for="" a="" protein="" that="" belongs="" to="" the="" family="" of="" thioredoxins="" and="" acts="" as="" an="" endogenous="" antioxidant="" facilitating="" the="" reduction="" of="" other="" proteins8.in="" contrast,="" to="" n-,o="" at="" 1="" um="" up-regulated="" gtf2i=""><0.05).the other="" genes="" whose="" expression="" was="" significantly="" elevated="" by="" q="" at="" l="" μm="" were="" gsr,="" hspa1a,="" ptgsi,="" and="" txnrd1;="" all="" play="" key="" roles="" in="" building="" cellular="" defenses="" against="" oxidants.="" up-regulation="" of="" gsr="" is="" crucial="" for="" maintaining="" redox="">omeostasinelle cellule perché la proteina codificata mantiene alti livelli di glutatione ridotto nel citosol39. A sua volta, lo chaperone HSPAlA è necessario per correggere eventuali ripiegamenti errati, anche quelli derivanti dall'esposizione aantiossidanti. Quest'ultimo può spostare l'equilibrio redox verso uno stato ridotto, portando alla più probabile riduzione dei ponti disolfuro asulfidrile

gruppi e quindi modificando la struttura della proteina e quindi la funzione0. Il gene PTGS1 codifica per una proteina che è controllata da un altro membro della famiglia degli enzimi antiossidanti, ovvero la prostaglandina sintasi-241, il quarto gene menzionato-TXNRD{{4 }}codici per la tioredossina reduttasi che mantiene la tioredossina (TXN) nello stato ridotto2.

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Analogamente a 1 μM, anche Q a una concentrazione più alta (10 μM) ha ridotto l'espressione di TXN (p)<0.05） and="" sod2=""><><0.09). furthermore,="" a="" drop="" in="" expression="" was="" observed="" for="" sod1=""><><0.09). the="" investigated="" flavonol="" at="" 10μm="" influenced="" the="" expression="" of="" also="" 4="" genes="" up-regulated="" by="" its="" lower="" concentration∶="" gsr,="" hspa1a,="" ptgs1,="" and="" txnrd2=""><0.05). the="" additional="" up-regulated="" genes="" by="" the="" higher="" q="" concentration="" included="" gstz1="" and="" stk25=""><0.05) as="" well="" as="" gpx4="" and="" sirt2=""><><0.09). the="" protein="" encoded="" by="" gstz1="" is="" a="" member="" of="" the="" glutathione="" s-transferase="" family="" that="" are="" key="" enzymes="" implicated="" in="" the="" detoxification="" of="" electrophilic="" molecules="" by="" conjugation="" with="" gsh4,="" while="" stk25="" codes="" for="" serine/threonine="" kinase="" 25,="" a="" protein="" activated="" by="" oxidative="" stress="" that="" induces="" apoptotic="" cell="" death.="" in="" turn,="" gpx4="" codes="" for="" glutathione="" peroxidase="" 4,="" which="" supports="" the="" antioxidant="" barrier="" of="" the="" cell="" by="" catalyzing="" the="" reduction="" of="" peroxides="" by="" glutathione="" the="" up-regulation="" of="" sirt2,="" encoding="" nad-dependent="" protein="">deacetilasi, che deacetila le lisine interne presenti, ad esempio, negli istoni o nei fattori di trascrizione, svolge un ruolo nella modulazione di processi biologici chiave, come il controllo del ciclo cellulare, la differenziazione cellulare o l'integrità genomica,46.

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La miscela di agliconi a l μM ha ridotto l'espressione di APOE, CCL5, MT3 e MSRA al punto da raggiungere la significatività statistica (p<0.05). the="" apolipoprotein="" encoded="" by="" apoe="" is="" a="" core="" component="" of="" plasma="" lipoproteins="" and="" is="" involved="" in="" their="" production,="" conversion,="" and="" clearance47.="" the="" protein="" encoded="" by="" msra="" carries="" out="" the="">enzimaticoriduzione del solfossido di metionina a metionina, quindi questa proteina funziona nella riparazione delle proteine ​​danneggiate ossidativamente per ripristinare l'attività biologica8. La miscela QN a 10 μM, analogamente alla dose più bassa, ha ridotto l'espressione di APOE, MT3 e MSRA (p<0.05). however="" at="" a="" higher="" concentration.="" the="" set="" of="" down-regulated="" genes="" was="" extended="" to="" incorporate="" cygb="" and=""><0.05). the="" latter="" gene="" sepp1="" encodes="" selenoprotein="" p="" the="" extracellular="">glicoproteinache ha un ruolo antiossidante e sembra essere associato alle cellule endoteliali49. La miscela QN ha solo leggermente potenziato l'espressione del gene PRDX5 che codifica per un membro della famiglia di enzimi antiossidanti perossiredossina, il cui ruolo è quello di ridurre il perossido di idrogeno e l'alchilidroperossidi50.

