Combinazioni di farmaci sinergici con schermo a base di silico da medicinali a base di erbe: un caso che utilizza Cistanche Tubulosa

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Neuroinfiammazioneè caratterizzato dall'elaborato repertorio di risposta infiammatoria del tessuto del sistema nervoso centrale. I limiti degli attuali trattamenti per la neuroinfiammazione sono noti effetti collaterali negli studi clinici di monoterapia. Le terapie di combinazione di farmaci sono strategie promettenti per superare i meccanismi compensatori e gli effetti dell'obiettivo. Tuttavia, la scoperta di combinazioni sinergiche di farmaci da medicinali a base di erbe è rara. Incoraggiati dai casi applicati con successo, passiamo allo studio delle efficaci combinazioni di farmaci basate sulla farmacologia di sistema tra i composti di Cistanche tubulosa (SCHENK) R. WIGHT. In primo luogo, 63 potenziali composti bioattivi, i relativi 133 bersagli diretti e indiretti, vengono esclusi dalla valutazione della somiglianza con il farmaco combinato con il processo di targeting del farmaco. In secondo luogo, la rete Compound-Target è costruita per acquisire il set di dati per la previsione delle combinazioni di farmaci. Elenchiamo le prime 10 combinazioni di farmaci che vengono utilizzate dall'algoritmo Probability Ensemble Approach (PEA) e la rete Compound-Target-Pathway viene quindi costruita dai 12 composti delle combinazioni, dei target e dei percorsi per portare alla luce le corrispondenti azioni farmacologiche. Infine, viene sviluppato un approccio di percorso integrativo per chiarire gli effetti terapeutici dell'erba in diversi processi biologici rilevanti per caratteristiche patologiche. Nel complesso, il metodo può fornire una strada produttiva per lo sviluppo di terapie combinate di farmaci.

Neurogeniconeuroinfiammazioneè definito come azioni orchestrate di cellule immunitarie innate e adattative, cellule vascolari e neuroni innescate da stati patologici e una maggiore attività neuronale nel sistema nervoso centrale (SNC). È probabile che svolga un ruolo nell'adescamento del SNCinfiammatorioreazioni dovute a condizioni come dolore, stress psicologico ed epilessia o diventano un fattore patogeno nelle malattie neurodegenerative. L'attuale agente per il trattamento della neuroinfiammazione appartiene principalmente alla monoterapia, inclusa la dopamina, la somatostatina, il neuropeptide, l'adenosina e così via. Tuttavia, ad esempio, l'uso a lungo termine dei comuni ma vecchi farmaci inibitori della COX, i farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS), potrebbe causare effetti collaterali avversi, lesioni gastrointestinali o rischi cardiovascolari1,2 e i risultati degli studi clinici rimangono particolarmente insoddisfacenti3, 4, quindi c'è un bisogno insoddisfatto di nuovi trattamenti della neuroinfiammazione.

La nuova terapia farmacologica combinatoria può essere una strategia in aumento per soddisfare le esigenze dello sviluppo di nuovi farmaci e superare gli ostacoli nel trattamento di malattie complesse. Una combinazione di terapia multicomponente potrebbe soddisfare i requisiti di cui sopra, in cui due o più farmaci vengono utilizzati insieme5, con i vantaggi elencati: maggiore efficacia, minima resistenza crociata, basse dosi mentre minori effetti collaterali e minore tossicità rispetto al farmaco singolo agente6. È stato utilizzato nel trattamento di malattie complesse7,8 per quasi 30 anni. Intrigante, la terapia di combinazione di farmaci viene applicata anche nella ricerca sulle malattie neurologiche, ad esempio, la combinazione di glimepiride e ibuprofene potrebbe ridurre efficacemente l'infiammazione nel morbo di Alzheimer (AD)9 o la ketamina/atropina potrebbe ridurre l'espressione di proteine ​​pro-infiammatorie nei topi epilettici10. Le combinazioni sinergiche di farmaci possono quindi portare nuova ispirazione per tracciare trattamenti efficaci perneuroinfiammazione. Quindi, come possiamo rompere il dado duro per ottenere i farmaci combinatori ottimali?

1Laboratorio chiave di biologia delle risorse e biotecnologie nella Cina occidentale, Ministero dell'Istruzione, Scuola di scienze della vita, Northwest University, Xi'an, Cina. 2Lab of Systems Pharmacology, Center of Bioinformatics, College of Life Science, Northwest A&F University, Yangling, Cina. 3State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process, Jiangsu Kanion Parmaceutical Co. Ltd, Lianyungang, Cina. Jianling Liu e Jinglin Zhu hanno contribuito in egual modo a questo lavoro. La corrispondenza e le richieste di materiale devono essere indirizzate a CZ

Jianling Liu1, Jinglin Zhu1, Jun Xue1, Zonghui Qin1, Fengxia Shen1, Jingjing Liu1, Xuetong Chen2, Xiaogang Li1, Ziyin Wu2, Wei Xiao3, Chunli Zheng1 e Yonghua Wang1

