Oltre all'attività di promozione della durata della vita di MET in vari organismi modello

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INTRODUZIONE

Le cellule epiteliali del cristallino (LEC) formano un monostrato di cellule che rivestono la capsula anteriore del cristallino e si estendono all'arco del cristallino equatoriale [1, 2]. La normale struttura e funzione dei LEC sono essenziali per il mantenimento della trasparenza e dell'omeostasi metabolica dell'intero cristallino[3]. Prove crescenti indicano che la senescenza delle LEC può causare modifica, denaturazione e aggregazione delle proteine ​​del cristallino, inclusi enzimi e cristalline, portando così in ultima analisi all'opacizzazione del cristallino o addirittura alla cataratta [3-5]. La cataratta legata all'età (ARC) rimane la principale causa di disabilità visiva e cecità, che influiscono gravemente sulla qualità della vita delle persone anziane [6]. Attualmente non esistono strategie efficaci per la prevenzione della progressione dell'ARC. Pertanto, è necessario sviluppare un intervento farmacologico che possa migliorare la trasparenza del cristallino e ritardare la progressione dell'ARC.

Negli ultimi decenni, gli scienziati hanno ottenuto notevoli progressi nel miglioramento della salute e nell'estensione della durata della vita utilizzando numerosi interventi genetici, dietetici e farmacologici [7]. La metformina (MET) è uno degli agenti antietà ampiamente studiati. Studi sostanziali suggeriscono che il MET può alleviare la senescenza e prolungare una vita sana in vari sistemi di modelli animali. MET non solo può prolungare la durata della vita di Caenorhabditis elegans, ma anche migliorarne la salute e la vitalità [8]. Il MET può ridurre l'accumulo di danni al DNA correlato all'età e allo stress ossidativo nelle cellule staminali dell'intestino medio della Drosophila per prolungarne la durata [9]. Studi precedenti indicano anche che la somministrazione cronica di MET a basse dosi migliora la salute e la durata della vita dei topi [10]. Inoltre, evidenze emergenti indicano che quando i pazienti con diabete vengono trattati con MET, manifestano benefici in termini di sopravvivenza, anche se confrontati con controlli che non hanno il diabete [11].

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Oltre all'attività di promozione della durata della vita di MET in vari organismi modello, MET mira a molteplici vie di segnalazione cellulare per migliorare le malattie legate all'età. È stato dimostrato che il MET modula l'autofagia principalmente tramite l'attivazione della protein chinasi (AMPK) attivata dall'adenosina monofosfato (AMP) e previene la neurodegenerazione e la neuroinfiammazione per svolgere un ruolo neuroprotettivo nel morbo di Parkinson [12]. Allo stesso modo, MET migliora i cambiamenti legati all'età nella cellula endoteliale sinusoidale del fegato attraverso le vie AMPK e dell'ossido nitrico endoteliale [13].cistance dosaggio redditInoltre, l'attivazione cronica di AMPK da parte di MET previene la cardiomiopatia sovraregolando l'autofagia nei topi OVE26 con diabete [14]. Inoltre, il MET allevia il deterioramento cardiovascolare associato all'età migliorando l'autofagia e la restrizione calorica [15]. Inoltre, il trattamento con MET può inibire l'aterosclerosi associata all'età nei topi e nei conigli ApoE-7- indotta da una dieta ricca di grassi, prevenendo significativamente la calcificazione della placca aterosclerotica, riducendo i livelli di proteina C-reattiva ad alta sensibilità e reprimendo l'attivazione del via del fattore nucleare kappa B(NF-kB) nei vasi sanguigni [16-18].

Sulla base di queste osservazioni, il presente studio ha tentato di esplorare se il MET può ritardare l'invecchiamento dell'ARC e il meccanismo molecolare sottostante. I nostri risultati sono i seguenti: (i) il trattamento MET cronico a basse dosi ha ritardato la senescenza delle LEC nei topi invecchiati naturalmente, inibendo così l'opacità del cristallino; (i) la via AMPK era inattivata e il flusso autofagico era alterato nei LEC senescenti; (i) ) il trattamento MET cronico a basse dosi ha ritardato la senescenza delle LEC nei topi invecchiati naturalmente attivando la via AMPK e migliorando l'autofagia. I nostri risultati confermano il presunto ruolo anti-invecchiamento del MET e forniscono prove sufficienti che il MET potrebbe rivelarsi una possibile opzione terapeutica per l'ARC.