Discussione

Le basi scientifiche delle osservazioni epidemiologiche che indicano che la frutta e la verdura intera sono più efficienti nella prevenzione delle malattie croniche non infettive rispetto ai composti bioattivi da esse isolati è poco conosciuta. Come possibile spiegazione è stato proposto il concetto di sinergia alimentare, che presuppone l'influenza additiva o addirittura sinergica di diversi ingredienti alimentari sulla salute umana. Tale ragionamento è stato tuttavia minato in una certa misura dalla nostra ricerca precedente in cui abbiamo confrontato la bioattività di verdure (brassicas) diversamente pigmentate e frutti di bosco, contenenti bianchi e antociani, e non abbiamo trovato alcun modello di attività che potesse essere attribuito a varietà colorate, con l'eccezione di una maggiore attività antiossidante nei test chimici51. Né gli effetti biologici sono stati abbinati a quelli della cianidina{3}}O-glucoside isolata alla concentrazione presente nel materiale vegetale studiato12. Anche ulteriori indagini meccanicistiche sulla ricostituzione del cacao non hanno mostrato effetti biologici additivi/sinergici delle miscele di componenti come previsto dal concetto di sinergia alimentare, ma piuttosto una bioattività completamente alterata3. Le successive miscele di polifenoli del cacao sembravano comportarsi come nuove sostanze. Abbiamo ipotizzato che le interazioni tra i singoli componenti della miscela potrebbero creare una nuova entità che mostra proprietà fisico-chimiche modificate con conseguente nuove attività biologiche. Infatti, la varietà di possibili interazioni tra polifenoli (idrogeno, n, idrofobi, chelanti, covalenti ed elettrostatici), scoperte durante le indagini sulla loro applicazione come stabilizzanti di nanoparticelle autoassemblate, hanno dimostrato di produrre una gamma di strutture diverse per funzionalità. È stato anche osservato che questi fitochimici di solito esercitano più di un tipo di forze attrattive stabilizzanti. Nella ricerca attuale, abbiamo studiato come l'interazione di spesso competere per le interazioni in una miscela di soli due antiossidanti polifenolici ha influenzato le sue attività legate al redox rispetto ai singoli componenti.

La prima serie di esperimenti si è concentrata sulla determinazione chimica ed elettrochimica dei parametri che caratterizzano l'ossidazione di flavonoidi individuali e misti 1:1 (rappresentanti del gruppo flavonolo e flavanone), separatamente in forma aglicone(Q N-) e glicoside(R, N plus ) . Le correlazioni tra i risultati di queste misurazioni sono riportate in Fig.8. Le valutazioni iniziali eseguite dal più popolare test batch DPPH hanno mostrato che, sebbene entrambi i flavanoni (N-, N plus ) sembrassero antiossidanti molto deboli, aumentavano l'attività antiossidante delle miscele, sia QN che RN plus , in modo sinergico (Fig. 2A). DPVanalysis ha fornito una spiegazione più approfondita di questo effetto e ha evidenziato l'impatto decisivo della cinetica della reazione. Si è scoperto che i flavanoni studiati rilasciano facilmente elettroni in base all'alto valore del parametro termodinamico E, (Fig.2C). Tuttavia, la cinetica di questo processo era troppo lenta per essere osservabile dai test DPPH e PT. I flavanoli, potenti antiossidanti nel test DPPH e PT, mostravano in DPV le proprietà opposte: termodinamica sfavorevole del rilascio di elettroni, ma un alto tasso del processo di ossidazione. Il confronto delle strutture dei radicali intermedi suggerisce che il radicale flavonolo semichinone è più stabile del radicale flavanone fenossilico a causa dei numerosi meccanismi stabilizzanti (Fig.1). Ne consegue che la stabilizzazione dell'intermedio radicalico è di importanza cruciale per la cinetica della reazione di ossidazione e, di conseguenza, per l'attività riduttiva dei composti studiati.