Al giorno d'oggi, gli approcci esistenti per escludere le combinazioni di farmaci sono i seguenti, indagini sistematiche di coppie di farmaci in vitro come il metodo di screening ad alto rendimento11 e il "Multiplex Screening for Interacting Compounds" (MuSIC)12 o valutazioni delle combinazioni di farmaci a coppie con ampie -esperimenti su scala13,14. Tuttavia, il consumo eccessivo di manodopera, risorse naturali e il tempo di ardui test empirici possono essere un problema inevitabile nella valutazione di efficaci combinazioni di farmaci. In risposta al superamento delle carenze, sono emersi anche approcci basati sull'analisi di rete, in particolare le reti di interazione genetica15, i dati di biologia dei sistemi chimici16 e i dati molecolari e farmacologici17 per la scoperta combinatoria di farmaci. Inoltre, un numero crescente di ricercatori18,19 ha proposto nuovi approcci di rete per prevedere le combinazioni ottimali e ha offerto nel frattempo la corrispondente convalida sperimentale, quindi l'integrazione della previsione della rete con la convalida sperimentale potrebbe essere una nuova tendenza nel campo della previsione combinatoria.

I medicinali a base di erbe coinvolgono un numero considerevole di formule (Fang-Ji in mandarino) e ingredienti chimici, che formano un database di prodotti naturali, in modo da poter offrire indizi innovativi, dati biologici fondamentali per lo sviluppo di combinazioni di farmaci, come il professor Li20,21 e il professor Liu22 ha introdotto metodi di analisi olistica basati sulla biologia integrata per decifrare i meccanismi molecolari delle medicine a base di erbe: pillola Liu-Wei-Di-Huang o Iniezione Riduttiva. Nel nostro lavoro precedente, abbiamo scoperto che non solo due erbe rappresentative Lonicera japonica e Fructus Forsythia mostrano effetti sinergici sull'influenza o sull'infammazione23, ma anche i composti rutina e amentoflavone presentano effetti sinergici nella prevenzione della depressione24.

Nel nostro attuale lavoro, sviluppiamo un approccio di farmacologia di sistema per scoprire le combinazioni sinergiche di farmaci tra i composti dell'erbaCistanche tubulose(SCHENK) R. WIGHT, vengono proposti i seguenti passaggi: in primo luogo, selezioniamo i composti bioattivi attraverso la previsione della somiglianza dei farmaci, che vengono utilizzati come esche per pescare i relativi bersagli. E poi, ispirati dal paradigma basato sull'"obiettivo di rete" per dare la priorità alle combinazioni di agenti sinergici in un modo ad alto rendimento25, acquisiamo efficaci combinazioni di farmaci tra i potenziali composti sulla base di un algoritmo interno chiamato Probability Ensemble Approach (PEA)26 con alta efficienza di formazione, ampia applicabilità e due indici quantitativi per descrivere le proprietà di una combinazione di farmaci. Infine, utilizziamo i target ottenuti e i composti delle coppie candidate per costruire una rete/percorso e quindi fornire analisi per codificare il meccanismo diCistanche tubuloseSuneuroinfiammazioneolistico. Ad esempio, è la prima volta che si escludono efficaci combinazioni di farmaci da prodotti naturali basati sulla farmacologia di sistema attraverso l'integrazione di metodi computazionali e la convalida sperimentale per approvare l'affidabilità della previsione. Crediamo che questo possa aiutare a personalizzaretrattamento della neuroinfiammazione, migliorerà la nostra comprensione di un efficace sviluppo neuroprotettivo e aiuterà la futura ricerca preclinica.

Risultati

Bersagli di Cistanche tubulosa.

Per ottenere gli obiettivi relativi aneuroinfiammazioneper prima cosa otteniamo gli ingredienti inCistanche tubulose(SCHENK)R. WIGHT cercando nel database TCMSP (http://lsp.nwu.edu. cn/), che risulta in 1{5}}3 composti (Tabella Supplementare S1, Vedi Materiali e Metodi). Quindi, analizziamo la loro somiglianza con i farmaci applicando il modello di previsione DL costruito nel nostro lavoro precedente (vedi Materiali e metodi). In questo modo, otteniamo 63 potenziali composti bioattivi (Tabella Supplementare S2) con un indice DL maggiore o uguale a 0.18. Successivamente, per mezzo degli algoritmi Sys DT e WES, identifichiamo 117 target di questi potenziali composti bioattivi. Infine, 43 potenziali bersagli (Tabella Supplementare S3) strettamente correlati alla neuroinfiammazione vengono recuperati dopo aver eliminato rumore ed errori, mappando i 117 bersagli dei composti nel database CTD.

Analisi di arricchimento GOBP per target.

Per verificare se le proteine ​​bersaglio dei potenziali composti bioattivi sono strettamente correlateneuroinfiammazione, eseguiamo l'analisi dell'arricchimento GOBP attraverso la mappatura degli obiettivi su DAVID. La Fig. 1 mostra un albero GO che rappresenta i risultati di termini GOBP significativamente arricchiti (valore P minore o uguale a 0.05), in cui i target sono classificati in 20 gruppi diversi, come la regolazione positiva della muscolatura liscia vascolare proliferazione cellulare e regolazione positiva della migrazione dei leucociti. Tra questi gruppi, la trasmissione sinaptica chimica,infiammatoriorisposta, segnalazione cellula-cellula e così via sono tutti strettamente associatineuroinfiammazione. Ad esempio, le alterazioni sinaptiche che si verificano durante le malattie neuroinfiammatorie sono in gran parte mediate dainfiammatoriocitochine rilasciate dai linfociti T infiltranti e dalla microglia attivata e sono responsabili, almeno in parte, di patologie dendritiche irreversibili (collettivamente, queste osservazioni suggeriscono che i bersagli previsti possono probabilmente contribuire al trattamento dineuroinfiammazione.