RISULTATI

La senescenza delle LEC era associata all'ARC nei topi invecchiati naturalmente

Molteplici potenziali meccanismi di ARC, compreso l'effetto dell'invecchiamento, sono stati ampiamente studiati.benefici dell'estratto di cistanche,Tuttavia, l'associazione tra la senescenza di LEC e ARC in vivo rimane poco chiara. Abbiamo ipotizzato che la senescenza delle LEC possa provocare ARC in vivo. Pertanto, abbiamo costruito un modello murino di ARC. I nostri risultati hanno rivelato che la trasparenza della lente nei topi invecchiati naturalmente (topi più anziani) era significativamente ridotta rispetto a quella del gruppo di controllo (topi giovani) (Fig.1a). Come mostrato in Fig.1b, l'incidenza della cataratta nel gruppo di età naturale era del 95,23%. Il test di colorazione H&E ha indicato che le LEC nel gruppo di controllo erano di forma rotonda e disposte regolarmente e la densità delle LEC normali era relativamente alta, mentre le LEC dei topi invecchiati naturalmente erano di forma piatta e disposte in modo non uniforme e la densità di le LEC senescenti erano notevolmente diminuite (Fig.1c). Inoltre, la colorazione con SA- -Gal ha mostrato che il rapporto tra LEC senescenti era elevato nei topi invecchiati naturalmente (Fig. 1d). Inoltre, abbiamo analizzato l'espressione proteica dei marcatori associati alla senescenza tramite la colorazione IHC e l'analisi western blot. La colorazione IHC ha rivelato che l'espressione di p21 e p53 era aumentata nelle LEC di topi invecchiati naturalmente rispetto ai topi giovani (Fig. 1e, f). Allo stesso modo, abbiamo ulteriormente scoperto che l'espressione proteica di p21 e p53 era maggiore nelle capsule del cristallino di topi invecchiati naturalmente rispetto alle capsule del cristallino di topi giovani (Fig. 1g). Questi risultati hanno suggerito che la senescenza delle LEC fosse associata all'ARC nei topi invecchiati naturalmente.

Cistanche può antietà

La somministrazione cronica di MET a basse dosi ha migliorato la trasparenza del cristallino e alleviato la senescenza delle LEC Prima di testare l'effetto della metformina sull'ARC, abbiamo determinato se la somministrazione cronica di MET a basse dosi è sicura per i topi. Dopo il trattamento MET per 10 mesi, 28 topi (18 nel gruppo invecchiato naturalmente e 10 nel gruppo MET) sono morti per cause naturali. Abbiamo scoperto che i topi vivi in ​​entrambi i gruppi erano sani e non c'era alcuna differenza significativa nel peso corporeo e nel peso degli organi tra entrambi i gruppi (Tabella 1). Pertanto, questi risultati hanno indicato che il dosaggio di metformina utilizzato nello studio era sicuro per gli animali e poteva essere utilizzato per esperimenti successivi.

Successivamente, è stato somministrato MET cronico a basse dosi per valutare se il MET potesse inibire l'opacità del cristallino e alleviare la senescenza legata all'età delle LEC nei topi invecchiati naturalmente. Come previsto, la trasparenza della lente nel gruppo MET è stata notevolmente migliorata rispetto alla trasparenza della lente nel gruppo naturalmente invecchiato (Fig.2a). Inoltre, le osservazioni morfologiche hanno confermato che la lente del gruppo MET mostrava una riduzione dell'opacità. L'incidenza della cataratta nel gruppo invecchiato naturalmente era del 95,23 percento, mentre quella nel gruppo MET era del 19, 00 percento (Fig. 2b). Il test di colorazione H&E ha rivelato che la densità di LEC nel gruppo MET era notevolmente più alta rispetto a quello nei topi invecchiati naturalmente (Fig. 2c). Inoltre, le LEC del gruppo MET erano di forma relativamente rotonda rispetto a quelle del gruppo naturalmente invecchiato (Fig.2c). SA- -La colorazione Gal ha mostrato che il rapporto tra LEC senescenti era significativamente ridotto nel gruppo MET rispetto a quello del gruppo invecchiato naturalmente (Fig.2d). L'analisi IHC ha rivelato che l'espressione di p21 e p53 era diminuita maggiormente nei LEC del gruppo MET rispetto al gruppo invecchiato naturalmente (Fig.2e, f). Allo stesso modo, l'analisi western blot ha rivelato che l'espressione proteica di p21 e p53 era notevolmente ridotta nelle capsule del cristallino del gruppo MET rispetto a quelle del gruppo invecchiato naturalmente (Fig. 2g). Questi risultati hanno indicato che la somministrazione cronica di MET a basse dosi potrebbe migliorare la trasparenza del cristallino e alleviare la senescenza delle LEC.

