Espressione genica immunitaria e reti funzionali in classi distinte di nefrite lupica Ⅰ
Nov 08, 2023
ASTRATTO
Obiettivo Esplorare l'utilità della piattaforma NanoString inchiarire il renetrascritti immunitari per la nefrite lupica (LN) di classe III, IV e V utilizzando una coorte retrospettiva difissato in formalina e incluso in paraffina(FFPE) tessuto bioptico renale.
Metodi: L'analisi del trascritto del gene immunitario è stata eseguita utilizzando la piattaforma NanoString nCounter sull'RNA di LN (n=55), malattia della membrana basale sottile (TBM) (n=14) e nefropatia membranosa (MN) (n{ {2}}) FFPEbiopsia renaletessuto. I campioni LN erano costituiti da biopsie singole di classe III (n=11), IV (n=23) e V (n=21) senza lesioni miste. L'espressione genica differenziale è stata eseguita con NanoString nSolver, con visualizzazioni di grafici di vulcani e mappe di calore generate in R. Trascrizioni significative sono state interrogate per identificare reti funzionali utilizzando termini di STRING e ontogenesi genetica.
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Risultati Rispetto alla TBM, abbiamo identificato 52 geni espressi in modo significativo in modo differenziale comuni a tutte e tre le classi LN. L'analisi del percorso ha mostrato un arricchimento per la segnalazione dell'interferone di tipo I (IFN), il complemento e le vie MHC II, con la maggior parte che mostrava la massima espressione nei LN di classe IV. Le nostre biopsie LN di classe IV hanno mostrato anche una significativa sovraregolazione della segnalazione di NF-κB e un arricchimento immunologico rispetto alle biopsie LN di classe V. Le trascrizioni del percorso dell'IFN di tipo I distinguevano la classe V LN da MN.
Conclusione La nostra analisi trascrittomica dell'intera sezione renale ha fornito approfondimenti sul profilo molecolare dei LN di classe III, IV e V. I dati hanno evidenziato importanti percorsi comuni a tutte e tre le classi e percorsi arricchiti nelle nostre biopsie LN di classe IV. La capacità di rivelare percorsi molecolari nei LN utilizzando sezioni bioptiche intere in FFPE potrebbe avere utilità clinica nella selezione del trattamento per i LN.
INTRODUZIONE
Nefrite da lupus(LN) è un'importante manifestazione sistemicalupus eritematoso(LES) e si sviluppa in circa il 40% dei pazienti.1 La sua prevalenza è influenzata dall'età (più alta nel LES a esordio infantile) e dall'etnia (più alta nei pazienti non caucasici) ed è inversamente associata allo stato socioeconomico.2 Ilbiopsia renaleè una parte importante della gestione della LN3 4 e sono stati compiuti sforzi significativi per correlare i cambiamenti osservati nella biopsia alla patogenesi, alla selezione del trattamento e alla prognosi.1 Fondamentale per questo è stato lo sviluppo di un sistema di classificazione della LN che incorporasse definizioni standardizzate delle lesioni bioptiche per ridurre la variabilità tra le segnalazioni.
La classificazione consensuale del 2003 della International Society of Nephrology/Renal Pathology Society (ISN/RPS) di LN5 ha descritto sei classi: LN mesangiale minimo (classe I); LN proliferativo mesangiale (classe II); LN focale (classe III); LN diffuso che potrebbe essere ulteriormente suddiviso in LN proliferativo segmentale diffuso (classe IV-S) e globale diffuso (classe IV-G); LN membranoso (classe V) e LN sclerosante avanzato (classe VI). Le lesioni glomerulari attive (A, ad esempio, ipercellularità endocapillare, necrosi fibrinoide, semilune cellulari e microcellulari) e croniche (C, ad esempio, sclerosi glomerulare, semilune fibrose) sono state definite e denotate anche quando si descrivono le classi III e IV. Ad esempio, la classe IV-G (A) descriveva LN proliferativa globale diffusa con lesioni attive. È stato proposto un aggiornamento di questa classificazione.6 Le raccomandazioni includevano l'eliminazione delle suddivisioni delle classi IV-S e IV-G poiché queste non influenzano l'esito. In una meta-analisi, il verificarsi di entrambimalattia renale allo stadio terminaleOraddoppio della creatinina siericanon differivano tra le classi IV-S e IV-G.7 È stato inoltre proposto di sostituire i descrittori attivo e cronico con indici di attività e cronicità derivati dall'attività del lupus NIH e dal sistema di punteggio,8 consentendo così una valutazione quantitativa dell'attività (a punteggio da 0 a 24) e cronicità (un punteggio da 0 a 12).