Costruzione e analisi della rete Compound-Target.

In generale, le terapie combinate fattibili ed efficaci sono combinazioni di composti bioattivi con proprietà farmacocinetiche ideali, che possono bilanciare la rete della malattia regolando bersagli specifici. Pertanto, costruiamo ulteriormente una rete statica di destinazione composta per verificare le loro relazioni topologiche. Come mostrato in Fig. 2, la rete bipartita composto-bersaglio (CT) mostra 482 interazioni tra 63 composti e 43 bersagli in modo visivamente accattivante. Analizziamo il grado dei nodi nella rete di destinazione composta che si traduce in un grado medio per composto di 11,209 e 7,651 per bersaglio, rispettivamente. Osserviamo che tra i 63 composti,38 di essi regolano più di 7 target (maggiore del grado medio), manifestando i potenziali effetti sinergici tra di loro.

Ad esempio, la siringa (mol30) interagisce con il maggior numero di bersagli, che possono svolgere un ruolo di hub nella rete. È interessante notare che uno studio dimostra che il costituente fenolico siringina isolata da Euonymus alatus (Thunb.) Sieb. (Celastraceae) ha un effetto anti-neuroinfiammatorio inibendo la produzione di NO2.2'-acetilacteoside (mol42) controlla 10 diversi bersagli (grado=10). Tra questi bersagli, HSPB1 (noto anche come HSP27), come un esempio, è un accompagnatore molecolare che mostra proprietà neuroprotettive in molte malattie e modelli di lesioni. Per il verbascoside (mol33), le proprietà neuroprotettive di questo composto bioattivo coinvolgono la modulazione dei fattori di trascrizione e di conseguenza l'espressione genica alterata, con conseguente downregulation dell'infammazione30. Vale la pena notare che, sebbene la proprietà topologica della rete non pregiudichi l'echinacoside (mol41, grado=7), è un potenziale nuovo composto attivo per via orale per la regolazione della neuroinfiammazione e dei segnali correlati nel morbo di Parkinson e può fornire un nuovo prospettiva per il trattamento clinico. Presi insieme, questi risultati indicano che i potenziali composti attivi esaminati sono tutti correlati alla neuroinfiammazione e possono essere considerati il ​​set di dati per la previsione delle combinazioni di farmaci.

Costruzione e analisi della rete Compound-Target-Pathway.

Utilizzando l'algoritmo PEA, otteniamo 10 diverse combinazioni di farmaci (Tabella 1.), che coinvolgono 12 composti. Queste combinazioni di farmaci sono tutte ad alta probabilità di sinergia, che rappresenta la possibilità di indurre sinergia tra due composti. Pertanto, fino a un certo punto, questi composti sono considerati le sostanze farmacologiche fondamentali della Cistanche tubulosa. Sulla base delle informazioni di destinazione di questi composti e dei percorsi derivati ​​da DAVID, costruiamo la rete del percorso composto-bersaglio (CTP) per fare luce preliminarmente sui meccanismi molecolari di questi composti. La rete di percorsi composti di destinazione risultante è composta da 47 nodi e 99 bordi. Come illustrato in Fig. 3, questi composti possono agire non solo sulle proteine ​​a monte ma anche a valle delle vie associate alla neuroinfiammazione, in particolare gli indicatori diretti dei marker di infiammazione.

In particolare, la stragrande maggioranza dei composti prende di mira le proteine ​​a monte come HSPB1, HTR2A, NTSRl e altre, indicando la macroregolazione di questi composti per il trattamento della neuroinfiammazione. Ad esempio, l'echinacoside composto (mol41) prende di mira il percorso del VEGF attraverso la proteina HSPB1 (Figura 1 supplementare). Fortunatamente, gli studi dimostrano che HSPB1 ha proprietà citoprotettive significative in diversi modelli di malattie neurologiche in vivo o in vitro e può svolgere un ruolo nell'effetto antinfiammatorio regolando la via di segnalazione del fattore nucleare-KB(NF-KB)435. Inoltre, uno studio dimostra anche che R-Ras potrebbe regolare le attività angiogeniche delle cellule endoteliali in parte tramite l'inibizione dell'asse p38 della proteina chinasi attivata dal mitogeno (p38 MAPK)-HSPB1 della via di segnalazione del VEGF*.

Possiamo ottenere che il composto tubuloside A (mol56) prende di mira la via di segnalazione del calcio attraverso la proteina NTSRl nella rete. È noto che gli ioni calcio (Ca² plus) sono un secondo messaggero universale nelle cellule del sistema immunitario. La riduzione dell'attività sinaptica o l'aumento della segnalazione del recettore extrasinaptico dell'acido N-metil-D-aspartico (NMDA) può portare a disomeostasi nucleare del calcio37,38, aumentando così l'insorgenza di neurodegenerazione e disfunzione cognitiva. Inoltre, la proteina bersaglio NTSRl è un membro della grande superfamiglia dei recettori accoppiati a proteine ​​G e la segnalazione è generata attraverso il legame di proteine ​​G che possono attivare un secondo sistema messaggero fosfatidilinositolo-calcio e MAP chinasi a valle9.