La somministrazione cronica di MET a basse dosi ha attenuato la senescenza delle LEC nei topi invecchiati naturalmente tramite l'attivazione di AMPK Una quantità schiacciante di dati supporta la conclusione che l'attivazione di AMPK è sufficiente per prolungare la durata della vita negli organismi modello, aumentandone l'attrattiva come bersaglio della longevità [19,20] . Considerando questa teoria, abbiamo valutato l'espressione del percorso AMPK nei LEC dei topi. Il livello relativo di mRNA di FAS è stato ridotto nel gruppo invecchiato naturalmente e aumentato nel gruppo MET (Fig. 3a). Come mostrato in Fig.3b, c, l'espressione di AMPKa fosforilato (Thr172) e ACC fosforilato (Ser79) è stata ridotta nei LEC di topi invecchiati naturalmente rispetto a quelli di topi giovani. Tuttavia, l'espressione di AMPKa fosforilato (Thr172) e ACC fosforilato (Ser79) era elevata nelle LEC del gruppo MET rispetto a quelle del gruppo naturalmente invecchiato. Inoltre, l'analisi western blot ha rivelato che l'espressione proteica di AMPKa fosforilato (Thr172) e ACC fosforilato (Ser79) era significativamente sottoregolata nelle capsule del cristallino dell'invecchiamento naturale e i livelli di espressione proteica di AMPKa fosforilato (Thr172) e ACC fosforilato ( Ser79) sono stati aumentati nelle capsule del cristallino del gruppo MET (Fig.3d). Questi dati hanno rivelato che il percorso AMPK era inattivato nelle LEC di topi naturalmente invecchiati. Inoltre, la somministrazione cronica di MET a basse dosi ha attenuato la senescenza delle LEC nei topi invecchiati naturalmente tramite l'attivazione di AMPK.

La somministrazione cronica di MET a basse dosi ha ripristinato il flusso autofagico per alleviare la senescenza delle LEC nei topi invecchiati naturalmente Studi precedenti hanno indicato che l'autofagia può svolgere un ruolo importante nella lotta agli effetti avversi dell'invecchiamento [21,22]. Per analizzare ulteriormente i cambiamenti molecolari e cellulari nella lente dopo il trattamento con MET, abbiamo determinato l'espressione di LC3 e p62 perché sono ampiamente accettati come biomarcatori dei livelli di autofagia. Come dimostrato in Fig. 4a, il livello di espressione dell'mRNA di p62 relativo è aumentato significativamente nel gruppo invecchiato naturalmente rispetto a quello del gruppo di controllo; tuttavia, il livello di espressione relativa dell'mRNA di p62 era sostanzialmente sottoregolato nel gruppo MET rispetto a quello del gruppo invecchiato naturalmente.cistanche gengis khanInoltre, la colorazione IHC ha rivelato che i livelli di catena leggera 3(LC3-II/l) e p62 della proteina 1 associata ai microtubuli e p62 erano aumentati nelle LEC di topi invecchiati naturalmente. Inoltre, i nostri risultati hanno illustrato che i livelli di LC3-II/l e p62 erano notevolmente ridotti nei LEC del gruppo MET (Fig. 4b, c). I livelli proteici di LC3-ll e p62 erano notevolmente aumentati nelle capsule del cristallino del gruppo invecchiato naturalmente (Fig.4d). Complessivamente, abbiamo ipotizzato che il flusso autofagico fosse alterato nelle LEC dei topi invecchiati naturalmente e potesse essere ripristinato dalla somministrazione cronica di MET a basse dosi per alleviare la senescenza delle LEC nei topi invecchiati naturalmente.