L'attività antiossidante finale delle miscele studiate viene amplificata attraverso i fattori termodinamici, influendo favorevolmente sul processo di ossidazione, che successivamente migliora la cinetica di reazione (Fig. 2B-F). Un meccanismo più dettagliato di questo miglioramento rimane attualmente inspiegato, molto probabilmente coinvolge specifiche interazioni flavonolo/flavanone. Questo miglioramento è stato osservato non solo in una provetta ma anche in circostanze cellulari, come dimostrato dal saggio CAA in cui l'attività antiossidante di entrambe le miscele, ON e RN plus, ha spostato l'attività antiossidante superiore a quella dei singoli componenti (Fig.4). La parte chimica delle nostre indagini ha rivelato la discrepanza nell'attività antiossidante tra i singoli composti e le loro miscele. Uno può

sottolineare l'importanza della cinetica della reazione di ossidazione per l'attività antiossidante complessiva e suggerire che le interazioni tra i singoli componenti influenzano le proprietà redox della miscela. Deve essere corretto almeno in questo caso quando la presenza di flavonoli (Q, R) nella miscela ha aumentato la capacità dei flavanoni (N-, N plus) di donare elettroni.

La parte successiva della ricerca si è concentrata sul confronto delle proprietà biologiche redox-correlate esibite dai singoli flavonoidi (O, R, N-, N plus ) e dalle loro miscele (ON- e RN plus ). Le cellule di cancro del colon umano HT29 sono servite come modello raccomandato per studi nutrizionali del tratto alimentare umano3, tuttavia in questo studio alcune interpretazioni dei dati si riferiscono anche alla natura neoplastica di questa linea cellulare. Al giorno d'oggi è stato generalmente accettato che l'equilibrio redox è vitale per la sopravvivenza e la funzione cellulare; quindi, l'esposizione ad antiossidanti esogeni e ROS può modulare molti processi cellulari. In caso di stress riduttivo, un'abbondanza di ROS insufficiente può alterare la segnalazione cellulare tramite percorsi redox-dipendenti6. L'eccesso di ROS, invece, porta a stress ossidativo e aumento del rischio di danno ossidativo ai componenti cellulari. Il punto di partenza biologico di questo studio è stata la valutazione dell'impatto degli antiossidanti, individuali e nella miscela, sulla crescita cellulare; l'attività che dipende dall'omeostasi redox cellulare, poiché la corretta concentrazione di ROS è la chiave per l'attivazione della segnalazione che innesca la proliferazione cellulare. I risultati del test di vitalità cellulare MTT hanno rivelato differenze sostanziali tra i trattamenti. I composti puri non hanno avuto un impatto significativo sulla proliferazione cellulare rispetto alle cellule di controllo non trattate; la crescita cellulare ha raggiunto un livello costante nell'ampia gamma di concentrazioni. Al contrario, entrambe le miscele (QN-, RN plus) hanno stimolato in modo significativo la proliferazione cellulare. Quest'ultimo effetto potrebbe non essere necessariamente correlato esclusivamente alle proprietà antiossidanti delle miscele, perché i risultati del test CAA per O erano simili a quelli per la miscela ON. Tuttavia, le miscele, ma non i singoli componenti, apparentemente hanno supportato meglio le cellule HT29 per affrontare lo stress ossidativo residuo, ad esempio ripristinando lo stato redox ottimale; l'effetto osservato in precedenza per antiossidanti così potenti come le catechine55. Sebbene l'aumento sinergico dell'attività antiossidante osservato per le miscele possa essere percepito come un effetto benefico, il fatto che tali combinazioni di antiossidanti stimolino la crescita delle cellule tumorali non è auspicabile. I pro ei contro degli antiossidanti e dei ROS nel cancro sono oggetto di dibattito da tempo e hanno portato alla conclusione che gli antiossidanti possono promuovere il cancro attraverso meccanismi complessi56 che si vede anche qui.

Un'altra scoperta interessante è stata che gli effetti indesiderati dei trattamenti, come l'attività pro-ossidativa dell'N-rivelata dal test CAA e la genotossicità del Q osservata nel test della cometa, sono stati attenuati per le miscele. Quest'ultimo test ha rivelato che il danno al DNA causato dalla concentrazione più alta studiata (100 uM) di O puro è stato ridotto al livello di controllo per la concentrazione equimolare della miscela QN-(Fig. 5) che può essere collegata alla migliore attività antiossidante di ON -osservato in prove elettrochimiche. Nel caso della valutazione dell'attività antiossidante cellulare, gli agliconi hanno mostrato proprietà antiossidanti (O) o proossidanti (N-) più chiare rispetto ai corrispondenti glicosidi (Fig.4). L'N- a concentrazioni fisiologiche non ha annullato la capacità di tamponamento redox delle cellule normossiche HT29, mentre a concentrazioni più elevate rispetto a quelle trovate nel plasma umano ha mostrato un effetto pro-ossidativo dipendente dalla concentrazione che è diminuito con il tempo di esposizione. In generale, gli agliconi hanno diminuito il loro impatto iniziale sullo stato redox cellulare nel corso del tempo (Fig.4). Entrambe le miscele hanno mostrato una maggiore attività antiossidante, apparentemente non influenzata dall'effetto pro-ossidativo osservato per i singoli composti.