Un altro esempio è che il composto 2'-acetylacteoside (mol42) prende di mira la via di segnalazione del GnRH attraverso la proteina PRKCD. PRKCD, una delle isoforme PKC, è un importante mediatore dell'attivazione delle protein chinasi extracellulari regolate 1/2 MAPK (ERK1/2 MAPK), delle protein chinasi N-terminali c-Jun MAPK (JNK MAPK) e p38 MAPK da parte della gonadotropina- ormone di rilascio (GnRH)0. E, poiché i processi chiave nella rete di segnalazione stimolata dal GnRH, le cascate MAPK a valle e i metaboliti dell'acido arachidonico (AA) potrebbero produrreinfiammatorioproteine, COX-2. Per quanto riguarda il kankanoside O (mol18) e la siringina (mol30), interagiscono direttamente con le proteine ​​a valle PTGS2, NOS2 e altreinfiammatorioindicatori, che è un riflesso intuitivo dell'efficacia dei composti. Uno studio mostra che la siringina potrebbe sopprimere la produzione del fattore di necrosi tumorale-c (TNF-c) nelle cellule RAW264.7 stimolate dai lipopolisaccaridi (LPS)42. E gli altri studi dimostrano che la svringina potrebbe anche abbassare la concentrazione di NO e l'attività di NOS o la produzione di prostaglandina E2. MMP9 mirato all'isoacteoside (mol43), è un attore importante nel sistema nervoso centrale e sarebbe un presunto enzima mediatore per disturbi neuropsichiatrici come schizofrenia e malattie bipolari5, La degradazione di NF-KB e fosforilazione di p38, ERK1/2, JNK MAPK o Akt (Protein Kinase B) delle vie di segnalazione a monte potrebbe modulare l'espressione del gene MMP9 e l'inibizione di MMP9 che può ridurre l'espressione delle cellule inattivate dell'ossido nitrico sintasi (iNOS)46-48

Analisi del percorso.

Un "percorso neuroinfiammatorio" incorporato è costruito integrando i percorsi chiave ottenuti attraverso l'analisi della rete del percorso composto-bersaglio, tra cui il percorso del morbo di Alzheimer, il percorso di segnalazione del calcio, la via di segnalazione del GnRH, la via di segnalazione del VEGF e la sinapsi serotoninergica. Dei 43 bersagli, 19 possono essere mappati sul "percorso neuroinfiammatorio". Come mostrato in Fig. 4, la Cistanche tubulosa rappresenta i bersagli dei composti attivi che si distribuiscono nella "Via della neuroinfiammazione. La "via della neuroinfiammazione" è classificata in 13 diversi moduli terapeutici, come morte cellulare, apoptosi, infiammazione e neuroprotezione. In questo studio, prendiamo come esempi i moduli di morte cellulare, infiammazione e neuroprotezione per chiarire il meccanismo della Cistanche tubulosa per la neuroinfiammazione.

Modulo di morte cellulare. I bersagli situati nella via del morbo di Alzheimer sono principalmente coinvolti nel processo di morte cellulare, suggerendo che la morte cellulare è strettamente correlata alla neuroinfiammazione. Gli studi dimostrano che la neuroinfiammazione mediata dalla microglia contribuisce alla morte delle cellule neuronali, che non è limitata a una malattia specifica ma implicata in varie malattie come l'ischemia4, il morbo di Parkinson e il morbo di Alzheimer5l. Come mostrato in Fig.4,

bersagli APP, GRIN2B e MAPT è regolato dai composti attivi di Cistanche tubulosa indicando che possono inibire la morte cellulare e quindi offrire un trattamento per la neuroinfiammazione. È interessante notare che il dominio intracellulare dell'APP altera la neurogenesi degli adulti nei topi transgenici inducendo neuroinfammazione52. L'incapacità di MAPT regola correttamente la dinamica dei microtubuli neuronali e quindi media la morte delle cellule neuronali53. Tutti questi indicano che Cistanche tubulosa può trattare la neuroinfiammazione inibendo la morte cellulare.

Modulo infiammatorio.

Il termine neuroinfiammazione indica le reazioni infiammatorie nel SNC in risposta all'attività neuronale1. In questo studio, rileviamo la via di segnalazione del GnRH e il coinvolgimento della via di segnalazione del VEGF nel modulo infiammatorio (Fig. 4). Ad esempio, MMP2 nella via di segnalazione del GnRH appartiene alla famiglia delle MMP, che sono espresse in situazioni fisiologiche e condizioni patologiche che coinvolgono l'infiammazione. E le MMP regolano diverse funzioni legate all'infiammazione, inclusa la biodisponibilità e l'attività delle citochine e chemochine infiammatorie54. Inoltre, la via di segnalazione del VEGF può portare alla generazione di NOS2, inoltre, partecipa alla risposta infiammatoria acuta all'LPS attraverso molteplici meccanismi: coinvolgimento nella segnalazione delle citochine proinfiammatorie e alterazione dell'espressione di vari geni che influenzano le risposte infiammatorie-immunitarie a LPS55. Collettivamente, tutti questi indicano che Cistanche tubulosa può curare la neuroinfiammazione regolando il sistema infiammatorio.