DISCUSSIONE

La cataratta non trattata è una delle principali cause di cecità in tutto il mondo, caratterizzata da opacizzazione del cristallino [23]. Studi epidemiologici hanno dimostrato che l'età è il fattore di rischio dominante per la cataratta, noto come ARC, e l'unico trattamento è la rimozione chirurgica [24]. Precedenti studi hanno dimostrato che la senescenza dei LEC è la causa principale dell'ARC [25]. Ad oggi, non ci sono stati agenti terapeutici efficaci per inibire la torbidità del cristallino e attenuare la senescenza delle LEC senza effetti collaterali indesiderati. L'obiettivo del presente studio era valutare le basi biologiche molecolari per la senescenza delle LEC e il meccanismo di protezione delle LEC normali dalla senescenza. I nostri risultati hanno rivelato che l'inattivazione di AMPK e la compromissione dell'autofagia erano associati alla senescenza di LEC e ARC. Inoltre, abbiamo scoperto che MET potrebbe proteggere le LEC dalla senescenza e inibire la torbidità della lente attivando AMPK e migliorando l'autofagia.

La senescenza è un processo biologico fondamentale accompagnato da un generale declino della funzione tissutale. Con l'aumentare della durata della vita, le disfunzioni legate all'età come l'ARC diventano seri problemi di salute

problemi [26]. È stato segnalato che la senescenza delle LEC è coinvolta nella comparsa e nello sviluppo di ARC [5]. I nostri risultati hanno rivelato che le LEC dei topi invecchiati naturalmente erano di forma piatta e disposte in modo non uniforme e la densità delle LEC è diminuita notevolmente (Fig. 1c, d). Inoltre, l'espressione dei geni associati all'invecchiamento (p21 e p53) è stata sovraregolata nelle LEC dei topi invecchiati naturalmente (Fig. 1e, f, g). I nostri risultati implicavano che la senescenza delle LEC fosse associata alla presenza e allo sviluppo di ARC. Pertanto, potrebbe essere necessaria un'accurata comprensione dei meccanismi molecolari alla base della senescenza dei LEC per fornire una motivazione per nuove strategie di trattamento.

MET è il farmaco ipoglicemizzante orale più ampiamente prescritto per il diabete di tipo 2 in tutto il mondo. Prove emergenti indicano che il MET ha effetti benefici sulla salute oltre a quelli associati al miglioramento della glicemia [27]. È stato confermato che i meccanismi di MET sono importanti per prendere di mira i percorsi fondamentali nell'invecchiamento biologico, come l'attivazione dell'AMPK, l'aumento dell'autofagia, l'inibizione dell'infiammazione e l'esercizio di effetti antiossidanti [28]. Negli esseri umani, il MET è stato utilizzato nella pratica clinica per più di 60 anni; ha un alto profilo di sicurezza ed è posizionato in modo univoco per intervenire in diversi percorsi cruciali responsabili dell'invecchiamento e delle malattie legate all'età. Tuttavia, gli effetti del MET sull'ARC e il meccanismo di regolamentazione di tali effetti non sono mai stati riportati. Di conseguenza, nel nostro studio, la somministrazione cronica di MET a basse dosi in topi invecchiati naturalmente ha migliorato la trasparenza della lente (Fig. 2a) e attenua la senescenza delle LEC in vivo (Fig. 2).

