L'inibitore della chinasi LRRK2 ringiovanisce la senescenza cellulare indotta da stress ossidativo nelle cellule neuronali, parte 2

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3. Risultati

3.1. Il rotenone sovraregola l'attività della chinasi LRRK2 e la senescenza cellulare nelle cellule dSH.

Studi precedenti hanno riportato che il rotenone sovraregola l'attività della chinasi LRRK2 sovraregolando l'espressione di LRRK2 [16,19]. Tuttavia, i tassi di apoptosi erano superiori a quelli di altri fenotipi cellulari associati alla senescenza in questi studi a causa dell'uso di un'elevata concentrazione di rotenone. Quindi, le cellule sono state trattate con una bassa concentrazione di rotenone (1uM) per a

FrGURE 3: La senescenza promuove la disfunzione lisosomiale sovraregolando l'attività della chinasi LRRK2 nell'uomo differenziatoneuroblastomalinea cellulare. (a, b) colorazione con glicogeno (verde) delle cellule dSH vive. L'intensità della colorazione di GlycoGREEN è stata normalizzata a quella di Hoechst 33342. L'intensità normalizzata nel gruppo di trattamento è stata espressa in termini di percentuale (percentuale) rispetto a quella nel gruppo trattato con veicolo (dimetilsolfossido). n =4;numero di cellule =15-40.(c, d)I lisosomi attivi, che sono associati a condizioni acide, sono stati colorati conLysoSensorND blu-167. L'intensità della colorazione è stata espressa in termini di percentuale (percentuale) rispetto a quella nel gruppo trattato con veicolo.n =4; numero di celle=17-38.（e, f I livelli di reattivoossigenole specie nelle cellule dSH trattate con rotenone (1 μM) e GSK-KI (1 μM) sono state misurate utilizzando 2',7'-diclorofluoresceina diacetato (DCFDA). L'intensità del DCFDA nei gruppi di trattamento è stata normalizzata a quella dei gruppi trattati con il veicolo. Le intensità stimate di DCFDA sono state espresse in termini di percentuale ( percento ).n =4; numero di celle=25-44.

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durata prolungata (48 ore) come riportato in precedenza [15]. Rote-none ha sovraregolato i livelli LRRK2. Tuttavia, il cotrattamento con rotenone e GSK-KI non ha comportato la sovraregolazione dei livelli di LRRK2 (Figure 1 (a) e 1 (b). Il trattamento con GSK-KI ha mitigato la fosforilazione S1292 indotta da rotenone di LRRK2 (Figure 1 (a) -1(c)). Allo stesso modo, il trattamento con GSK-KI ha attenuato in modo non significativo la sovraregolazione indotta dal rotenone dei livelli di p53 (Figure 1(a) e 1(d)).LRRK2

FicuRE 4: L'inibitore della chinasi LRRK2 attenua l'autofagia alterata indotta dal rotenone e aumenta l'accumulo di a-sinucleina nella linea cellulare differenziata di neuroblastoma, nelle cellule dSH trattate con rotenone, GSK-KI ea-svnucleinafibrille (70 nM) sono state sottoposte a western blotting (a). Le densità delle proteine ​​bersaglio sono state normalizzate a quelle di -actina (bd e f). La densità di LC3B II è stata normalizzata a quella di LC3BI(e). n{5}}.

FicuRE 5: L'inibizione della chinasi LRRK2 attenua la senescenza cellulare indotta dal rotenone e promuove la clearance autofagica della -sinucleina nei neuroni corticali primari del ratto. Gli esperimenti eseguiti utilizzando dSH trattati con -sinucleina fibrilla （70 nM）, rotenone（1μM） e GSK-KI(1 uM) per 48 ore sono stati ripetuti con neuroni corticali primari di ratto.Immunoreattivoi segnali nel western blot (a) sono stati visualizzati utilizzando anticorpi contro le proteine ​​​​bersaglio. Le densità di tutte le proteine, eccetto LC3B II/I, sono state normalizzate a quelle di -actina (bi). (ji) I lisati di (a) sono stati sottoposti alla senescenza associata-galattosidasitest di attività.n= 3.