Modulo di neuroprotezione.

La neuroprotezione è il meccanismo e le strategie utilizzate per proteggere dal danno neuronale o dalla degenerazione del SNC a seguito di disturbi acuti (es. ictus o danno/trauma del sistema nervoso) oa seguito di malattie neurodegenerative croniche (es. Parkinson, Alzheimer, Sclerosi Multipla). L'obiettivo della neuroprotezione è limitare la disfunzione/morte neuronale dopo una lesione del SNC e tentare di mantenere la massima integrità possibile delle interazioni cellulari nel cervello risultando in una funzione neurale indisturbata. Come si può vedere dalla Fig. 4, alcuni bersagli sulla via della sinapsi serotoninergica sono coinvolti nella funzione di neuroprotezione. Ad esempio, la produzione di prostaglandine attraverso PTGS1 e PTGS2 (noto anche come COX-1 e COX-2) è un mediatore essenziale nell'evocare meccanismi antinfiammatori e nuovi meccanismi risolutivi56. Uno studio recente ha dimostrato che l'espressione genica di ADCY5, un enzima che catalizza la generazione di cAMP57, è ridotta dalla metilazione del promotore nelle linee cellulari di HCC umane indotte da COX-2-58. Sulla base dell'analisi di cui sopra, ipotizziamo che l'accumulo di COX-2 possa influenzare la secrezione di sAPP , la scissione dell'APP scissa dalla -secretasi che è modulata da cAMP ed esercitare ulteriormente l'effetto neuroprotettivo59,60. I nostri risultati mostrano che la neuroprotezione svolge un ruolo importante nel trattamento della neuroinfiammazione.

Convalida sperimentale

La vitalità delle cellule microgliali BV2 trattate dai composti.

Le cellule microgliali BV2 (8×104 cellule/ml) vengono alimentate con concentrazioni comprese tra 37,5 e 300 uM per millilitro di terreno di coltura senza siero dei quattro composti per 24 ore. Consideriamo la vitalità cellulare del gruppo di controllo coltivato in assenza di siero con meno dello 0,1% di DMSO come 100% (Fig.5 (ad)). Apparentemente, non si osserva alcuna citotossicità cellulare significativa ai dosaggi prescritti dei gruppi.

Convalida della sinergia farmacologica e del potenziale effetto antinfiammatorio in vitro.

Per valutare ulteriormente i risultati ottenuti in silico, vengono selezionati quattro composti che coprono tre coppie sinergiche, vale a dire isoacteoside, 2'-acetylacteoside, echinacoside e verbascoside, per esaminare i loro effetti sinergici del farmaco e il potenziale effetto antinfiammatorio utilizzando cellule BV2 trattate con LPS. In particolare, conduciamo analisi western blot per l'espressione proteica iNOS e COX-2 per conformarsi alla sinergia e agli effetti antinfiammatori delle combinazioni di farmaci previste.

Come mostrato in Fig.5 (eg), vengono riportati i livelli di proteine ​​iNOS e COX-2 nel pannello di linee cellulari BV2 testate. Osserviamo che il trattamento con isoacteoside o 2'-acetylacteoside, le espressioni proteiche di iNOS e COX-2 nelle cellule BV2 sono entrambe diminuite in modo significativo a diversi livelli di dose. Tuttavia, il trattamento con la combinazione di isoacteoside e 2'-acetilacteoside induce un aumento significativo dei fattori infiammatori iNOS e COX-2(Fig.5(e)). La Figura 5(1) illustra che il trattamento con echinacoside o verbascoside, come agente singolo, provoca una diminuzione dell'espressione di iNOS e COX-2. Inoltre, come previsto, il trattamento con echinacoside in combinazione con verbascoside alla concentrazione di 150 μM ha comportato una diminuzione più pronunciata dei livelli di espressione proteica (iNOS e COX-2), indicando gli effetti antinfiammatori sinergici di questo combinazione di farmaci. Allo stesso modo, come indicato in Fig. 5 (g), la combinazione di echinacoside e 2'-acetilacteoside mostra un significativo effetto sinergico sull'inibizione della COX-2 alla concentrazione di 75 μM o 300 μM. Tuttavia, per iNOS, al dosaggio di 300 μM, la combinazione rappresenta una marcata soppressione della proteina. Al contrario, troviamo che non ci sono effetti di inibizione evidenti sia su iNOS che su COX-2 sulla combinazione di isoacteoside e 2'-acetilacteoside o echinacoside e verbascoside alla concentrazione di 75μM (Figura 2 supplementare), inoltre, il trattamento con altre coppie mostra un effetto molto più debole rispetto ai singoli agenti al dosaggio di 150 o 300μuM che può essere visto in Fig. 5（eg）.

Per riassumere, lo studio in vitro fornisce ulteriori informazioni per lo screening di combinazioni di farmaci con potenti effetti antinfiammatori e dimostra l'affidabilità della strategia di screening in silico.