È ampiamente riconosciuto che il MET attiva la via AMPK che è il potenziale meccanismo del MET per esercitare un effetto anti-invecchiamento [29]. AMPK, un sensore di energia cellulare, svolge un ruolo cruciale nella regolazione del bilancio energetico cellulare [30]. Diversi studi hanno illustrato che AMPK funge da integratore e mediatore di diversi percorsi e processi che associano l'energia alla longevità. Nel nostro studio, abbiamo scoperto che l'inattivazione di AMPK era una caratteristica delle LEC senescenti nei topi invecchiati naturalmente (Fig.3). Successivamente, è stato dimostrato che MET stimola il percorso AMPK per prevenire la senescenza dei LEC (Fig.3). In quanto attivatore consolidato di AMPK, il ruolo del MET nella prevenzione dell'invecchiamento è generalmente attribuito ai suoi effetti sulla modulazione delle vie di segnalazione a valle, come il ripristino dell'autofagia, l'attivazione di Sirt1 e Foxo1 e la soppressione di mTOR [31,32]. Il nostro studio ha fornito una nuova linea di prove sottolineando l'importanza della funzione AMPK attivata da MET nel prevenire il verificarsi di ARC.

Come accennato in precedenza, AMPK comunica con numerosi percorsi e proteine ​​​​per esercitare un effetto anti-senescenza, incluso l'aumento dell'autofagia. L'autofagia, emergendo come un processo fondamentale per la garanzia della longevità, ha suscitato un diffuso interesse come potenziale bersaglio terapeutico per le malattie legate all'età. L'autofagia è un processo biologico fluido e complesso in più fasi. Il processo completo dell'autofagia è chiamato flusso autofagico, che è ampiamente utilizzato per riflettere il livello di autofagia. Come indicatore dell'autofagia, LC3-Il è strettamente legato alla membrana autofagosomica che viene degradata dagli enzimi lisosomiali.prolungamento della vita delle cistanceAllo stesso modo, p62, un substrato specifico dell'autofagia, è solitamente degradato nell'autofagolisosoma e la sua espressione riflette indirettamente il livello di autofagia. Nel presente studio, i nostri risultati implicavano che il livello di autofagia fosse nettamente diminuito nei LEC senescenti (Fig. 4), mentre MET ha invertito la compromissione dell'autofagia legata all'età (Fig. 4). Il meccanismo molecolare anti-invecchiamento del MET è attribuito alla funzione primaria dell'AMPK nelle cellule perché generalmente migliora l'autofagia tramite l'attivazione dell'AMPK [33]. Inoltre, è stato dimostrato che il MET aumenta direttamente l'autofagia, contribuendo così alla prevenzione della senescenza [34]. Tuttavia, sono necessari studi più dettagliati per chiarire i meccanismi sottostanti, dimostrando che MET aumenta l'autofagia tramite un percorso AMPK indipendente o dipendente.

È stato dimostrato che la prevalenza di ARC non è stata associata al sesso nelle popolazioni di origine asiatica [35, 36]. Pertanto, non abbiamo considerato il sesso come un fattore che potrebbe influenzare l'ARC. Il nostro studio dovrebbe essere interpretato tenendo conto dei limiti sopra menzionati.

CONCLUSIONE

In sintesi, abbiamo dimostrato che l'inattivazione del percorso AMPK e la compromissione dell'autofagia legata all'età potrebbero contribuire alla senescenza delle LEC e al verificarsi di ARC. Inoltre, i dati dei nostri esperimenti hanno rivelato che il MET ha effettivamente ritardato la senescenza dei LEC e la formazione di ARC tramite l'attivazione del percorso AMPK e l'aumento dell'autofagia. I nostri risultati sono una linea di base per ulteriori indagini sui meccanismi molecolari che sono utili nel ruolo del MET durante il processo di invecchiamento dell'ARC e saranno informativi per studi più intensivi sullo sviluppo di nuove strategie contro l'occorrenza e lo sviluppo dell'ARC.

MATERIALI E METODI Reagenti

MET è stato acquistato da Bristol-Myers Squibb Company (Cina). Anticorpi contro p21 (ab188224), p53 (ab131442), AMPKa fosforilato(p-AMPK)(Thr172)(ab133448), AMPKa1(ab32047), -actina (ab8226) e SQSTM1/p62 (3340-1) sono stati ottenuti da Abcam(MA, USA). Anticorpi contro LC3 (12741) e fosfo-acetil CoA carbossilasi (p-ACC)(Ser79)(3661) sono stati acquistati da Cell Signaling Technology ( MA, USA).