La classe LN è fondamentale per informare la gestione.3 L'immunosoppressione è raccomandata nei LN di classe III e IV attivi, ma non nei LN di classe II. La decisione di avviare l'immunosoppressione nei LN di classe V è influenzata dal grado di proteinuria e dalla sua risposta al blocco renina-angiotensina-aldosterone. Il mancato controllo della proteinuria 12 mesi dopo il trattamento è associato alla progressione verso la malattia renale cronica9-11, quindi l’obiettivo della gestione è ridurre la proteinuria con l’obiettivo di una risposta clinica completa (<0.5–0.7 g per 24 hours).
La sola classe LN è meno affidabile nell’informare i risultati perchéfattori di rischio per lo sviluppo di malattia renale cronicaincluderecaratteristiche clinichee perché includono caratteristiche istologiche non catturate dalle definizioni delle classi LN. Questi includono il grado di fibrosi interstiziale e atrofia tubulare (IFTA) e lesioni glomerulari specifiche come la necrosi fibrinoide e le semilune fibrose.12 La quantificazione di lesioni renali individuali selezionate e ben definite può fornire informazioni sulla prognosi. Ciò è evidente nella nefropatia da IgA, dove il punteggio della cellularità mesangiale, dell'ipercellularità endocapillare, della sclerosi segmentale, dell'atrofia tubulare, della fibrosi interstiziale e delle semilune per formare il punteggio MEST-C ha dimostrato di favorire la previsione del rischio.13-15 Le revisioni proposte all'ISN /La classificazione consensuale RPS 2003 di LN potrebbe colmare queste carenze6 ma è ancora basata sull'uso della morfologia. Di conseguenza, è necessario studiare i percorsi molecolari all'interno delle biopsie dei LN e comprendere come questi si collegano alle classi dei LN16 17 e agli esiti del trattamento.18 19 In termini di utilità clinica, l'analisi trascrittomica delle biopsie renali è la più avanzato nella diagnosi del rigetto renale mediato da anticorpi in cui un aumento dell'espressione delle trascrizioni genetiche nel tessuto bioptico è stato aggiunto, in attesa di convalida, ai criteri morfologici convalidati.20 Determinare l'utilità dell'utilizzo dei dati trascrittomici per migliorare l'utilità clinica del rene biopsia nel LES, abbiamo utilizzato la tecnologia NanoString per studiare l'espressione di 750 trascritti immunitari e correlati all'infiammazione in sezioni fissate in formalina e incluse in paraffina (FFPE) da 55 biopsie LN, 14 biopsie con malattia della membrana basale sottile (TBM) e 9 biopsie con nefropatia membranosa (MN).
METODI
Campioni: il tessuto bioptico renale FFPE è stato ottenuto da campioni archiviati di LN, TBM e MN in eccedenza per l'uso clinico e dove era disponibile tessuto adeguato per l'analisi. Sono state escluse biopsie di lupus con lesioni miste o cicatrici significative. La TBM è stata utilizzata come controllo della malattia a causa della mancanza di disponibilità di biopsie renali normali. I parametri clinici sono stati raccolti retrospettivamente dalle cartelle cliniche. La matrice del punteggio dell'interferone (IFN) è stata ottenuta come riportato in precedenza.21 La risposta completa è stata definita come un rapporto proteine/creatinina urinarie (uPCR) di<50mg/mmol and an estimated glomerular filtration rate (eGFR) of ≥60mL/min, or if <60mL/min at baseline not fallen by >20% entro 1 anno dopo la biopsia. La risposta parziale è stata definita come uPCR<300mg/mmol with a≥50% improvement from baseline and eGFR criteria the same as for complete response. Non-response was defined as failing to achieve partial response by 1 year.
Estrazione dell'RNA
Sei sezioni di tessuto intero spesse 10 μm sono state ottenute mediante microtomo da ciascun blocco FFPE, dopo la rimozione di due sezioni da 4 μm. Per prevenire la contaminazione incrociata, l'attrezzatura è stata pulita con RNase Away tra i campioni e per ciascun campione è stata utilizzata una lama nuova. L'isolamento dell'RNA dell'intero tessuto è stato eseguito lo stesso giorno utilizzando il kit RNeasy FFPE (Qiagen, n. 73504) e la concentrazione di RNA è stata valutata dallo spettrofotometro NanoDrop ND1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA; dati supplementari online S1).