Discussione

La neuroinfiammazione è implicata nella maggior parte delle malattie neurologiche, psichiatriche e del neurosviluppo poiché non è solo una conseguenza, ma potrebbe essere un fattore scatenante della patologia6!. Tuttavia, gli attuali trattamenti per neuroinfiammatori sono principalmente monoterapie, limitate da noti effetti collaterali come sappiamo. Gli inibitori della COX-2 possono portare a difetti cardiovascolari che rispondono al trattamento a lungo termine e il trattamento mirato al TNF potrebbe causare infezioni attraverso l'immunosoppressione62. Gli approcci terapeutici combinatori possono essere indispensabili per migliorare il trattamento di malattie complesse con i seguenti vantaggi: la robustezza della rete contrastata e la compensazione del bypass. la maggiore efficacia clinica pur mantenendo una tossicità umana minima e il dosaggio ridotto di ciascun composto63. Tuttavia, l'esplorazione delle combinazioni sinergiche di farmaci tra composti derivati ​​da medicinali a base di erbe basati sulla farmacologia di sistema è poco limitata dal possibile motivo principale di grandi quantità di composti.

In the work, we firstly gain 63 potential bioactive compounds from the herb Cistanche tubulosa, fulfilling the criteria (DL>0.18) per ulteriori analisi con l'ausilio della previsione indispensabile per escludere molecole più promettenti con proprietà desiderabili. Dopo aver mappato i 133 bersagli dei 63 potenziali composti bioattivi nel database, otteniamo 43 bersagli correlati alla neuroinfiammazione e quindi l'analisi del clustering GOBP dei bersagli previsti può probabilmente contribuire al trattamento della neuroinfiammazione. Il risultato analitico della rete CT ha mostrato un grado medio per composto di 11.209 e 7.651 per target, rispettivamente, e 38 di essi regolano più di 7 target (maggiore del grado medio). Ad esempio, l'echinacoside (mol41)4- previsto con 7 target, il verbascoside (mol33)3067 con 9 target o il tubuloside B(mol57)686 con 8 target potrebbero svolgere ruoli chiave nella neuroprotezione in linea con la crescente letteratura.

Raggiungiamo obiettivi terapeutici diretti come APP, MAPT (noto anche come Tau), PPARG70, MMP9, MMP27172 e HTR2A (noto anche come 5- HT2A), GRIN2B (subunità 2B del recettore ionotropico del glutammato NMDA) e GRIA1 ( subunità 1) del recettore ionotropico del glutammato AMPA o potenziali bersagli a valle come PTGS274 o NOS27 che sono associati a neuroinfiammazione o varie malattie del sistema nervoso,

L'analisi della rete Compound-Target-Pathway mostra 12 composti dalle prime 10 coppie di farmaci attraverso l'algoritmo PEA, collegati con i 43 potenziali bersagli e le vie legate alla neuroinfiammazione, ad esempio, via di segnalazione del calcio, interazione ligando-recettore neuroattivo o Via di segnalazione del TNF e così via. Nel sistema, questi composti previsti potrebbero agire non solo sulle proteine ​​a monte ma anche a valle dei percorsi associati alla neuroinfiammazione e ai biomarcatori infiammatori. in particolare, vengono inoltre fornite le informazioni aggiuntive per lo screening di combinazioni di farmaci con potenziali effetti antinfiammatori e l'affidabilità della strategia di screening in silico viene verificata mediante validazione sperimentale. La via della neuroinfiammazione comprende la via del morbo di Alzheimer, la via di segnalazione del calcio, la via di segnalazione del GnRH, la via di segnalazione del VEGF e la sinapsi serotoninergica. I risultati analitici ci hanno spiegato chiaramente che i moduli di morte cellulare, infiammazione e neuroprotezione sono esemplificati per decifrare il meccanismo di Cistanche tubulosa per il trattamento della neuroinfiammazione.

La neuroinfiammazione accompagna varie malattie neurodegenerative che potrebbero essere non solo una conseguenza ma anche un fattore scatenante di patologia, quindi si suggerisce che le terapie antinfiammatorie siano un approccio terapeutico promettente!. Con nostra delusione, sebbene ci siamo resi conto della limitazione delle monoterapie, la valutazione ei meccanismi alla base delle terapie combinate sono ancora le principali sfide nello sviluppo della nuova strategia alternativa. Questo lavoro quindi potrebbe offrire nuove opportunità terapeutiche per la neuroinfiammazione e potrebbe aprire una nuova strada per scoprire combinazioni di farmaci da prodotti naturali.

Materiali e metodi

Collezione di composti.

Un totale di 66 ingredienti chimici di Cistanche tubulosa sono raccolti manualmente da TCMSP (http://lsp.nwuedu.cn/)6, inclusi 26 glicosidi feniletanoidi, 22 iridoidi,4lignani, 7 glicosidi monoterpenici,2 sostanze azotate, 3 benzene zuccheri acrilici, 1 sterolo, 1 chetolo. Dato che i glicosidi in Cistanche tubulosa sono solitamente idrolizzati per liberare l'aglicone che viene poi assorbito nella mucosa intestinale, quindi, prendiamo in considerazione le molecole senza glicolico, che sono etichettate come qt. Ciò ha portato alla generazione dei 103 composti. Queste molecole sono fornite nella tabella supplementare S1.