Animali e cure

I topi maschi C57BL6J di 3 e 8 mesi sono stati acquistati da Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. Ltd. (Pechino, Cina). I topi sono stati alloggiati in condizioni a temperatura controllata (temperatura, 20-25 gradi e umidità relativa, 55±15 percento) con un ciclo luce/buio di 12 ore, con libero accesso a cibo e acqua. Tutte le procedure e i protocolli condotti sugli animali sono stati approvati dal comitato etico dell'Università di medicina di Harbin.

I topi sono stati divisi nei seguenti tre gruppi: (i) gruppo di controllo con topi giovani (3 mesi di età, peso corporeo=29.72± 1,66 g, n {5}}) hanno ricevuto una dieta standard per topi purificati e acqua ad libitum; Quando i topi avevano 10 mese, 120 topi sono stati divisi casualmente in due gruppi: gruppo di età naturale e gruppo MET. (i) gruppo di età naturale (topi più anziani, 20 mesi di età, peso corporeo=32.98±1,93 g, n=60) ha ricevuto una dieta standard per topi purificata e acqua ad libitum; (ii) gruppo MET ( 20 mesi di età, peso corporeo=31.21±2,81 g,n=60) è stato mantenuto con una dieta purificata standard per topi e acqua fino a quando i topi non hanno raggiunto i 10 mesi di età; dopodiché sono stati avviati i trattamenti. I topi del gruppo MET sono stati alimentati con una dieta integrata con lo 0,1% di MET (Bristol Myers Squibb, Cina) e acqua liberamente per 10 mesi.

isolamento di lenti e capsule per lenti

I topi sono stati sottoposti a eutanasia tramite dislocazione cervicale. L'intero occhio è stato immediatamente asportato da tutti gli animali da esperimento e posto in soluzione fisiologica sterile. Il nervo ottico è stato posizionato verso l'alto e fissato con una pinzetta. È stata quindi praticata un'incisione sul nervo ottico che entra nell'occhio e la sclera è stata tirata indietro per esporre la lente.cistanche nzSuccessivamente, abbiamo utilizzato delle pinzette per rimuovere delicatamente i frammenti del corpo ciliare attaccati al piano equatoriale della lente. Sono state immediatamente scattate foto della lente fresca e la lente è stata rapidamente fissata con paraformaldeide al 4% a temperatura ambiente. Le intere capsule della lente sono state rapidamente staccate dalla lente rimanente, congelate a scatto in azoto liquido e conservate a 80 gradi C per esperimenti successivi.

Ematossilina ed eosina (H&E)

La lente fresca è stata immediatamente fissata con paraformaldeide al 4% a temperatura ambiente e incorporata in paraffina. Per l'esame istologico, i tessuti sono stati tagliati in fette di 4-μm. Dopo la deparaffinazione e la reidratazione, le sezioni di paraffina preparate sono state colorate con una soluzione di ematossilina (H) per 8 minuti, seguite da 5 immersioni in etanolo acido all'1% (HCI all'1% in etanolo al 70%)

e risciacquare con acqua distillata. Successivamente, le sezioni sono state colorate con una soluzione di eosina (E) per 3 minuti, seguite da disidratazione con alcol graduato e schiarimento con xilene. I cambiamenti morfologici sono stati osservati al microscopio (Nikon, Eclipse, Giappone).

Saggio della galattosidasi (SA- -Gal) associata alla senescenza L'attività della galattosidasi (SA- -Gal) associata alla senescenza è stata misurata utilizzando un kit di colorazione SA- -Gal (Sigma, CS{ {12}}030). Secondo le istruzioni del produttore, le sezioni di tessuto, dopo una serie di trattamenti, sono state lavate con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per 5 minuti (tre volte) e quindi incubate in una soluzione colorante SA- -gal (pH 6,0) a 37 gradi senza CO2 per 24 h. Le immagini sono state catturate al microscopio ottico (Nikon, Eclipse, Giappone). La percentuale di cellule SA- -gal-positive è stata stimata come numero medio di cellule positive/numero medio di cellule totali.