L'impatto differenziato delle miscele rispetto ai singoli componenti è stato osservato anche nella versione epigenetica del test della cometa impiegato per monitorare i cambiamenti nella metilazione del DNA. I singoli flavonoidi hanno mostrato la tendenza a diminuire la metilazione globale del DNA in modo dipendente dalla concentrazione, ad eccezione di R, che non ha influenzato questa modifica epigenetica (Fig.6). Entrambe le miscele hanno anche ridotto il livello di metilazione globale del DNA, ma non è stata notata alcuna correlazione con la concentrazione. È degno di nota che non solo lo stato redox può svolgere un ruolo nella combinazione dei polifenoli poiché, nel caso della metilazione del DNA, anche l'impatto dei flavonoidi studiati non sembra essere associato alle loro proprietà riducenti. È noto che la demetilazione attiva implica l'ossidazione iterativa del gruppo metilico nella 5-metilcitosina in forma carbossilica5758, quindi ci si aspetta che gli antiossidanti blocchino questo processo. Nei nostri esperimenti, abbiamo osservato l'impatto opposto. Pertanto, qui molto probabilmente era coinvolto un altro meccanismo, che è l'inibizione della DNA metiltransferasi (DNMT1), l'enzima che catalizza il trasferimento di gruppi metilici alle strutture del dinucleotide CpG nel DNA. Il blocco del mantenimento del pattern di metilazione porta alla demetilazione passiva su cicli consecutivi di replicazione del DNA. I nostri risultati sono in linea con altri studi che hanno dimostrato l'inibizione di DNMT1 da parte della quercetina9. Anche alcuni flavanoni, incluso l'N-, hanno dimostrato di inibire l'attività di DNMT1 in estratti nucleari di cellule KYSE-510 di carcinoma a cellule squamose dell'esofago umano. Il nostro studio ha anche mostrato che la miscelazione di Q con N ha causato un notevole calo del livello di metilazione del DNA a tutte le concentrazioni testate di questa miscela. Un risultato simile è stato osservato per RN plus; tuttavia, l'ipometilazione del DNA si è verificata in misura minore. Tutte queste osservazioni possono essere di interesse da un punto di vista terapeutico Il pattern di metilazione del DNA nel cancro è caratterizzato da un lato dalla perdita globale di metilazione nei corpi genici e nelle regioni intergeniche che porta all'attenuazione della stabilità del genoma!, dall'altro, da ipermetilazione delle regioni ricche di CpG nei promotori e silenziamento trascrizionale dell'espressione dei geni oncosoppressori (TSG)! Pertanto, l'ipometilazione del DNA indotta dai polifenoli può ripristinare l'espressione dei geni silenziati dei TSG e anche aumentare gradualmente l'instabilità del genoma del cancro fino al punto che porta alla morte cellulare.