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è stato riportato che fosforila p53 nel sito TXR [20]. Il trattamento con rotenone ha migliorato la localizzazione nucleare di p53, che è stata mitigata in seguito al cotrattamento con GSK-KI (Figure 2(a)-2(e)). Inoltre, GSK-KI ha mitigato la sovraregolazione indotta dal rotenone di p21 (Figure 1 (a) e 1 (e)). Il rotenone ha sottoregolato la fosforilazione di Rb, che è coinvolta nell'ultimo stadio della via senescente p53-p21. Il trattamento con GSK-KI ha mitigato la fosforilazione indotta dal rotenone di Rb (Figure 1 (a) e 1 (f)). Poiché la via p53-p21 non è l'unica via di segnalazione che media la senescenza, sono stati esaminati i livelli di mRNA di p21 e pl6. Il trattamento con GSK-KI ha mitigato la sovraregolazione indotta dal rotenone di p21. I livelli di mRNA di p16 non erano significativamente differenti tra i gruppi trattati con rotenone e quelli trattati con rotenone/GSK-KI (Figura 2 (f). Il rotenone ha sovraregolato l'attività di -gal, un marcatore di senescenza, che è stato mitigato in seguito al cotrattamento con GSK-KI ( Figure 1 (a) e 1 (g)). Inoltre, i risultati del PLA di pS1292 LRRK2 e LRRK2 totale nelle cellule dSH hanno rivelato che il rotenone ha aumentato i livelli di -gal e l'attività della chinasi LRRK2 (Figure 1 (h) {{39 }}i). Questi risultati indicano che il rotenone promuove la senescenza cellulare attraverso le vie p53, p21, Rb e -gal sovraregolando i livelli di LRRK2 e la sua attività chinasica che l'inibizione di LRRK2 ha mitigato la senescenza cellulare indotta dal rotenone nelle cellule dSH.

3.2. La senescenza cellulare altera la degradazione della sincronia nelle cellule dSH e nei neuroni corticali primari del ratto sovraregolando l'espressione della chinasi LRRK2.

La senescenza cellulare altera l'attività della via autofagia-lisosomiale [14, 21]. Quindi, l'attività lisosomiale (LysoSensor) è stata esaminata insieme ai marcatori di senescenza, all'attività di SA-gal e ai livelli di ROS in condizioni sperimentali identiche (Figura 1). Il rotenone ha aumentato l'attività di SA-gal (Figure 3 (a) e 3 (b)) e ha ridotto l'attività lisosomiale (Figure 3 (c) e 3 (d)), che sono state mitigate in seguito al cotrattamento con GSK-KI. Inoltre, GSK-KI ha mitigato la sovraregolazione indotta dal rotenone dei livelli di ROS, che indicava che il rotenone promuove la senescenza inducendo stress ossidativo (Figure 3 (e) e 3 (f)). In precedenza, avevamo dimostrato che la fosforilazione di p53 mediata da LRRK2-, così come il mutante LRRK2 G2019S, promuoveva l'accumulo di -syn [10]. L'effetto della senescenza cellulare sull'aggregazione di -syn, che esacerba la progressione del PD, è stato esaminato utilizzando le fibrille -syn. Il rotenone ha sovraregolato i livelli di p62 e LC3BI/I, che rappresentano la sospensione del flusso autofagico, aggregati -syn (Figure 4 (a), 4 (d) e 4 (f) e attività della chinasi LRRK2 (Figure 4 (a) )-4(c)) nelle cellule dSH. Il trattamento con GSK-KI ha mitigato la sovraregolazione indotta dal rotenone degli aggregati p62, LC3B I/l e -syn ma non ha influenzato i livelli di LRRK2. Inoltre, il trattamento con GSK-KI ha mitigato la sovraregolazione indotta dal rotenone di SA

FIGURA 6: Il rotenone promuove la senescenza cellulare nel mesencefalo del topo sovraregolando l'espressione della chinasi LRRK2. (a) Uno schema dell'esperimento del modello murino. (b) Sono rappresentate le misurazioni del tempo di caduta dal rotarod. I tempi di caduta di ciascun topo nel gruppo sperimentale (n =4) sono stati registrati tre volte, i lisati del mesencefalo sono stati sottoposti a test di attività della galattosidasi associata alla senescenza (c), western blotting (de) e immunosorbente legato all'enzima test per rilevare l'oligomero filamentoso -sinucleina (f), n =4. * indica i risultati dell'analisi della varianza a due vie (ANOVA), seguito dal test post hoc di Tukey.# indica i risultati dell'ANOVA unidirezionale, seguito dal test post hoc di Tukey."*p<0.01 and="" p=""><0.001. β-gal="" and="" downregulation="" of="" lysosomal="" enzyme(cathepsin="" d)activities="" (supplementary="" figure="" 1).="" to="" determine="" the="" mechanism="" underlying="" rotenone-mediated="" lrrk2="" kinase="" activation="" and="" cellular="" senescence,="" the="" experiments="" performed="" with="" dsh="" cells="" were="" repeated="" using="" rat="" primary="" cortical="" neurons.="" rotenone="" and="" gsk-ki="" exerted="" similar="" effects="" on="" lrrk2="" kinase="" activity(figures="" 5(a)-5(c)),="" p53-p21="" pathway="" activation="" (figures="" 5(a),="" 5(d),="" and="" 5(e)),β-gal="" levels="" (figures="" 5(a)="" and="" 5(f)),="" autophagy(figures="" 5(a),5(g),="" and="" 5(h)),="" α-syn="" aggregation(figures="" 5(a)="" and="" 5(i)),and="">