Reazione quantitativa a catena della polimerasi in tempo reale (gRT-PCR) L'RNA totale dalle capsule delle lenti dei topi è stato estratto utilizzando il reagente TRlzol. La trascrizione inversa è stata eseguita con il kit di reagenti ExScript RT (Invitrogen). L'analisi quantitativa della reazione a catena della trascrizione inversa-polimerasi (qRT-PCR) è stata eseguita utilizzando un SYBR Green Supermix

kit (Takara, Tokyo, Giappone), con -actina come controllo endogeno. Le trascrizioni sono state studiate per diversi geni bersaglio, tra cui FAS (avanti, 5'-TTGCTGGCACTACAGAATGC-3'e inverso,5'-AACAGCC TCAGAGCGACAAT-3'), p62 (avanti,5'-GGCGCACTACCGCGATGAGGA{{ 10}} e rovescio,5'-TGTTCCCGCCGGCACTCCTT-3') e -actin (avanti, 5 '-TCGTGGGCCGCCCTAGGCAC-3'e rovescio,5'-TGGCCTTAGGGTTC AGGGGGG-3'. Il relativo i livelli di ciascuna espressione genica erano

metodo. normalizzato in -actina e calcolato utilizzando la colorazione 2-△△ct r Immunohistochemical (IHC) Per l'analisi immunoistochimica (IHC) sono state utilizzate in totale 5 sezioni rappresentative di ciascuna delle 10 lenti selezionate per gruppo per valutare l'espressione di p21, p53, p-AMPK, p-ACC, LC3 e p62. Dopo che i campioni preparati sono stati incubati a 60 gradi per 2 ore, sono stati passati attraverso serie di xilene e alcol graduato per la deparaffinazione. Successivamente, i campioni sono stati bolliti in 0,1 M di acido citrico (pH 6,1) per 30 minuti e raffreddati a temperatura ambiente. Dopo aver lavato tre volte con PBS, i campioni sono stati immersi con lo 0,3% di H O, per inibire l'attività della perossidasi endogena. Successivamente, gli anticorpi primari sono stati aggiunti e raffreddati a 4 gradi C, durante la notte. I corrispondenti anticorpi secondari sono stati incubati per 1 ora a 37 gradi C. Dopo il lavaggio con PBS, i campioni sono stati incubati in diaminobenzidina (DAB) fino allo sviluppo dell'intensità della colorazione desiderata. Le immagini delle cellule immunocolorate sono state acquisite utilizzando il microscopio Nikon Eclipse (Nikon, Eclipse, Giappone).

Analisi Western blot

La proteina totale dalle capsule del cristallino dei topi è stata estratta utilizzando un tampone del test di radioimmunoprecipitazione (RIPA) con cocktail di inibitori della proteasi (Pierce, USA) ed è stato utilizzato un kit di acido bicinconinico (BCA) (Thermo Fisher Scientific, USA) per quantificare la concentrazione proteica . La proteina totale (40 ug) è stata analizzata mediante elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) e trasferita elettroforeticamente su membrane con filtro di polivinilidene difluoruro (PVDF) (Millipore, Germania). Le membrane sono state incubate per una notte con un anticorpo primario a 4 gradi C. Il giorno seguente, le membrane sono state incubate con corrispondenti anticorpi secondari per 1 ora a 37 gradi C. Le bande immunoreattive sono state visualizzate utilizzando il metodo del substrato chemiluminescente con un Super Signal West Pico kit (Pierce Biotechnology, USA). Sono stati eseguiti tre esperimenti indipendenti.

analisi statistica

I dati sono stati espressi come media ± deviazione standard (DS). Le analisi statistiche sono state condotte utilizzando il software GraphPad Prism 7.0 e Microsoft Excel. La proteina è stata quantificata utilizzando il software Image J. Il test t di Student e l'analisi della varianza (ANOVA) sono stati utilizzati per calcolare la significatività statistica dei dati sperimentali. Differenze con un valore P<0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" all="" experiments="" were="" repeated="" independently="" at="" least="" three="">

DISPONIBILITA' DEI DATI

I set di dati utilizzati e analizzati durante il presente studio sono inclusi in questo articolo pubblicato.

Questo articolo è estratto da www.nature.com/cddiscovery