Analisi del trascrittoma
Transcriptome analysis was performed using 100ng of total RNA on the NanoString nCounter platform (NanoString nCounter FLEX Dx analysis system, NanoString Technologies, Seattle, Washington, USA) with a probe CodeSet comprising the human PanCancer immune profiling panel (730 immune-related genes, 40 housekeeping genes, 6 positive control genes, 8 negative control genes) and additional 20 custom probes selected based on literature review (online supplemental table 1). Samples were run using two CodeSets which differed only by 10 unique probes, enabling us to analyze 750 endogenous transcripts across the 78 samples. CodeSet One: LN class III (n=6), class IV (n=9), class V (n=8), TBM (n=8), MN (n=1). CodeSet Two: LN class III (n=5), class IV (n=14), class V (n=13), TBM (n=6), MN (n=8). All samples passed NanoString quality control parameters (image quality control, binding density, positive control linearity and limit of detection). To control for inter-CodeSet variation and batch variability we used the nSolver Cross Reporter Library File (RLF) function to calibrate raw counts of overlapping probes using an identical sample run on both CodeSets. To reduce technical bias, and increase confidence and reproducibility, background thresholding was set at 100 counts, which is >doppio (media +2 DS) delle sonde di controllo negativo. I conteggi sono stati normalizzati alla media geometrica di 10 geni housekeeping (FCF1, HPRT1, MRPS5, MTMR14, POLR2A, PRPF38A, SDHA, SF3A3, TUBB e ZC3H14), selezionati poiché espressi in tutti i tipi di campioni. I conteggi normalizzati per tutti i campioni sono elencati nei dati supplementari online S2.
analisi statistica
L'espressione genica differenziale (DGE) è stata eseguita utilizzando l'algoritmo Fast/Approxi mate del risolutore di analisi avanzata (V.4) che utilizza il modello binomiale negativo semplificato per tutte le sonde, tranne nei casi in cui l'algoritmo non converge e viene utilizzato il metodo di regressione lineare. LN, MN o la classe LN (III, IV e V) sono state utilizzate come variabili indipendenti e TBM come gruppo di riferimento. Il conteggio della soglia è stato fissato a 100 e la frequenza di osservazione all'interno dei campioni è stata fissata all'8%; Il valore P è stato regolato utilizzando il metodo Benjamini-Hochberg con la soglia di falsa scoperta impostata su 0.05. I grafici del vulcano sono stati prodotti utilizzando il pacchetto Enhanced Volcano (https://github.com/kevinblighe/EnhancedVolcano) in R.22. La visualizzazione della rete di associazione di proteine funzionali è stata eseguita utilizzando il database STRING (https://string-db.org/) , utilizzando l'intera rete STRING. I bordi della rete sono stati definiti dalla confidenza e le interazioni sono state impostate sul punteggio di interazione di confidenza più alto (maggiore o uguale a 0,9). I nodi disconnessi all'interno delle reti non venivano visualizzati. Sono stati valutati geni espressi in modo differenziale significativo per l'arricchimento dei termini di Gene Ontology (GO) (processi biologici, funzioni molecolari, componente cellulare), percorsi di reactome e cluster di rete locale STRING. Sono state generate reti di interazione visiva con arricchimenti funzionali in termini GO (processi biologici) e analisi STRING. Il diagramma di Venn proporzionale all'area della sovrapposizione dei geni differenzialmente espressi tra le sottoclassi LN è stato generato con BioVenn (www.biovenn.nl).23 I dati del software di risoluzione delle analisi avanzate sono stati letti nell'ambiente statistico R e la visualizzazione dei dati è stata eseguita utilizzando boxplot, analisi delle componenti principali, grafici dei vulcani e mappe di calore. Le mappe di calore sono state generate utilizzando i punteggi Z dei conteggi normalizzati e la mappa di calore in R. I cluster sono stati analizzati utilizzando il test esatto di Fisher. Per il confronto di più gruppi è stata utilizzata l'analisi della varianza con il test dei confronti multipli di Sidak. I dati sono stati analizzati utilizzando GraphPad Prism (V.8.0).
Dichiarazione sul coinvolgimento del paziente e del pubblico (PPI).
Questo studio faceva parte del consorzio MASTERPLANS e i pazienti collaboratori hanno partecipato a ogni filone di lavoro compreso questo studio. Il PPI ha prodotto un glossario di termini per consentire un ulteriore coinvolgimento con la più ampia comunità di pazienti e i risultati della ricerca sono stati inclusi nelle giornate di revisione laica. Le revisioni generali delle pubblicazioni sono condivise sul sito web MASTERPLANS (https://sites.manchester.ac.uk/masterplans).
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