Valutazione della somiglianza con i farmaci. Per ottenere i potenziali composti bioattivi da Cistanche tubulosa, valutiamo la somiglianza con i farmaci di questi ingredienti calcolando la somiglianza di Tanimoto77 tra i composti vegetali e le proprietà molecolari medie di tutte le sostanze chimiche nel database di Drugbank8. Inoltre, il modello di previsione DL è stato applicato con successo in molti studi98 per selezionare composti bioattivi. Nel lavoro, l'indice DL Maggiore o uguale a 0.18 dei candidati è definito come il valore di soglia per adattarsi meglio all'analisi successiva.

Previsione dell'obiettivo del farmaco.

L'identificazione degli obiettivi di efficacia per i composti principali rimane un passaggio chiave per far progredire i composti nello sviluppo di farmaci. Qui, due strumenti interni: SysDT e WES vengono eseguiti per ricavare le informazioni sul bersaglio molecolare per la pesca della droga. Sys DT è un modello in silio che viene eseguito combinando le informazioni chimiche, genomiche e farmacologiche basate su due potenti strumenti matematici: Random Forest (RF) e Support Vector Machine (SVM) per affrontare efficacemente il problema dell'identificazione del bersaglio2. Il modello ottenuto è servito come una preziosa piattaforma per la previsione delle interazioni farmaco-bersaglio con un'accuratezza complessiva del 97,3 percento, un'accuratezza di previsione attivata dell'87,7 percento e un'accuratezza di previsione inibita del 99,8 percento. Al fine di acquisire componenti più promettenti, il i criteri di filtraggio sono definiti come valore RF maggiore o uguale a 0.7 o SVM maggiore o uguale a 0.8 in questo studio.

La somiglianza ponderata dell'insieme (WES) è un nuovo potente modello computazionale per individuare gli obiettivi diretti del farmaco degli effettivi ingredienti bioattivi. Come nuovo strumento, il modello ottenuto si comporta bene nel predire il legame con una sensibilità media dell'85 percento (SEN) e i modelli non vincolanti con il 71 percento (SPE) con le aree medie sotto le curve operative del ricevitore (ROC, AUC) dell'85,2 per cento e una concordanza media del 77,5 per cento. I target ottenuti vengono ulteriormente mappati su Uniprot (http://www,uniprot.org) per normalizzare successivamente i loro nomi e organismi. Qui, scegliamo solo i bersagli dell'Homo sapiens per ulteriori analisi. I bersagli candidati dei composti selezionati vengono mappati sul database CTD (http://ctdbase.org/) per ottenere le loro malattie correlate e infine selezioniamo i potenziali bersagli correlati alla neuroinfiammazione.

GO arricchimento e analisi per obiettivi. Per sondare i processi biologici coinvolti dei bersagli ottenuti, mappiamo i bersagli a DAVID(http://david.abcc.ncifcrf.gov)8 e i termini con valore P inferiore a 0.05 sono scelti in questa sezione.

Analisi della combinazione di farmaci.

Nel nostro lavoro precedente, è stato sfruttato un framework di farmacologia di sistema per prevedere le combinazioni di farmaci su un modello di nuova concezione, denominato Probability Ensemble Approach (PEA) con lo scopo di analizzare l'efficacia clinica e gli effetti avversi delle combinazioni di farmaci. In dettaglio, è stata sviluppata una rete bayesiana che si integra con un algoritmo di similarità per modellare le combinazioni di effetti molecolari e farmacologici composti. È stata quindi presentata la valutazione combinata che coyered l'efficacia clinica e gli effetti avversi per le coppie previste26. In breve, mostra che la PEA potrebbe prevedere l'efficacia delle coppie con elevata specificità e sensibilità (AUC=0.90) nel nostro lavoro. In questo lavoro, selezioniamo le prime dieci combinazioni di farmaci in base alle loro probabilità di sinergia, che rappresentano la possibilità di indurre sinergia tra due composti.

Costruzione e analisi di reti/percorsi.

Per studiare le relazioni tra i principi attivi e le malattie infiammatorie, Cytoscape 2.8.1, un popolare pacchetto di bioinformatica per la visualizzazione di reti biologiche e l'integrazione dei dati, genera la rete del target composto (CT) e la rete del percorso del target composto (CTP). Le proprietà quantitative della rete sono analizzate dai due seguenti plugin Network Analyzer e CentiScaPe 1.2. Nella rete grafica, i nodi indicano composti, bersagli o percorsi mentre i bordi codificano l'interazione farmaco-bersaglio. Per esplorare ulteriormente gli effetti biologici di come funzionano i bersagli cellulari attraverso la modulazione di molteplici percorsi metabolici e il "percorso" incorporato viene assemblato secondo le informazioni aggiornate sulla patologia neuroinfiammatoria. In primo luogo, mappandoli sul database KEGG (http://www.genome.jp/kegg/), i profili target raggiunti vengono aggregati in diversi percorsi. Dopo aver abbandonato le sezioni indirette, quindi, un percorso relativamente sintetizzato viene integrato manualmente sulla base dei dati patologici e clinici.