FIGURA 7: Ruolo dell'inibitore della chinasi LRRK2 nell'indurre la senescenza cellulare durante la progressione del morbo di Parkinson. Una rappresentazione schematica dei risultati di questo studio. L'inibitore della chinasi LRRK2 attenua la senescenza cellulare indotta dal rotenone, la via alterata dell'autofagia-lisosomiale e una maggiore aggregazione della sinucleina nei neuroni dopaminergici.

-attività gal (Figura 5 (j)) nei neuroni corticali primari del ratto come quelli osservati nelle cellule dSH. Pertanto, la senescenza cellulare indotta dal rotenone promuove la sovraregolazione della chinasi LRRK2 e altera le attività autofagiche-lisosomiali, che porta a una maggiore aggregazione -syn.

3.3.L'inibizione della chinasi LRRK2 allevia la senescenza cellulare indotta dal rotenone nel mesencefalo del topo.

Per verificare i risultati in vitro, è stato eseguito un test in vivo. I topi sono stati iniettati per via intraperitoneale con rotenone (0,75 mg/kg di peso corporeo) e MLi-2(1 mg/kg di peso corporeo), un inibitore della chinasi LRRK2 permeabile alla barriera ematoencefalica, una volta ogni due giorni per due settimane (Figura 6(a)). Negli esperimenti eseguiti utilizzando alte concentrazioni di rotenone, l'apoptosi era il fenotipo associato alla senescenza cellulare predominante. Quindi, le cellule dSH e i neuroni primari del ratto sono stati trattati con basse concentrazioni di rotenone per una durata prolungata. Il rotenone ha ridotto in modo non significativo l'attività locomotoria dei topi, come evidenziato dal tempo ridotto di caduta dal rotarod (Figura 6 (b)). Tuttavia, il rotenone ha sovraregolato l'attività SA-gal nel mesencefalo, che è stata significativamente mitigata in seguito al cotrattamento con MLi-2(Figura 6(c)). Inoltre, il trattamento con MLi-2 ha attenuato in modo non significativo l'attivazione indotta dal rotenone della chinasi LRRK2 e del percorso p53-p21 nel mesencefalo (Figure 6(d) e 6(e)). Inoltre, il rotenone ha sovraregolato in modo significativo i livelli di -gal, che è stato mitigato in co-trattamento con MLi-2. L'ELISA è stato eseguito per misurare i livelli di oligomeri sincronici fibrillari nel lisato mesencefalo[17]. Il trattamento con MLi-2 ha mitigato la sovraregolazione indotta dal rotenone degli oligomeri sincronici fibrillari (Figura 5 (f)). Pertanto, la somministrazione intraperitoneale di rotenone a basse dosi ha promosso la senescenza cellulare nel mesencefalo del topo, che ha provocato l'aggregazione -syn nel mesencefalo. Il trattamento con l'inibitore della chinasi LRRK2 ha mitigato la senescenza cellulare indotta da rotenone nel mesencefalo.

4. Discussione

Il meccanismo alla base della senescenza cellulare nei neuroni dopaminergici non è stato chiarito. L'invecchiamento è un fattore di rischio per il PD. Quindi, deve essere considerata la correlazione tra invecchiamento e senescenza cellulare. Studi recenti hanno suggerito che la senescenza cellulare associata al PD è correlata alla perdita di funzioni cellulari [14,22,23), come la perdita della funzione LRRK2 nei neuroni risultante dalla deregolazione della via autofagia-lisosomiale [24, 25] . In precedenza, avevamo dimostrato che il mutante LRRK2 G2019s alterava l'autofagia in una linea cellulare dopaminergica di topo fosforilando la leucina-tRNA sintetasi [26]. Un alterato percorso autofagia-lisosomiale promuove l'aggregazione -syn [1l,27]. Quindi, l'attività di LRRK2 può mediare l'aggregazione -syn. L'inibizione o la prevenzione dell'aggregazione -syn utilizzando un anticorpo anti- -syn è una potenziale strategia terapeutica per il PD [28-30]. Tuttavia, l'anticorpo anti- -syn non ha esercitato un marcato effetto terapeutico sul PD nell'uomo. Ciò può essere dovuto alla clearance incompleta degli aggregati -syn, comprese le fibrille, le protofibrille e gli oligomeri tossici. Gli anticorpi specifici per la conformazione per gli oligomeri -syn potrebbero non eliminare tutti gli oligomeri tossici o inclini a LB nel cervello dei pazienti con PD. L'inibizione della chinasi LRRK2 può attivare la via autofagia-lisosomiale e promuovere la clearance a-syn. Pertanto, la somministrazione concomitante di un inibitore della chinasi LRRK2 e di un anticorpo anti{30}}sin esercita un effetto terapeutico sinergico sul PD.