Gli effetti cellulari descritti dei polifenoli studiati hanno mostrato che non solo il contenuto o la composizione o la biodisponibilità, ma anche le interazioni tra i componenti modulano le proprietà elettrochimiche e biologiche delle miscele. Questa conclusione è stata anche vividamente supportata dall'ultima attività analizzata in questo studio, ovvero la modulazione dell'espressione di un ampio spettro di geni associati alla difesa antiossidante e alla risposta allo stress ossidativo. Il diagramma di Venn (Fig. 7C) riassume l'impatto degli agliconi flavonoidi studiati sulla modulazione dell'espressione genica. Nel caso di composti puri (O, N-) a 1 uM, solo un gene (GTFZI) è risultato essere influenzato da entrambi i flavonoidi. Tuttavia, N ha causato una down-regulation di questo gene, mentre Q ne ha aumentato l'espressione. Questo impatto non è stato mantenuto a concentrazioni più elevate di composti puri né è stato osservato per la loro miscela a qualsiasi dose. N e la miscela QN-down-regolano anche altri due geni, CCL5 e MT3, a l μM e tre geni che abbracciano CYGB, MT3 e MSRA a 10 uM. Più sorprendentemente, non sono state trovate somiglianze nella regolazione dell'espressione dei geni tra Q e QN, né tra Q, N e QN, a nessuna delle concentrazioni studiate. Inoltre, la miscela QN ha modificato significativamente l'espressione di altri tre geni (down-regulation APOE e SEPPI, up-regulation PRDX5) la cui attività trascrizionale non è stata influenzata da nessuno dei singoli componenti. In conclusione, il nostro studio dimostra che le proprietà biologiche delle miscele di polifenoli non sono solo la combinazione di attività potenziate o indebolite esibite dai singoli componenti. Queste osservazioni indicano che la bioattività dei fitochimici nelle miscele deve essere il risultato di interazioni tra componenti che portano all'emergere di una nuova sostanza con nuove proprietà chimiche e biologiche difficili da prevedere. I risultati delle determinazioni effettuate nel nostro studio non si limitano a supportare , ma in realtà ampliano l'idea del concetto di sinergia alimentare sottolineando il fatto che anche piccole modifiche nella composizione di una miscela di sostanze fitochimiche di origine alimentare (probabilmente anche ingredienti alimentari di altre origini) creano una nuova entità il cui impatto sulla salute umana potrebbe non essere necessariamente simile a quello dei singoli componenti. Questa nozione mina l'attuale modo in cui vengono progettati gli integratori alimentari, che si basano sulle indicazioni sulla salute stabilite dalla ricerca sui composti isolati. Dal punto di vista della chemioprevenzione dietetica, lo studio presentato spiega perché l'attuale approccio che enfatizza l'uso di componenti alimentari bioattivi isolati non è stato in grado di eguagliare le osservazioni epidemiologiche fatte per gli alimenti integrali che le persone ingeriscono. Se gli integratori alimentari devono offrire reali benefici per la salute a lungo termine agli individui, è fondamentale che le combinazioni di presunti agenti siano studiate insieme e all'interno di un contesto biologico.

Materiali e metodi

Sostanze chimiche, reagenti. Per lo studio sono stati utilizzati i seguenti composti bioattivi: quercetina (Q), rutina (R), naringina (N più) e naringenina (N-) di Sigma-Aldrich (USA). Sono stati utilizzati metanolo di grado analitico e metanolo di POCH (Polonia) e DMSO di Sigma-Aldrich (USA). Per purificare l'acqua è stato utilizzato il sistema QPLUS185 di Millipore (USA). Per le valutazioni dell'attività antiossidante mediante test spettrofotometrico, è stato applicato il 1-difenil-2-picrylidrazyl(DPPH) di Sigma-Aldrich (USA).0.1 M tampone fosfato di sodio preparato sciogliendo Na, HPO12H , O e NaH, PO2H, O (Sigma-Aldrich, USA) in acqua deionizzata sono stati utilizzati negli studi elettrochimici. L'elettrodo di lavoro e la cella elettrochimica sono stati puliti con la soluzione di permanganato di potassio 10 mM (Sigma-Aldrich, USA) in 95 percento di H, SO, (a/a) (POCH, Polonia). L'elettrodo di riferimento è stato conservato in 3 M KCl (Sigma-Aldrich, USA) sciolto in acqua deionizzata. Tutti i reagenti utilizzati nella coltura cellulare (PBS, terreno 5A di McCoy, tripsina, siero fetale bovino, antibiotici) sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (USA). La soluzione di PBS è stata preparata sciogliendo una compressa in 200 ml di acqua purificata, blu tiazolil bromuro di tetrazolio (MTT) di Sigma-Aldrich (USA) è stato applicato al test MTT. Il test antiossidante cellulare OxiSelect

Il kit è stato acquistato da Cell Biolabs, Inc. (USA). Per il test della cometa sono stati utilizzati i seguenti reagenti: acido cloridrico (HCl), agarosio a basso punto di fusione (agarosio LMP), cloruro di sodio (NaCl, idrossido di sodio (NaOH), acido etilendiamminotetraacetico (EDTA),2-ammino{{1 }}(idrossimetil)-1,3-propandiolo (Trizma-Base), colorante in gel di acido nucleico Sybr Green I e Triton X-100 di Sigma-Aldrich (USA) nonché normale fusione agarosio puntiforme (NMP agarosio) di Bioline (Regno Unito). Inoltre, nel test della cometa sensibile alla metilazione, sono stati applicati la proteinasi K (Merck, USA), gli enzimi di restrizione (HpalI/MspI) e il tampone Tango (Promega, Regno Unito). , RNeasy Mini Kit, RNase-Free DNase set, RT² First Strand Kit, RT²SybrGreen qPCR Mastermix, RT2Profiler PCR Arrays for Oxidative Stress (PAHS 0065) di Qiagen (Germania) sono stati utilizzati negli studi genomici.

Questo articolo è stato estratto dawww.nature.com/relazioni scientifiche