Convalida sperimentale

Preparazione campioni.

Echinacoside, verbascoside, isoacteoside e 2'-acetylacteoside vengono acquistati da Nanjing Zelang Biological Technology Co., Ltd. (Nanchino, Jiangsu, Cina). I campioni del test vengono sciolti in dimetilsolfossido (DMSO)(Sigma, USA) per ottenere 100 mM, come soluzione madre, e quindi conservati a 4°C. Le diluizioni finali del DMSO aggiunto al mezzo di coltura non hanno mai superato 0,1 percentuale che ha assicurato che non vi è alcun effetto sulla vitalità cellulare.

Coltura cellulare. Le cellule della microglia del topo BV2 sono originariamente sviluppate dalla banca cellulare dell'Accademia cinese delle scienze di Shanghai e coltivate in flaconi da 25 o 75 cm2 con il mezzo dell'Aquila modificato di Dulbecco (DMEM/25 mM HEPES) (Gibco BRL, USA) integrato con il 10 percento di siero bovino fetale (FBS) ( Gibco BRL, USA), penicillina G (100 unità/mL) e streptomicina (100 mg/mL) in un'incubatrice umidificata con 5% CO,/95% O, a 37 gradi 0,5% CO2.

Analisi Western blot. La proteina cellulare viene estratta dalle linee cellulari utilizzando un kit di preparazione proteica QproteomeMammalian (Qiagen, Germania) dopo le procedure indicate in conformità con il protocollo del produttore. Quick Stari Bradford Protein Assay Kit (Bio-Rad, USA) viene applicato alla quantificazione delle proteine. Quantità equivalenti di proteine ​​(50ug) vengono denaturate facendo bollire a 100 gradi per 10 minuti con 2*laemmli sample loading buffer (Bio-Rad, USA)più 5% 3-mercaptoetanolo in un rapporto di 1:1 e caricato per corsia su SDS-PAGE al 12% (mini gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide), elettrotrasferito su membrane di fluoruro di polivinilidene da 0,45 um (PDVF) (Millipore, Bedford, MA, USA) per 150 minuti a 200 mA. Successivamente, le membrane vengono bloccate in albumina di siero bovino (BSA) al 3% a temperatura ambiente e incubate con gli anticorpi primari iNOS e COX-2 (Abcam) a 4 gradi durante la notte. Dopo tre lavaggi approfonditi in Tween salino tamponato con Tris (TBST) ciascuno per 5 minuti, le membrane vengono sondate con anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano (HRP) (diluizioni 1:10000; Abcam) per 1,5 ore a temperatura ambiente. Le bande immunoreattive vengono quindi visualizzate utilizzando un kit di rilevamento della chemiluminescenza ECL (Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, USA) dopo il lavaggio due volte in TBST e una volta in TBS, ogni volta per 5 min. I valori densitometrici sono normalizzati utilizzando -actin come controllo interno di caricamento.

Analisi statistica. I dati sono presentati come media ± errore standard, l'analisi Western blot viene ripetuta per tre esperimenti indipendenti con lo stesso risultato. L'analisi della varianza unidirezionale viene utilizzata per confrontare le differenze di media per tre o più gruppi, la significatività statistica viene analizzata con il test Studenti tra due gruppi. Dotazioni e allestimenti. Excel di Microsoft Office2013 è stato utilizzato in Fig.1.

Cytoscape 2.8.1 è stato utilizzato in Fig.2. Cytoscape 2.8.1 è stato utilizzato in Fig.3.

Visio di Microsoft Office2013 è stato utilizzato in Fig. 4.

Graphpad Prism 6 e Visio di Microsoft Office2013 sono stati utilizzati in Fig.5.

Disponibilità dei dati. I set di dati generati durante e/o analizzati durante lo studio in corso sono disponibili presso l'autore corrispondente su ragionevole richiesta.

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Ringraziamenti la ricerca è supportata finanziariamente dalla National Natural Science Foundation of China (NO. U1603285, NO. 81373892 e NO. 31540008) e l'industrializzazione del progetto pilota nel Dipartimento dell'Istruzione della provincia dello Shaanxi: industrializzazione di additivi per mangimi per fermentazione di microrganismi verdi e privi di inquinamento (N. 2010JC22).

Contributi dell'autore

Contributi dell'autore alla concezione e alla progettazione: JLL, YHW e CLZ hanno ideato e progettato lo studio. Previsione dei target dei farmaci e arricchimento e analisi dei GO per i target: XTC e ZHQ Analisi della combinazione di farmaci e costruzione e analisi di reti/percorsi: JLZ, ZHQ, FXS e JJL Esperimenti e acquisizione di dati JLZ, JX e ZHQ Analisi e interpretazione dei dati JLZ , JX, ZYW e WX Redazione del manoscritto: JLZ e CLZA hanno approvato la versione finale del manoscritto presentato: J.LL, CL.Z. e YH.W. Revised by CLZ, JLZ e XGL

Informazioni aggiuntive

Informazioni supplementari accompagnano questo documento all'indirizzo https://doi.org/10.1038/s41598-017-16571-3. Interessi in competizione: gli autori dichiarano di non avere interessi in competizione.

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