Il percorso p53-p21 è coinvolto in diversi processi cellulari, tra cui l'apoptosi e la senescenza [31]. La fosforilazione di Rb è la fase di gating della via di segnalazione della senescenza cellulare [32]. Inoltre, l'attivazione dell'espressione di p16 media la senescenza cellulare [33]. I livelli di espressione di p16 e p21 sono sovraregolati nei neuroni gangliari della radice dorsale di topi iniettati con cisplatino [34]. Inoltre, l'analisi post mortem di pazienti con sclerosi laterale amiotrofica/malattia del motoneurone ha rivelato che l'espressione di p16 e p21 era sovraregolata negli astrociti della corteccia associata frontale. Tuttavia, i neuroni hanno mostrato una sovraregolazione di p21 con livelli non rilevabili di p1635]. I risultati di questo studio hanno indicato che la senescenza cellulare era principalmente mediata dal percorso p53-p21 piuttosto che dal pl6 sovraregolato (Figure 1,2 e 4). Anche le risposte infiammatorie sono associate alla senescenza. Gli astrociti sono coinvolti nella neuroinfiammazione nel cervello [36]. La senescenza degli astrociti contribuisce alla progressione delle anomalie cognitive [37]. Pertanto, la neuroinfiammazione può essere correlata alla senescenza negli astrociti. Studi futuri dovranno studiare la correlazione tra neuroinfiammazione e senescenza cellulare e le sue distinte vie di segnalazione.

In questo studio, il rotenone ha sovraregolato l'attività della chinasi LRRK2. Tuttavia, questo studio non ha dimostrato l'effetto dell'inibitore della chinasi LRRK2 sul mutante G2019S. La senescenza cellulare è stata esaminata dopo la trasfezione del mutante G2019SLRRK2 nelle cellule dSH e nei neuroni primari del ratto. L'espressione prolungata di G2019S LRRK2 nelle cellule dSH e nei neuroni primari del ratto ha aumentato significativamente i livelli di -gal e l'attività di SA -gal. Il trattamento delle cellule trasfettate con G2019S LRRK2-con l'inibitore della chinasi LRRK2 o l'espressione di D1994A LRRK2 non ha sovraregolato i livelli di -gal e l'attività di SA -gal (Figura 2 supplementare). In precedenza, avevamo segnalato che i livelli di aggregati -gal e -syn nel lisato cerebrale di 24- topi che esprimono G2019S di una settimana erano superiori a quelli dei compagni di cucciolata di pari età [10]. Il trattamento con un inibitore di LRRK2 non ha attenuato marcatamente la senescenza cellulare indotta da rotenone a basse dosi nei topi. Tuttavia, i progressi farmacologici possono aumentare l'effetto terapeutico degli inibitori della chinasi LRRK2 nei topi (Figura 6). Gli studi futuri devono concentrarsi sul miglioramento degli effetti farmacologici e del profilo di sicurezza degli inibitori della chinasi LRRK2. La somministrazione di un inibitore della chinasi LRRK2 può servire come strategia terapeutica fattibile per PD con elevata attività della chinasi LRRK2 in quanto può mitigare lo stress ossidativo o gli effetti tossici dei mutanti LRRK2 (Figura 7). Attività della chinasi LRRK2 nei biofluidi umani, come il siero, liquido cerebrospinale e urina possono fungere da biomarcatore prognostico per determinare il trattamento ottimale per i pazienti con PD che mostrano una maggiore attività della chinasi LRRK2.

5. Conclusioni

I risultati di questo studio suggeriscono che il trattamento con inibitori della chinasi LRRK2 mitiga la senescenza cellulare indotta da un dosaggio lieve ea lungo termine di rotenone. Questo studio ha dimostrato il ruolo critico di LRRK2 nel percorso p53-p21, che media la senescenza cellulare, e ha fornito nuove informazioni per lo sviluppo della terapia del PD utilizzando gli inibitori della chinasi LRRK2.

Questo articolo è tratto da Hindawi Oxidative Medicine and Cellular Longevity Volume 2021, ID articolo 9969842, 16 pagine https://doi.org/10.1155/2021/9969842